鄧見田燁，晏美紅，尚鉑昊，李亦龍，肖 田，朱洺志,3,4, ，王坤波,3,4,

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)茶學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128；2.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)國家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南長沙 410128；3.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物功能成分利用省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，湖南長沙 410128；4.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部園藝作物基因資源評(píng)價(jià)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南長沙 410128）

黑茶是我國特有的后發(fā)酵茶，是中國最具特色的茶類之一[1-2]。近年來由于其降脂減肥、調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝等多種健康益處而備受人們關(guān)注。隨著黑茶中具有保健養(yǎng)生作用的功能成分被不斷挖掘，黑茶已不僅限于邊銷或僑銷，正在向外銷市場(chǎng)擴(kuò)張，出口東南亞、日本等地區(qū)[3-4]。黑茶產(chǎn)區(qū)廣，可因特殊制作工藝與不同產(chǎn)地分成許多不同種類：茯磚茶、天尖、六堡茶、黑磚、藏茶等[5]。

由于原料、產(chǎn)地以及制作工藝等諸多因素影響，不同黑茶種類形成了各種獨(dú)特的香氣品質(zhì)特征。天尖和六堡茶是簍裝散茶的一類。天尖由特級(jí)、一級(jí)黑毛茶加工制得，通常帶有松煙香[6]。六堡茶常以檳榔香和松煙香聞名[7-8]。茯磚茶和黑磚屬于磚形緊壓黑茶。茯磚茶磚塊內(nèi)布滿冠突散囊菌，俗稱“金花”，“發(fā)花”這一獨(dú)特工序賦予茯磚茶獨(dú)特的菌花香[9-10]。黑磚香氣純正帶有松煙香[11]。藏茶主要產(chǎn)于四川省，由于暢銷青藏高原地區(qū)而得名[12-13]。藏茶主要香氣類型是陳香[14-15]。

目前針對(duì)茶葉香氣成分提取的方法主要包括液-液萃取、減壓蒸餾萃取、攪拌棒吸附萃取、水蒸氣蒸餾法、同時(shí)蒸餾萃取法、超臨界流體萃取法和固相微萃取法（Solid phase micro-extraction，SPME）等[16-17]。其中，固相微萃取中最常用的頂空固相微萃?。℉eadspace solid phase micro-extraction，HS-SPME）法操作簡(jiǎn)單，設(shè)備要求低，常用于提取揮發(fā)性、半揮發(fā)性有機(jī)物。該方法無需溶劑、集采樣、萃取與濃縮為一體；同時(shí)，此方法對(duì)于熱敏性成分提取較充分，且無有機(jī)試劑的干擾，香氣還原度較好。因此，頂空固相微萃?。℉S-SPME）法是提取茶葉香氣成分較為常用的技術(shù)。

香氣是決定茶葉品質(zhì)最重要的關(guān)鍵因素之一，然而，目前關(guān)于黑茶香氣的研究較多關(guān)注于單一產(chǎn)地或同種類間的比較，關(guān)于不同產(chǎn)地多種類黑茶間香氣成分差異的相關(guān)報(bào)道較少。本文采用頂空固相微萃取和氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（HS-SPME-GC-MS）技術(shù)對(duì)5 個(gè)不同種類黑茶樣品進(jìn)行香氣成分檢測(cè)分析，明確各不同種類黑茶香氣成分組成差異，可為后期黑茶香氣機(jī)理研究以及品質(zhì)創(chuàng)新等提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黑茶 收于各地區(qū)，均使用錫箔袋密封保存于實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中；藏茶 產(chǎn)于四川省雅安市，2016 年；茯磚茶 產(chǎn)于湖南省益陽市，2016 年；天尖 產(chǎn)于湖南省益陽市，2016 年；黑磚 產(chǎn)于浙江省金華市，2016 年；六堡茶 產(chǎn)于廣西省梧州市，2016年；56 種香氣標(biāo)準(zhǔn)品 購于東京化成工業(yè)株式會(huì)社、美國Sigma、北京百靈威科技有限公司等。

