鄒 平，徐 瑩，陳文濤，張迎陽(yáng)，徐 榮

（常州大學(xué)石油化工學(xué)院，江蘇常州 213164）

牡丹籽榨油后的殘?jiān)茨档ぷ哑赏ǔ１浑S意堆放、丟棄或用作肥料、動(dòng)物飼料等，綜合利用率極低已被用來(lái)研究蛋白和多肽[1]，但對(duì)其中存在的黃酮類(lèi)化合物研究很少。有機(jī)溶劑萃取法[2]成本較低，操作簡(jiǎn)單，提取效率較高，且所用有機(jī)溶劑安全無(wú)毒副作用，適合工業(yè)生產(chǎn)中提高生產(chǎn)率降低成本。徐瑩等[3]采用75%乙醇-水（v/v）提取橄欖仁紅皮的類(lèi)黃酮化合物，提取物對(duì)DPPH·、·OH 以及ABTS+·有較高的清除率。LU 等[4]使用90%的甲醇優(yōu)化了鳳丹牡丹總黃酮的提取工藝，鳳丹牡丹總黃酮具有顯著的抗氧化、美白和抑菌效果，但甲醇具有毒性，會(huì)對(duì)人體呼吸道黏膜和視力造成損傷，而且甲醇易燃易揮發(fā)，因此高純度的甲醇具有一定的安全隱患。JI 等[5]采用超聲輔助乙醇/磷酸二氫鈉混合液萃取銀耳中的總黃酮，最大提取量為0.158 mg/g，與單一的乙醇溶液相比，提取量大大降低。這表明選用合適濃度的乙醇-水溶液作為牡丹籽粕總黃酮的萃取液不僅操作簡(jiǎn)單且提取量高，但在提取過(guò)程中一些醇溶性的雜質(zhì)也會(huì)隨之被萃取出來(lái)，因此將提取液進(jìn)行分離，期望得到雜質(zhì)更少，純度較高的黃酮提取物。

近20 年來(lái)迅速發(fā)展的膜分離技術(shù)是當(dāng)代新型高效分離技術(shù)，與傳統(tǒng)的分離技術(shù)相比，具有節(jié)能、高效、過(guò)程易控、環(huán)境友好等特點(diǎn)。膜分離方法不需要經(jīng)過(guò)相變或添加輔助劑，僅通過(guò)控制膜的孔徑提取目標(biāo)產(chǎn)物，十分節(jié)能環(huán)保。QUIROS 等[6]采用集成膜工藝，從釀酒廠和橄欖廠廢料中分離回收了黃酮多酚。KHEMAKHEM 等[7]通過(guò)微濾、超濾、納濾結(jié)合的方法成功從橄欖葉中提取出橄欖苦苷，相較于橄欖葉中含量提高了約10 倍，并發(fā)現(xiàn)其具有較好的總抗氧化能力和三價(jià)鐵離子還原能力。目前，植物中黃酮類(lèi)物質(zhì)的提取分離工藝已經(jīng)相當(dāng)成熟，但仍存在選擇性差，污染環(huán)境，工業(yè)應(yīng)用成本高等缺點(diǎn)。因此，本研究嘗試將現(xiàn)有的提取工藝與高新技術(shù)相結(jié)合，建立基于幾種分離提取方法的連續(xù)分離提取設(shè)備，使提取過(guò)程更加高效、安全、無(wú)污染，使黃酮類(lèi)化合物成為一種優(yōu)質(zhì)的自然資源，得到更廣泛的應(yīng)用。

