陳 宇，曹詩(shī)諾，沈乙杰，李 暢，杜 建，王豐俊,

（1.北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.阿克蘇浙疆果業(yè)有限公司，新疆阿克蘇 843000）

核桃是我國(guó)主要農(nóng)產(chǎn)品之一，2020 年我國(guó)核桃產(chǎn)量達(dá)到479.59 萬(wàn)噸，居世界首位[1]。核桃分離蛋白（walnut protein isolate，WPI）是制備核桃油脂的副產(chǎn)物，但因?yàn)槠淙芙庑暂^低，通常被用做生產(chǎn)經(jīng)濟(jì)價(jià)值較低的飼料、肥料和其他材料，應(yīng)用非常有限[2]，但是核桃分離蛋白營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，具有巨大發(fā)展?jié)摿3]。

為了提高WPI 的溶解度，改善蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能特性，增加其加工利用度，需要對(duì)WPI 進(jìn)行改性處理。常見的物理改性方法效果不明顯，酶解改性利用不同類型的酶使蛋白質(zhì)適度、精準(zhǔn)水解，雖然酶法改性反應(yīng)條件溫和、副反應(yīng)較少，但是酶法反應(yīng)條件苛刻，生物酶價(jià)格較高導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)成本較高，另外會(huì)產(chǎn)生令人不愉快的風(fēng)味物質(zhì)。化學(xué)改性操作簡(jiǎn)單效果明顯，但可能會(huì)因?yàn)榛瘜W(xué)物質(zhì)的添加產(chǎn)生新的安全問(wèn)題[4]，而糖基化改性不同于一般的化學(xué)改性，該反應(yīng)在控制糖蛋白比例、加熱溫度、濕度以及反應(yīng)時(shí)間等條件下即可進(jìn)行，不需要添加額外的化學(xué)試劑，反應(yīng)過(guò)程溫和，安全性高[5-6]。糖基化主要是還原糖鏈上的羰基與蛋白分子上的氨基發(fā)生羰氨縮合，形成較為穩(wěn)定的蛋白質(zhì)-糖共軛物。糖基化改性后的蛋白質(zhì)結(jié)合了天然蛋白大分子特性及多糖的親水特性，功能特性得到明顯改善[7-8]。研究表明糖基化改性可使花生蛋白[9]、豌豆蛋白[10]、苦杏仁蛋白[11]、小麥蛋白[12]、大豆蛋白[13]等蛋白質(zhì)的功能特性和營(yíng)養(yǎng)性均得到明顯的改善。但目前對(duì)糖基化改性WPI 的研究較少。

本研究以WPI 為主要原料，選用具有調(diào)節(jié)腸道微生態(tài)、降血糖、降血脂等功能的菊粉[14]，用糖基化改性的方法研究蛋白與糖質(zhì)量比、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)WPI 溶解度的影響，通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)與響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)確定最優(yōu)的核桃分離蛋白-菊粉共軛物，即菊粉改性蛋白（Inulin modified protein，IMP）的制備工藝，對(duì)糖基化改性蛋白的結(jié)構(gòu)特性及功能特性進(jìn)行研究，以期獲得高溶解的核桃蛋白，提高WPI 的利用率，為WPI 的精深加工利用提供有力支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃分離蛋白（87%） 實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)制備[15]；菊粉 食品級(jí)，上海鑫泰實(shí)業(yè)有限公司；鄰苯二甲醛、考馬斯亮藍(lán)G-250、20%十二烷基硫酸鈉溶劑鈉、牛血清蛋白 分析純，北京藍(lán)弋科技有限公司；β-巰基乙醇 分析純，北京津同樂(lè)泰化工產(chǎn)品有限公司；其他試劑 均為分析純。