7890B-7000C 氣相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 美國Agilent 公司；75 μm CAR/PDMS SPME 固相微萃取手動(dòng)進(jìn)樣手柄和萃取頭 美國Supelco 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 感官審評(píng) 感官審評(píng)參照Li 等[18]的研究方法，審評(píng)人員由8 名專業(yè)人員組成。

1.2.2 固相微萃取法 精確稱取1 g 磨碎茶樣于15 mL 萃取小瓶中，加入轉(zhuǎn)子，再加5 mL 100 ℃蒸餾水，在80 ℃恒溫水浴條件下以轉(zhuǎn)速600 r/min 萃取吸附60 min，GC-MS 解析10 min。

1.2.3 GC-MS 分析條件 GC 條件：色譜柱DB-WAX（30 m×250 μm×0.25 μm），進(jìn)樣口溫度240 ℃，載氣為氦氣（純度＞99.999%），柱流量為1 mL/min，分流比10∶1；升溫程序?yàn)椋?5 ℃保持5 min，以2 ℃/min的速度升到100 ℃，保持1 min；再以5 ℃/min 的速度升溫至240 ℃，保持2 min。MS 條件：離子源溫度230 ℃，接口溫度240 ℃，電離方式EI，電子能量70 eV，電子倍增器電壓：1161 V，全掃描模式（Scan）下的質(zhì)量掃描范圍35～550 u。

1.2.4 定性定量方法 通過計(jì)算機(jī)檢索與NIST05s.LIB 質(zhì)譜庫提供的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行對(duì)照，以匹配度大于80%為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)保留指數(shù)計(jì)算公式，結(jié)合保留時(shí)間求出各被測(cè)組分的保留指數(shù)（Retention index，RI），保留指數(shù)計(jì)算公式[19]如公式（1）所示。通過文獻(xiàn)以及數(shù)據(jù)庫的保留指數(shù)進(jìn)行鑒定；將待測(cè)物質(zhì)的特征離子以及RI 與標(biāo)準(zhǔn)品比較進(jìn)行定性。結(jié)合各色譜峰的峰面積進(jìn)行香氣相對(duì)含量分析，并根據(jù)檢測(cè)出的各香氣成分峰面積與內(nèi)標(biāo)（己酸乙酯）峰面積的比值進(jìn)行相對(duì)定量。具體方法參照李永迪的研究方法[20]。

式中：RI 為待測(cè)物質(zhì)保留指數(shù)；n 表示待測(cè)物質(zhì)的碳數(shù)；RT（x）為待測(cè)物質(zhì)的保留時(shí)間；RT（n）為待測(cè)物質(zhì)流出前正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間；RT（n+1）為待測(cè)物質(zhì)流出后正構(gòu)烷烴的保留時(shí)間。

1.2.5 香氣活性值（Odor activity value，OAV）計(jì)算OAV 為某香氣成分的質(zhì)量濃度與其氣味閾值的比值[21-22]，OAV 計(jì)算公式如公式（2）所示。

式中：C 為香氣成分的質(zhì)量濃度，μg/L；OT 為該香氣成分的氣味閾值，μg/L。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)測(cè)定3 次。采用Excel 2019軟件進(jìn)行各樣品香氣成分的數(shù)據(jù)分析；采用Origin 2021 軟件制作柱狀圖和雷達(dá)圖；采用TBtools 軟件制作熱圖；采用SIMCA-P 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析（PCA）、層序聚類分析（HCA）、偏最小二乘判別分析（PLS-DA）和計(jì)算預(yù)測(cè)變量重要性投影（VIP）；采用SPSS 27 數(shù)據(jù)處理軟件（IBM）進(jìn)行單因素方差分析（ANOVA）中的最小顯著差異法檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同種類黑茶的感官審評(píng)結(jié)果分析