將牡丹籽粕黃酮（PSMF）應(yīng)用到醫(yī)藥保健[8]、食品加工[9]、化妝品生產(chǎn)等行業(yè)，深入研究其健康價(jià)值，不僅可以促進(jìn)相關(guān)研究機(jī)構(gòu)成果轉(zhuǎn)化，還能有效推動(dòng)當(dāng)?shù)胤N植業(yè)發(fā)展，帶動(dòng)農(nóng)民增收，具有顯著的社會(huì)效益，為PSMF 的提取、純化及高值化綜合開(kāi)發(fā)應(yīng)用提高了參考價(jià)值。本論文以牡丹籽粕為研究對(duì)象，采用乙醇-水溶液進(jìn)行萃取，在單因素的基礎(chǔ)上通過(guò)響應(yīng)面分析方法得到PSMF 最佳提取工藝，采用不同種類(lèi)微濾膜進(jìn)行分離，將分離前后活性物質(zhì)進(jìn)行比較，采用LC-MS 技術(shù)對(duì)最優(yōu)條件下提取液中黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行分析，為進(jìn)一步開(kāi)展植物黃酮的研究和開(kāi)發(fā)應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油牡丹籽粕 中國(guó)江蘇國(guó)色天香油用牡丹科技發(fā)展有限公司；蘆丁、1,2-雙（三乙氧基硅基）乙烷阿拉丁試劑有限公司；無(wú)水乙醇 上海沃凱生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、硫酸亞 上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；氯化鋁·六水、30%過(guò)氧化氫、福林酚試劑、去離子水（H2O）、氫氧化鈉、硫酸亞 、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、水楊酸、鄰苯三酚、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·）、抗壞血酸（Ascorbic acid，Vitamin C，VC）、鄰二氮菲、鹽酸、氯化硝基四氮唑蘭（NBT）、還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）、5-甲基吩嗪硫酸甲酯（PMS） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；上述實(shí)驗(yàn)試劑均為分析純。

721N 可見(jiàn)光分光光度計(jì) 上海儀電分析儀器有限公司；MDF-U5412 低溫冰箱 三洋電機(jī)株式會(huì)社；SHB-ⅢA 循環(huán)水式真空泵 上海聚昆儀器設(shè)備有限公司；DF-Ⅱ數(shù)顯集熱式磁力攪拌器 金壇市杰瑞爾電器有限公司；UV-3600 紫外可見(jiàn)近紅外分光光度計(jì) 日本島津公司；ATY224 精密電子天平 常州萬(wàn)泰天平儀器有限公司；Tissuelyser-48 高通量組織破碎儀 上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司；Q Exactive質(zhì)譜儀、Reacti-thermo 氮?dú)獯祾邇x 美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司；Acquity 高效液相色譜儀 美國(guó)Waters 公司；XH-T 漩渦混合器 金壇區(qū)白塔新寶儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 牡丹籽粕中黃酮類(lèi)化合物的提取工藝 將牡丹籽粕粉碎過(guò)80 目篩，選擇乙醇-水（v/v）溶液作為溶劑對(duì)牡丹籽粕中的天然黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行浸提，將浸提液離心取上清液，上清液濃縮后在-40 ℃凍干保存，將凍干粉研磨可得到PSMF 凍干粉末。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定 總黃酮標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：取3 mL 蘆丁對(duì)照品溶液置于10 mm 比色皿，再加入5 mL 1% AlCl3溶液，搖勻后靜置10 min，以吸光度值（y）為縱坐標(biāo)，蘆丁含量（x）為橫坐標(biāo)，在415 nm處測(cè)定吸光度并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)圖。吸光度值與的濃度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為：y=(0.03±2.01E-4)x+(0.01±0.006)，R2=0.999 4。取200 μL 樣品溶液加30%乙醇-水（v/v）溶液定容至5 mL 再加入5 mL 1% AlCl3溶液，搖勻后靜置10 min，在415 nm 處測(cè)定吸光度，可根據(jù)公式（1）計(jì)算出樣品液中總黃酮含量。