LGJ-12 型真空冷凍干燥機(jī) 北京松源華興科技發(fā)展有限公司；524G 型磁力攪拌器 上海梅穎浦儀器儀表制造有限公司；GL20G-II 型冷凍離心機(jī) 上海安亭儀器有限公司；L6 型紫外可見分光光度計(jì)上海儀電分析儀器有限公司；FM-200A 型高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克科發(fā)展有限公司；VERTEX70型傅里葉紅外光譜儀 德國(guó)Bruker 公司；GeminiSEM 300 型掃描電子顯微鏡 德國(guó)蔡司公司；FLS1000 型熒光分光光度計(jì) 英國(guó)愛(ài)丁堡儀器公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 WPI-菊粉共軛物（Inulin modified protein，IMP）的制備 稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 離子水中，于25 ℃室溫下攪拌1 h，以不同比例加入一定量的菊粉混合均勻后，使用恒溫磁力攪拌器，在不同的時(shí)間、溫度條件下，反應(yīng)結(jié)束后立即用冰浴處理，使其快速冷卻至室溫，使用高速冷凍離心機(jī)設(shè)置轉(zhuǎn)速8000 r/min，離心時(shí)間10 min，將上清液于-4 ℃條件下置于食品級(jí)雙層透析袋中（60 mm×70 mm×0.22 mm）透析24 h 后冷凍干燥制得IMP。同時(shí)以未處理的WPI 和相同條件下只加熱處理的核桃分離蛋白（Heat treated walnut protein isolate，H-WPI）為對(duì)照。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 不同反應(yīng)溫度條件下制備IMP 準(zhǔn)確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應(yīng)時(shí)間60 min、pH7.0、WPI 與菊粉質(zhì)量比1:1 的條件下，以溶解度為指標(biāo)，考察反應(yīng)溫度在50、60、70、80、90、100 ℃條件下對(duì)IMP 溶解度的影響。

1.2.2.2 不同反應(yīng)時(shí)間條件下制備IMP 準(zhǔn)確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應(yīng)溫度90 ℃、pH7.0、WPI 與菊粉質(zhì)量比1:1 的條件下，以溶解度為指標(biāo)，考察反應(yīng)時(shí)間在20、40、60、80、100、120 min 條件下對(duì)IMP 溶解度的影響。

1.2.2.3 不同蛋白與糖質(zhì)量比對(duì)IMP 溶解度的影響準(zhǔn)確稱取0.5 g WPI 溶于50 mL 去離子水中，在反應(yīng)時(shí)間60 min、反應(yīng)溫度90 ℃、pH7.0 的條件下，以溶解度為指標(biāo)，考察WPI 與菊粉質(zhì)量比為3:1、2:1、1:1、1:2、1:3、1:4 條件下對(duì)IMP 溶解度的影響。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn) 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Table 1 Response surface test factor level table

1.2.4 接枝度（degree of grafting，DG）的測(cè)定 按照J(rèn)iang 等[16]改進(jìn)的OPA 試劑法測(cè)定，根據(jù)公式（1）計(jì)算。

式中：A0為反應(yīng)前樣品吸光度；A1為反應(yīng)后樣品吸光度。

1.2.5 褐變程度的測(cè)定 取適量IMP 樣品溶于離心管中，使用高速冷凍離心機(jī)設(shè)置轉(zhuǎn)速8000 r/min 離心時(shí)間10 min 除去不溶物，設(shè)定波長(zhǎng)為420 nm，測(cè)定上清液的吸光度，以蒸餾水做空白對(duì)照。以此表示體系的褐變程度。

1.2.6 結(jié)構(gòu)特性的測(cè)定

1.2.6.1 掃描電子顯微鏡 取適量樣品直接粘到導(dǎo)電膠上，噴淋金45 s，噴金為10 mA。通過(guò)ZEISS Gemini SEM 300 掃描電子顯微鏡對(duì)鍍金試樣進(jìn)行分析。在電子加速電壓為3 kV、放大倍數(shù)為3000×?xí)r對(duì)樣品進(jìn)行觀察，并拍攝圖像。

1.2.6.2 傅里葉變換紅外（FTIR）光譜 取1 mg 樣品與100 mg 干燥后的KBr 混合后研磨，放入壓片機(jī)上壓成透明薄片，通過(guò)VERTEX 70 紅外光譜儀進(jìn)行測(cè)定，掃描波長(zhǎng)4000～400 cm-1，掃描次數(shù)為32 次，分辨率為4 cm-1。

1.2.6.3 內(nèi)源熒光光譜 用10 mmol/L 的pH7 的磷酸鹽緩沖溶液溶解樣品，制備成濃度為0.1 mg/mL的溶液。使用FLS1000 熒光分光光度計(jì)掃描樣品。激發(fā)波長(zhǎng)290 nm，掃描范圍300～400 nm，狹縫寬5 nm，掃描速度200 nm/min，掃描間隔20 ms，反應(yīng)時(shí)間0.1 s。