不同種類黑茶的感官審評(píng)結(jié)果如表1 所示，感官審評(píng)綜合得分為藏茶（91.35）＞茯磚茶（90.15）＞黑磚（89.05）＞六堡茶（88.85）＞天尖（86.33）。五種黑茶在湯色、滋味以及葉底等方面的差異較小；藏茶、茯磚茶、黑磚的外形相對(duì)較好。根據(jù)感官審評(píng)結(jié)果（表1）中香氣部分的審評(píng)結(jié)果，將不同種類黑茶的香氣特征制成雷達(dá)圖（圖1），雷達(dá)圖的數(shù)值表示黑茶樣品的某一香氣特征分值，分值越高表示黑茶樣品的某一香氣特征越明顯。結(jié)果顯示，不同種類黑茶的香氣特征差異較大，藏茶具有持久的陳香，茯磚茶有明顯的菌花香，稍帶陳香，黑磚香氣純正，六堡茶具有明顯持久的檳榔香與陳香，天尖具有持久的松煙香，所有茶樣均稍帶木香。

圖1 黑茶感官審評(píng)雷達(dá)圖Fig.1 Radar map of sensory evaluation of dark tea

表1 黑茶樣品的感官審評(píng)結(jié)果Table 1 Results of sensory evaluation of dark tea products

2.2 不同種類黑茶的香氣成分分析

為進(jìn)一步分析不同種類黑茶產(chǎn)生不同香型的原因，利用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)這5 個(gè)黑茶樣品的香氣成分及含量進(jìn)行分析鑒定。由表2 可知，在五種黑茶中共檢測(cè)到56 個(gè)香氣成分。根據(jù)化合物主要官能團(tuán)的不同將檢測(cè)到的香氣成分分為7 大類，其中，酮類化合物和醛類化合物最多，均為15 種，醇類化合物11 種，酯類化合物5 種，雜氧化合物5 種，碳?xì)浠衔? 種及酚類化合物2 種。

表2 不同種類黑茶的香氣成分定性分析與香氣含量Table 2 Qualitative analysis and aroma content of different types of dark tea

續(xù)表2

結(jié)果顯示，不同種類黑茶在香氣成分的構(gòu)成與含量上都有差異。五種黑茶樣品的香氣成分總含量排序?yàn)檐虼u茶（6355.30 μg/L）＞藏茶（5858.73 μg/L）＞藏黑磚（5789.71 μg/L）＞藏天尖（4801.37 μg/L）＞藏六堡茶（3740.14 μg/L）。各樣品的香氣成分含量較多的種類為醛類化合物、酮類化合物、醇類化合物和酯類化合物。酮類化合物和醇類化合物多體現(xiàn)為花果香，醛類化合物多體現(xiàn)為青草香和花果香，這些化合物通常給予茶葉美好的香氣[23]。茯磚茶中的醛類化合物、酮類化合物和醇類化合物的含量均為最高，茯磚茶的菌花香應(yīng)與這三類化合物密切相關(guān)。在藏茶和茯磚茶中含量較高的1,2,3-三甲氧基苯和1,2,4-三甲氧基苯等雜氧化合物則會(huì)賦予茶葉陳香的香氣品質(zhì)。有些香氣成分是某些種類黑茶特有的，如：檸檬醛I 在藏茶、茯磚茶和黑磚中檢測(cè)出；3,4,5-三甲氧基甲苯和順-茉莉酮在茯磚茶、六堡茶、藏茶和天尖中檢測(cè)出；棕櫚酸甲酯只在黑磚、六堡茶和天尖中檢測(cè)出，2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚只在茯磚茶中檢測(cè)出。總之，由于不同種類黑茶的原料、加工工藝以及制作環(huán)境等因素的影響，不同種類黑茶的香氣成分存在著較大差異。