式中，A、n 分別代表樣品吸光度和稀釋倍數(shù)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn) 稱(chēng)取1.0 g PSMF 粉末，固定提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50 ℃，改變料液比（m 牡丹籽粕:V 乙醇）1:5、1:10、1:15、1:25、1:50 g/mL；固定料液比1:15 g/mL、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%、提取溫度50 ℃，改變提取時(shí)間10、20、30、40、50 min；固定料液比1:15 g/mL、提取時(shí)間30 min、提取溫度50 ℃，改變乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、50%、60%、70%、80%；固定料液比1:15 g/mL、提取時(shí)間30 min、乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，改變提取溫度40、50、60、70、80 ℃進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，對(duì)總黃酮類(lèi)化合物進(jìn)行提取并使用紫外分光光度計(jì)對(duì)PSMF 含量進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化總黃酮提取工藝 響應(yīng)面試驗(yàn)的因素水平取值由單因素實(shí)驗(yàn)得出，選擇提取時(shí)間、提取溫度、乙醇體積分?jǐn)?shù)和料液比為影響因子，以黃酮提取量為響應(yīng)值（見(jiàn)表1），利用Design-Expret 8.0.6軟件分別對(duì)牡丹籽粕進(jìn)行曲面響應(yīng)試驗(yàn)，共29 個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。得到二元多項(xiàng)式回歸方程，進(jìn)行重復(fù)實(shí)驗(yàn)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平設(shè)計(jì)Table 1 Level of response surface experimental factors

1.2.5 黃酮類(lèi)化合物的分離純化

1.2.5.1 微濾膜分離 由于牡丹黃酮提取物中所含成分較多，本研究采用雙層濾紙對(duì)粗提液進(jìn)行預(yù)處理，以盡量除去固體懸浮物等物質(zhì)，延長(zhǎng)微濾膜的使用壽命，減輕膜的污染。微濾選用微孔膜，平均孔徑0.02 μm，能夠截留直徑0.05～10 μm 的微?；蚍肿恿看笥?000 Da 的物質(zhì)。根據(jù)濾膜材質(zhì)，將聚偏二氟乙烯（PVDF）、聚醚砜（PES）、聚四氟乙烯（PTFE）、聚丙烯（PP）、混合纖維素（MCE）、聚丙烯腈（PAN）、水系醋酸纖維（CA）和聚酰胺（PA）微濾膜分為水系微濾膜、有機(jī)系微濾膜和混合系微濾膜三類(lèi)。水系濾膜系列包括：CA[10]（用于乳清和果汁的分離時(shí)）、MCE、PES[11]（具有良好的分子穩(wěn)定性、優(yōu)異的機(jī)械性能和成膜性能，去除天然存在的有害有機(jī)物）等。常用有機(jī)系微孔膜：PTFE[12]（已用于膜蒸餾、油水分離和氣固分離等多種分離工藝，是目前最常見(jiàn)的膜分離材料）、PVDF（具有出色的化學(xué)、熱和機(jī)械穩(wěn)定性[13]，有利于在不同分離條件下進(jìn)行有機(jī)物的純化）。混合濾膜過(guò)濾：PA[14]（具有優(yōu)異的分離性能，耐高溫，聚酰胺樹(shù)脂是一種從植物中分離黃酮的有效吸附劑）、改性的聚偏氟乙烯、改性的聚四氟乙烯膜等。因此選用PVDF、PES、PTFE、PP、MCE、PAN、CA 和PA 這8 種材料微濾膜對(duì)處理液進(jìn)行分離。

根據(jù)8 種微濾膜通量、水接觸角以及PSMF 透過(guò)液凍干粉的掃描電鏡、熱重等表征確定分離效果最佳的微濾膜。在操作壓力為0.8 MPa，操作溫度為25 ℃，流量為9.99 mL/min 的條件下，對(duì)膜進(jìn)行預(yù)壓30 min 后測(cè)定膜通量，根據(jù)公式（2）計(jì)算膜通量。