1.2.7 功能特性

1.2.7.1 溶解度的測(cè)定 采用牛血清蛋白配制標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=7.34x+0.1536，R2=0.9995。根據(jù)Horax 等[17]的方法稍作改動(dòng)，準(zhǔn)確稱取0.1 g 凍干后的樣品分散于10 mL 去離子水中，在磁力攪拌器上攪拌均勻，用鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH，使用高速冷凍離心機(jī)設(shè)置轉(zhuǎn)速8000 r/min 離心10 min，收集上清液；取1 mL 上清液和5 mL 考馬斯G-250 染液于試管中，振蕩混勻，避光放置3 min 后，在波長(zhǎng)595 nm 處測(cè)定吸光度。以同體積去離子水作為對(duì)照。按照公式（2）計(jì)算溶解度。

式中：m0為樣品中蛋白質(zhì)含量，mg/g；m1為上清液中蛋白質(zhì)含量，mg/g。

1.2.7.2 起泡性（FC）和泡沫穩(wěn)定性（FS）的測(cè)定 參考金鳳[15]的測(cè)定方法，記錄溶液和泡沫的總體積V1，將溶液靜置30 min 后，再次讀取量筒內(nèi)液體和泡沫的總體積V2。按照公式（3）、（4）計(jì)算FC 和FS。

1.2.7.3 乳化性（EAI）及乳化穩(wěn)定性（ESI）的測(cè)定準(zhǔn)確稱取0.30 g WPI 溶于30 mL 去離子水中，混合均勻后，參考金鳳[15]的方法進(jìn)行測(cè)定，按照公式（5）、（6）計(jì)算EAI 和ESI。

式中：DF為稀釋因子（100）；c 為樣品的濃度（g/mL）； Φ為光路（1 cm）；θ為油相在乳液的分散系數(shù)（0.25）；A0是樣品在0 min 的吸光值；A10是樣品在10 min 的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Design Expert 8.0.6 分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)；采用Origin 8.0 軟件作圖。使用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差分析，顯著性差異的分析選擇Duncan 法多重比較，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05 為顯著性差異。實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3 次，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 不同反應(yīng)條件對(duì)IMP 溶解度的影響 如圖1a所示，隨著反應(yīng)溫度的升高，IMP 的溶解度先上升后趨于平緩，在溫度為90 ℃時(shí)達(dá)到最大溶解度82.00%。有研究表明，適度的熱處理有利于蛋白質(zhì)和多糖的相互結(jié)合，對(duì)WPI 的溶解性起到促進(jìn)作用。但是當(dāng)加熱溫度過(guò)高或加熱時(shí)間過(guò)長(zhǎng)有可能會(huì)使蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露，結(jié)構(gòu)疏水性增強(qiáng)，溶解度降低[18]。此外，溫度過(guò)高使WPI 發(fā)生變性、聚集和沉淀，結(jié)合水的能力降低。因此，選擇溫度80～100 ℃進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖1 反應(yīng)條件對(duì)IMP 溶解度的影響Fig.1 Effect of reaction conditions on the solubility of IMP

由圖1b 可知，隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，IMP 的溶解度總體呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)，在反應(yīng)時(shí)間為80 min 時(shí)溶解度達(dá)到最高值81.00%。隨著反應(yīng)時(shí)間的繼續(xù)增加，原本斷裂的肽鍵重新聚合，蛋白的疏水基團(tuán)變多，不溶于水的大分子聚合物增多，從而導(dǎo)致溶解度下降[19]。因此，選擇反應(yīng)時(shí)間為60～100 min進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