不同香氣成分在不同種類的黑茶間相對(duì)含量差異顯著。由圖2a 可知，五種黑茶的香氣成分構(gòu)成、化合物總數(shù)量和每類化合物間化合物數(shù)量差異不大，但由圖2b 可知，不同種類黑茶間的香氣成分相對(duì)含量差異顯著，所有茶樣中香氣成分質(zhì)量濃度較高的酯類化合物、醇類化合物、醛類化合物以及酮類化合物，總相對(duì)含量達(dá)到90%以上。藏茶、黑磚和天尖中香氣成分質(zhì)量濃度最高的是酯類化合物，分別含有2325.55、2628.10、2132.88 μg/L；占各樣品香氣成分總含量39.69%、45.39%、44.42%。茯磚茶和六堡茶中醇類化合物成分質(zhì)量濃度最高，分別含有1939.81、1492.62 μg/L，其相對(duì)含量為30.52%和39.91%。藏茶、茯磚茶、黑磚、六堡茶、天尖中質(zhì)量濃度含量最高的香氣成分均為二氫獼猴桃內(nèi)酯，質(zhì)量濃度分別為2298.04、1290.95、2583.62、1299.50、2102.33 μg/L；占各樣品香氣成分總含量的39.22%、20.31%、44.62%、34.74%、43.79%。這些香氣成分相互影響、共同作用形成黑茶特殊的香氣品質(zhì)。

圖2 不同種類黑茶香氣成分含量比較Fig.2 Comparison of aroma components in different types of dark tea

2.3 多組分化學(xué)計(jì)量學(xué)

OAV 是結(jié)合香氣成分的含量和氣味閾值，對(duì)各香氣成分在樣品的香氣貢獻(xiàn)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)的方法[24-26]。通常認(rèn)為OAV＞1 的香氣成分對(duì)茶葉香氣形成有貢獻(xiàn)，OAV＞10，則對(duì)茶葉香氣形成有顯著影響[27-28]。參照文獻(xiàn)[20,23,25,29]中香氣成分在水中的閾值計(jì)算出各香氣成分的OAV，并記錄文獻(xiàn)所描述香氣成分的香氣特征。結(jié)果表明（表3），有31 種香氣成分OAV＞1，即有31 種香氣成分對(duì)黑茶的香氣形成有貢獻(xiàn)。這些香氣成分類型主要為醛類化合物和醇類化合物。

表3 不同種類黑茶香氣成分OAV 和香氣描述Table 3 OAV and aroma attributes of aroma components in different types of dark tea

續(xù)表3

藏茶中，有27 種香氣成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香氣成分有10 種，1,2,3-三甲氧基苯對(duì)藏茶香氣具有突出貢獻(xiàn)。茯磚茶中香氣成分OAV＞1 的有30 種，其中OAV＞10 的有12 種，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、檸檬醛I、檸檬醛II 和正己醛等醛類化合物以及水楊酸甲酯對(duì)茯磚茶的菌花香具有突出貢獻(xiàn)，而1,2,3-三甲氧基苯則對(duì)茯磚茶的陳香具有突出貢獻(xiàn)。黑磚中香氣成分OAV＞1 的有25種，其中OAV＞10 的香氣成分有11 種，苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香氣成分的綜合作用形成了黑磚純正的香氣。在六堡茶中有22 種香氣成分OAV＞1，其中OAV＞10 的香氣成分有9 種，（+）-雪松醇對(duì)六堡茶的檳榔香具有突出貢獻(xiàn)。天尖中，香氣成分OAV＞1 有25 種，其中OAV＞10 的香氣成分有10 種，反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛和正己醛等醛類化合物和植醇等醇類化合物對(duì)天尖的松煙香有突出貢獻(xiàn)。這與黃林杰[8]、蔣容港[26]和張婷等[30]的研究結(jié)果相一致。綜上所述，不同種類黑茶的特征香氣形成的呈香香氣成分均有所不同，同一香氣成分對(duì)不同種類黑茶的香氣形成也有不同貢獻(xiàn)。