式中，J 代表膜通量（kg/（m2·h））；W 代表過(guò)膜液質(zhì)量（kg）；T 代表取樣時(shí)間（h）；A 代表膜的有效面積（m2）。

1.2.5.2 納濾膜分離 納濾分離膜為實(shí)驗(yàn)室自制，選擇PA 膜為支撐體，采用1，2-二（三乙氧基甲硅烷基）乙烷（BTESE）作為硅源前驅(qū)體，正丙醇為溶劑，以鹽酸為催化劑，制備了有機(jī)硅聚合溶膠。通過(guò)超聲噴涂法將有機(jī)硅溶膠涂覆在PA 撐體上制備BTESE/PA復(fù)合膜，對(duì)PSMF 溶液進(jìn)行納濾膜分離。

1.2.6 微濾膜、溶膠和納濾復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)表征

1.2.6.1 掃描電鏡分析 分離膜在觀察前樣品進(jìn)行噴金處理，采用德國(guó)-蔡司SUPRA55 場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡（SEM）觀察BTESE 有機(jī)硅復(fù)合膜的表面和斷面形貌。

1.2.6.2 熱重分析儀分析 采用熱重分析儀（NETZSCH，209F3）對(duì)PSMF 溶液、PA 透過(guò)液和BTESE/PA 復(fù)合納濾膜透過(guò)液的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征，升溫速率為10 ℃·min-1，溫度范圍為50～800 ℃，在N2氛圍下操作。

1.2.6.3 液-質(zhì)聯(lián)用組分分析 基于液-質(zhì)聯(lián)用（LCMS）非靶向的方式進(jìn)行檢測(cè)[15]，重復(fù)3 次，所得到的數(shù)據(jù)供生物信息學(xué)分析，最終得出代謝物。采用Thermo 超高效液相系統(tǒng)（Vanquish，USA），根據(jù)化合物的性質(zhì)，采用Hyper ODS2 C18 填料，進(jìn)樣量10 μL，流速0.9 mL/min，柱溫40 ℃，流動(dòng)相A 為85%甲酸-水（v/v）溶液，流動(dòng)相B 為去離子水溶液。質(zhì)譜采用的是美國(guó)Thermo 公司的Qexactive 高分辨質(zhì)譜檢測(cè)系統(tǒng)。

1.2.7 黃酮類(lèi)化合物抗氧化能力測(cè)定

1.2.7.1 DPPH·清除能力測(cè)定 DPPH·清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)[16]，稍作改進(jìn)。樣品為2 mL PSMF 溶液（50、100、150、200、250 μg/mL）和2 mL 0.1 mmol/L DPPH·溶液（95%乙醇溶解）?？瞻诪?5%乙醇2 mL+0.1 mmol/L DPPH· 2 mL。室溫下避光反應(yīng)30 min，在波長(zhǎng)為517 nm 處測(cè)定吸光度。DPPH·清除率根據(jù)式（3）計(jì)算。

式中，A樣、A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.2.7.2 ·OH 清除能力測(cè)定 ·OH 清除能力測(cè)定實(shí)驗(yàn)方法參照文獻(xiàn)[17]，稍作改進(jìn)?；旌弦河? mL 1,10-鄰菲咯啉（5 mmol/L）和4 mL FeSO4（5 mmol/L）組成，然后依次加入3 mL 磷酸鹽緩沖液（16 mL 0.2 mol/mL 磷酸二氫鈉+84 mL 0.2 mol/mL 磷酸氫二鈉配制，pH7.4），3 mL H2O2（0.01%）和4 mL PSMF樣品液，搖勻后靜置1 h，在536 nm 處測(cè)量吸光度。對(duì)照組用蒸餾水代替PSMF 溶液，其他試劑與樣品相同?？瞻捉M用蒸餾水代替過(guò)氧化氫，其他試劑與樣品相同。根據(jù)式（4）計(jì)算·OH 清除率。