由圖1c 可知，隨著菊粉占比增加，IMP 的溶解度先上升后降低，這是由于隨著菊粉濃度的不斷提高，多糖提供的反應(yīng)位點(diǎn)逐漸變多，蛋白與多糖碰撞結(jié)合的可能性逐漸變大，在WPI 與菊粉質(zhì)量比為1:2 時(shí)，溶解度達(dá)到最大值79.00%。菊粉比例增加過(guò)多時(shí)，溶液黏度不斷增強(qiáng)，反而不利于糖基化反應(yīng)的發(fā)生，這與王棋等[20]的研究結(jié)果一致。因此，選擇WPI 與菊粉質(zhì)量比為1:1、1:2、1:3 進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 方差分析 利用Design-Expert 8.0 軟件的中心組合設(shè)計(jì)，以A、B、C 為響應(yīng)變量，IMP 溶解度為響應(yīng)值，開展響應(yīng)面試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果和回歸分析分別見表2、表3。得到回歸方程為：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)方案及結(jié)果Table 2 Design of response surface test scheme and results

表3 響應(yīng)面回歸方程方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis of response surface regression equation

由表3 可知，該模型P＜0.0001，R2=0.9736，失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），說(shuō)明該模型的顯著性較高，方程的可行性較好，該模型可用來(lái)預(yù)測(cè)制備IMP 的最優(yōu)條件。根據(jù)表3 可知，各因素對(duì)IMP 溶解度影響的大小順序?yàn)镃＞B＞A，模型中一次項(xiàng)A、B、C 對(duì)IMP溶解度的影響達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。

2.2.2 交互作用對(duì)IMP 溶解度的影響 由圖2 可知，在因素較低水平條件下響應(yīng)值隨著每個(gè)因素的增大而增大，當(dāng)響應(yīng)值增大到極值后，又逐漸減小。溶解度與AB、AC、BC 等高線均為橢圓形，AB 的交互作用圖橢圓形更明顯、曲面最陡，在兩兩因素的交互作用對(duì)溶解度大小的影響中，PAB=0.0017＜0.01，即AB 對(duì)IMP 溶解度的交互作用影響有極顯著影響。利用Design-Expert 8.0 軟件對(duì)反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化組合，得到最佳工藝參數(shù)：反應(yīng)溫度88.73 ℃、反應(yīng)時(shí)間75.09 min、蛋白與糖質(zhì)量比1:2.08，在此條件下菊粉修飾WPI 制備IMP 的溶解度為83.00%。考慮到實(shí)際實(shí)驗(yàn)條件，最終調(diào)整工藝參數(shù)：蛋白與糖質(zhì)量比1:2、反應(yīng)溫度89 ℃、反應(yīng)時(shí)間75 min。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行3 次取平均值，得到的溶解度為83.00%±0.37%，與模型相符，說(shuō)明通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化IMP 的制備條件是可行的，所得優(yōu)化工藝條件可靠。

圖2 影響IMP 溶解度的各個(gè)因素之間的交互作用圖Fig.2 Interaction between factors affecting the solubility of modified protein of inulin

2.3 接枝度與褐變度的測(cè)定

接枝度和褐變度可以用來(lái)判斷糖基化反應(yīng)發(fā)生的程度。由表4 可知，經(jīng)工藝優(yōu)化后IMP 的接枝度為41.73%，IMP 的褐變度為0.29。說(shuō)明WPI 與菊粉發(fā)生的糖基化反應(yīng)較為充分。同時(shí)糖基化反應(yīng)伴隨著褐色產(chǎn)物的產(chǎn)生，但褐變程度低，糖基化反應(yīng)生成的高級(jí)產(chǎn)物較少。反應(yīng)結(jié)果與Zhang 等[21]的研究結(jié)果相似。

表4 IMP 的接枝度與褐變程度Table 4 Grafting degree and browning degree of IMP

2.4 結(jié)構(gòu)性質(zhì)

2.4.1 掃描電鏡 從圖3 可以看出，相同放大倍數(shù)下，WPI 呈大小不一的散落小顆粒狀堆積結(jié)構(gòu)或塊狀結(jié)構(gòu)，H-WPI 呈現(xiàn)破碎的細(xì)小片狀結(jié)構(gòu)，出現(xiàn)大量不規(guī)則碎片，這主要是因?yàn)樵瓉?lái)包埋在WPI 內(nèi)部的疏水基團(tuán)外露，表面疏水性增加，蛋白質(zhì)分子間會(huì)發(fā)生聚集反應(yīng)，形成熱聚集體，從而導(dǎo)致表面結(jié)構(gòu)的變化[22]。IMP 的結(jié)構(gòu)變得更加規(guī)整，呈更大更厚的片狀結(jié)構(gòu)。推測(cè)原因?yàn)閃PI 與菊粉通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合形成大分子的共軛物，表面疏水性降低，親水的糖鏈和疏水的蛋白質(zhì)部分整齊排列，發(fā)生大量的結(jié)合聚集現(xiàn)象，因此接枝物呈大塊狀，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與張楨玉[23]的研究結(jié)果相似。