為研究不同種類黑茶中顯著差異的香氣成分，將五組茶樣的56 種香氣組分進(jìn)行PCA，HCA 和PLS-DA 分析，并且結(jié)合OAV，研究不同種類黑茶中香氣成分組成的差異及呈香香氣成分的差異。PCA和HCA 分析表明（圖3a、圖3b），五種黑茶可明顯分為5 組，表明5 組樣品間香氣成分組成具有顯著差異?；赑CA 和HCA 結(jié)果，構(gòu)建了PLS-DA 模型（圖3c），擬合參數(shù)R2X=0.991、Q2=0.998，置換檢驗(yàn)?zāi)Ｐ停▓D3d）R2=0.0507、Q2=-0.672，Q2回歸線與縱軸的相交點(diǎn)小于零，表明該判別模型有較好的解釋能力，且不存在過擬合現(xiàn)象，模型驗(yàn)證有效。

根據(jù)PLS-DA 模型，利用VIP＞1 且P＜0.05，共篩選出12 種差異香氣成分，分別為反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、α-松油醇、橙花叔醇II、芳樟醇、順式-3-己烯-1-醇、3,4-二甲氧基甲苯、2-正戊基呋喃、順-茉莉酮以及4-仲丁基苯酚，將12 種差異香氣成分含量制成熱圖（圖4）。其中，有7 種差異香氣成分OAV＞1，分別是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

圖4 差異香氣成分熱圖Fig.4 Heatmap of the differential aroma components

3 結(jié)論

本研究采用感官審評(píng)對(duì)茯磚茶、黑磚、藏茶、六堡茶和天尖這五個(gè)不同種類黑茶進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示：藏茶具有持久的陳香，茯磚茶有明顯的菌花香，帶陳香，黑磚香氣純正，六堡茶具有明顯持久的檳榔香與陳香，天尖具有持久的松煙香。

采用HS-SPME-GC-MS 技術(shù)對(duì)這五個(gè)不同種類黑茶的香氣成分進(jìn)行定性定量檢測(cè)分析。結(jié)果表明，不同種類黑茶的香氣成分在種類、數(shù)量以及相對(duì)含量均存在差異。五種黑茶中共檢測(cè)出56 個(gè)香氣成分。對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行OAV 分析并結(jié)合感官審評(píng)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有陳香香氣特征的1,2,3-三甲氧基苯對(duì)藏茶的陳香具有突出貢獻(xiàn)，可能是藏茶的陳香最為突出持久的主要原因。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、檸檬醛I、檸檬醛II、正己醛和水楊酸甲酯對(duì)茯磚茶的菌花香具有突出貢獻(xiàn)，而1,2,3-三甲氧基苯對(duì)茯磚茶的陳香具有突出貢獻(xiàn)。反,反-2,4-癸二烯醛、反,反-2,4-壬二烯醛、正己醛和植醇等對(duì)天尖的松煙香有突出貢獻(xiàn)。苯乙醇、橙花叔醇II 和氧化芳樟醇I 等香氣成分綜合作用形成了黑磚純正的香氣。這些香氣成分相互作用、相互影響，共同形成了黑茶的特殊香氣品質(zhì)?；赩IP＞1 且P＜0.05，篩選出12 種含量差異達(dá)到顯著水平的香氣成分，結(jié)合OAV 值，在其中篩選出7 種差異性黑茶呈香香氣成分，分別是：反-2-己烯醛、反-2-壬烯醛、反,反-2,4-庚二烯醛、反,反-2,4-癸二烯醛、橙花叔醇II、芳樟醇以及2-正戊基呋喃。

以上結(jié)果揭示了不同種類黑茶的風(fēng)味特征及主要香氣成分，為深入認(rèn)識(shí)不同種類黑茶香氣特征提供了數(shù)據(jù)參考。未來還可采用GC-O-MS、香氣重組、智能感官等方法對(duì)各香氣成分的協(xié)同作用進(jìn)行深入研究。