式中，A樣、A損和A0分別代表樣品、對(duì)照和空白的吸光度。

1.2.7.3 O2-·清除能力測(cè)定 按照文獻(xiàn)[18]修改如下，取1.5 mL 樣品液，再分別按順序加入0.5 mL 0.30 mmol/L NBT （pH8.0 Tris-HCl 配制）、0.5 mL 0.468 mmol/L NADH （pH8.0 Tris-HCl 配制）和0.5 mL 0.060 mmol/L PMS （pH8.0 Tris-HCl 配制），混合均勻后在25 ℃水浴5 min。測(cè)定其波長(zhǎng)在560 nm 處的吸光度，O2-·清除率計(jì)算方程式為：

式中，A樣和A0分別代表樣品和空白的吸光度。

1.2.7.4 還原力測(cè)定 按照文獻(xiàn)[19]，取1.5 mL 樣品液，再分別按順序加入1 mL 0.20 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH8.0 Tris-HCl 配制）、1 mL 1% 氰化鉀1 mL，混合均勻后在50 ℃水浴20 min，快速冷卻后加10%三氯乙酸（TCA），3000 r/min 離心后取上清液1.5 mL，加入1.5 mL 蒸餾水和0.4 mL 0.1%氯化鐵溶液，反應(yīng)10 min。測(cè)定700 nm 處的吸光度， 還原力強(qiáng)弱反應(yīng)在吸光值上。

1.2.7.5 半抑制濃度計(jì)算 按照公式（6）計(jì)算IC50值：

式中，Xm代表樣品最大濃度的對(duì)數(shù)；I 代表樣品最大濃度與樣品相鄰濃度之比的對(duì)數(shù)；P、Pm和Pn分別代表樣品濃度之和、樣品最大濃度和樣品最小濃度（μg/mL）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 9.0 對(duì)提取實(shí)驗(yàn)和單因素實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理；利用Design-Expert 8.0.6 對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化測(cè)試數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

PSMF 提取量的提取受到料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及提取溫度的影響，各因素對(duì)其影響關(guān)系通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)表明。按照1.2.1 中條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到結(jié)果如圖1 所示。

圖1 料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取溫度對(duì)PSMF 提取量的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio, extraction time, ethanol volume fraction and extraction temperature on the extraction amount of PSMF

如圖1A 所示，不同小寫(xiě)字母表示PSMF 的提取量在不同料液比時(shí)的差異顯著（P＜0.05），提取量隨著浸提溶劑量的增加而減少。由于PSMF 具有易溶于乙醇的性質(zhì)，所以在料液比較小的時(shí)候，溶液中的黃酮類(lèi)化合物很快溶出達(dá)到飽和[20]?？紤]到隨著浸提溶劑體積的增加，也會(huì)增大濃縮工藝的難度，因此浸提溶劑量不宜過(guò)大，采用料液比為1:15 g/mL 最為合適。

如圖1B 所示，不同小寫(xiě)字母表示PSMF 的提取量在不同提取時(shí)間時(shí)的差異顯著（P＜0.05），提取時(shí)間在30 min 時(shí)，提取量達(dá)到峰值（234.84±1.17）μg/mL，超過(guò)30 min 有所下降，可能是由于時(shí)間的延長(zhǎng)，黃酮類(lèi)化合物中酚羥基結(jié)構(gòu)遭到破壞分解為雜質(zhì)，導(dǎo)致提取量下降。

如圖1C 所示，不同小寫(xiě)字母表示PSMF 的提取量在不同乙醇體積分?jǐn)?shù)時(shí)的差異顯著（P＜0.05），黃酮類(lèi)物質(zhì)為典型的有機(jī)化合物，易溶于有機(jī)試劑[21]，因而提高乙醇體積分?jǐn)?shù)，總黃酮的提取量也會(huì)隨之升高，但過(guò)高的乙醇體積分?jǐn)?shù)導(dǎo)致大量有機(jī)雜質(zhì)被溶出并擠占黃酮分子的溶出空間，從而導(dǎo)致活性有所下降。最終萃取劑選擇為70%乙醇-水（v/v）溶液。