圖3 不同改性方法對(duì)WPI 微觀結(jié)構(gòu)的影響Fig.3 Effect of different modification methods on the microstructure of walnut protein

2.4.2 紅外光譜分析 由圖4 可知，在3700～3200 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)IMP 相比于WPI 透過(guò)率下降，光譜強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，表明糖分子與蛋白以共價(jià)鍵形式結(jié)合，-OH 的數(shù)量增多，游離-OH 的伸縮振動(dòng)引起透過(guò)率的下降[24]。在1600～1700 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)，H-WPI、IMP 都發(fā)生了明顯的振動(dòng)（主要是由C=O 伸縮振動(dòng)），說(shuō)明加熱處理和糖基化改性處理都使WPI 的二級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化[25]。從圖中可以看出在1050 cm-1波數(shù)附近IMP 的透過(guò)率下降，吸收峰光譜強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，是糖環(huán)存在的典型特征，這與李靈誠(chéng)[26]的研究結(jié)果一致，表明菊粉與WPI 通過(guò)共價(jià)鍵結(jié)合，生成了糖環(huán)，發(fā)生了糖基化反應(yīng)，因此導(dǎo)致蛋白分子側(cè)鏈振動(dòng)。

圖4 不同改性方法對(duì)WPI 二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響Fig.4 Effect of different modification methods on the secondary structure of walnut proteins

2.4.3 內(nèi)源熒光光譜分析 蛋白與糖發(fā)生糖基化反應(yīng)會(huì)生成有色物質(zhì)，而熒光物質(zhì)是有色物質(zhì)的前體物，在290 nm 的熒光激發(fā)波長(zhǎng)下，以色氨酸為發(fā)射基團(tuán)的熒光光譜可以準(zhǔn)確地描述蛋白結(jié)構(gòu)的改變以及氨基酸的損失[27]。由圖5 可以看出，在320 nm處WPI 與熒光反應(yīng)最劇烈，H-WPI、IMP 的內(nèi)源熒光光譜都低于WPI，這可能是由于核桃分離蛋白經(jīng)過(guò)加熱處理后，使蛋白質(zhì)的三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生了改變，導(dǎo)致熒光強(qiáng)度降低[28]。IMP 的熒光光譜峰值波長(zhǎng)出現(xiàn)明顯的紅移（2～3 nm）且IMP 熒光強(qiáng)度減弱程度最大，這可能是因?yàn)槎嗵擎湹拇嬖?，糖分子和蛋白分子之間發(fā)生了共價(jià)結(jié)合等相互作用，蛋白表面引入羥基對(duì)熒光產(chǎn)生屏蔽，導(dǎo)致其熒光減弱程度大[29]。

圖5 不同改性方法對(duì)WPI 內(nèi)源熒光譜圖的影響Fig.5 Effect of different modification methods on the endogenous fluorescence spectra of walnut protein

2.5 功能特性

2.5.1 溶解度 由圖6 可知，WPI、H-WPI、IMP 在酸性環(huán)境中溶解度的變化不明顯，隨著pH 不斷增加，WPI、H-WPI、IMP 的溶解度都得到明顯的改善，這主要是因?yàn)閴A性環(huán)境下提高了蛋白質(zhì)與水分子的親和力，從而增加了溶解度。在pH 6～11 環(huán)境下，IMP、H-WPI 溶解度均明顯高于WPI，WPI 經(jīng)過(guò)加熱處理后使得蛋白質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)暴露，結(jié)構(gòu)更加疏松，從而H-WPI 溶解度變大。菊粉的加入使溶解度得到進(jìn)一步提高，結(jié)果表明糖基化反應(yīng)可以有效改善WPI 的溶解度，在pH 6～10 環(huán)境下效果改善最明顯。

2.5.2 起泡性、泡沫穩(wěn)定性 由圖7 可知，WPI 改性后的起泡性和泡沫穩(wěn)定性均顯著提升。IMP 的起泡性明顯增加，這主要是因?yàn)樘腔磻?yīng)使產(chǎn)物溶解性提高，蛋白溶解性提高能夠促使大量蛋白分子擴(kuò)散至氣/液界面，導(dǎo)致其起泡能力增加[27]。同時(shí)IMP 的泡沫穩(wěn)定性也得到改善，這主要是因?yàn)樘砑拥木辗郾旧砭哂姓承裕诳諝馀c水交界處會(huì)更容易形成薄膜從而減緩了水分的流失，增強(qiáng)了泡沫的穩(wěn)定性[30]。

圖7 不同改性方法對(duì)WPI 起泡性、泡沫穩(wěn)定性的影響Fig.7 Effect of different modification methods on foamability and foam stability of walnut protein

2.5.3 乳化性、乳化穩(wěn)定性 由圖8 可知，H-WPI 的乳化性及乳化穩(wěn)定性對(duì)比WPI 都得到較大程度的改善。說(shuō)明加熱處理可以使蛋白分子的空間結(jié)構(gòu)變的松散，溶解度得到提高，較高的溶解度可促進(jìn)蛋白質(zhì)在乳化相中的分散和吸附[31]，H-WPI 的乳化穩(wěn)定性略高于IMP 主要原因可能是多糖的加入使界面的膜的機(jī)械強(qiáng)度增加，提高了粘彈性，但較H-WPI 不足夠支撐空間穩(wěn)定。IMP 的乳化特性對(duì)比WPI 也得到較大程度的改善。隨著菊粉的加入，蛋白與糖形成了分子量更大的共價(jià)復(fù)合物，分散在油水界面上，產(chǎn)生了空間位阻效應(yīng)，糖基化產(chǎn)物不易聚集，使液滴短時(shí)間內(nèi)無(wú)法快速聚集，糖鏈的加入也增加了蛋白膜厚度，從而增加了IMP 的乳化性指數(shù)[32]。并且由于菊粉為多糖，分子量大，抑制蛋白分子聚集的能力更強(qiáng)，蛋白質(zhì)的部分吸附能力和糖的高親水性相結(jié)合，導(dǎo)致在油水界面附近形成強(qiáng)溶劑化層，從而使乳液油滴具有空間穩(wěn)定性[33]，所以乳化穩(wěn)定性較WPI 提高顯著。

圖8 不同改性方法對(duì)WPI 乳化性、乳化穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effect of different modification methods on emulsifying property and emulsion stability of walnut protein

3 結(jié)論

糖基化改性可以改變核桃分離蛋白的結(jié)構(gòu)，有效改善核桃分離蛋白在溶液中的分散性，增強(qiáng)蛋白質(zhì)與水的結(jié)合作用并改善功能特性。本研究通過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化制備條件后，制備的IMP 溶解度可達(dá)到83%，顯著提高了核桃蛋白的溶解性。同時(shí)，通過(guò)對(duì)IMP結(jié)構(gòu)特性研究發(fā)現(xiàn)，其紅外光譜圖出現(xiàn)明顯特征峰的波動(dòng)，內(nèi)源熒光光譜圖出現(xiàn)明顯的紅移，熒光強(qiáng)度明顯降低，說(shuō)明糖基化改性技術(shù)能夠改變WPI 的結(jié)構(gòu)，并且使其功能特性獲得改善。以上試驗(yàn)結(jié)果為研究糖基化改性制備核桃蛋白菊粉共軛物的結(jié)構(gòu)及功能特性研究奠定了理論基礎(chǔ)，該研究有利于拓寬WPI 在食品工業(yè)應(yīng)用范圍，有利于核桃產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。然而目前關(guān)于糖基化改性核桃分離蛋白的研究還不夠深入，單糖、二糖以及其他多糖對(duì)WPI 的影響尚不全面，在未來(lái)可加強(qiáng)不同糖對(duì)糖基化改性WPI 的研究，運(yùn)用超聲波或者微波等方法輔助糖基化改性進(jìn)行研究以期獲得更高功能特性的產(chǎn)品，開發(fā)新型功能性食品。