如圖1D 所示，不同小寫(xiě)字母表示PSMF 的提取量在不同提取溫度時(shí)的差異顯著（P＜0.05）。由于黃酮類(lèi)化合物中含有酚羥基結(jié)構(gòu)，適當(dāng)?shù)臏囟瓤梢约せ盍u基自由基活性，但過(guò)高的溫度會(huì)使其氧化分解，50 ℃后黃酮類(lèi)化學(xué)物的結(jié)構(gòu)遭到破壞，導(dǎo)致提取量降低。最終提取溫度選擇50 ℃。

由單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知PSMF 提取的最佳條件為料液比1:15 g/mL，提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間30 min，PSMF 提取量最高為（234.84±1.17）μg/mL。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

利用 Design-Expert 軟件對(duì)回歸模型進(jìn)行方差和顯著性分析，結(jié)果如表2、表3 所示。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Response surface experimental design and results

表3 回歸模型的方差分析及顯著性結(jié)果Table 3 Analysis of variance and significance results of the regression model

利用 Design-Expert 軟件進(jìn)行多元次擬合分析，得出PSMF 提取量與料液比、提取時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)以及提取溫度為變量的相關(guān)回歸方程為：

由表3 可知，模型的P＜0.0001，表明該模型具有極顯著性，失擬項(xiàng)P值為0.5600，因而該模型擬合程度較好，實(shí)驗(yàn)誤差小，可用此模型對(duì)PSMF 進(jìn)行預(yù)測(cè)和分析。在這種情況下，A、B、C、D、AB、AC、AD、BC、BD、CD、A2、B2、D2對(duì)響應(yīng)值具有極顯著影響（P＜0.01），C2對(duì)響應(yīng)值具有顯著性影響（P＜0.05）。PSMF 與料液比、提取時(shí)間、提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)的等高圖和3D 響應(yīng)面見(jiàn)圖2。

圖2 PSMF 的3D 響應(yīng)面圖Fig.2 3D Response surface of PSMF

將所得結(jié)果利用 Design-Expert 軟件進(jìn)行響應(yīng)面預(yù)最優(yōu)點(diǎn)預(yù)測(cè)，得到料液比1:15 g/mL，提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，提取時(shí)間30 min，預(yù)測(cè)PSMF 提取量（240.28±2.25）μg/mL。

2.3 微濾膜對(duì)PSMF 的分離純化效果

2.3.1 8 種材料微濾膜膜通量分析 膜通量指單位時(shí)間內(nèi)通過(guò)單位膜面積上的流體量，對(duì)于同一種流體來(lái)講，膜通量越大，溶液透過(guò)率就越高，分離的效率越快。8 種不同材料的微濾膜膜通量見(jiàn)圖3。

圖3 8 種微濾膜的膜通量結(jié)果Fig.3 Membrane flux histogram of 8 kinds of microfiltration membranes

如圖3 所示，不同小寫(xiě)字母表示膜通量在不同材料微濾膜時(shí)的差異顯著（P＜0.05），可以看出在同樣的分離條件下PA 膜的膜通量最高，PP 膜的膜通量最低，膜通量的高低由外加推動(dòng)力和膜的阻力共同決定，其中膜本身的性質(zhì)起決定性作用，天然致密的PA 結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出優(yōu)異的離子截留性能，具有選擇性水滲透和鹽截留的特性[22]。因此推斷PA 膜較其他材料而言，對(duì)PSMF 溶液有較好的分離效果。

2.3.2 8 種材料微濾膜表面表征分析 與光滑的支撐體相比，在相對(duì)粗糙的支撐體表面制備出高質(zhì)量的BTESE 有機(jī)硅涂層無(wú)疑是困難的[23]。由圖4 表明，PA 表面更光滑且過(guò)膜后的PSMF 溶液凍干粉顆粒更均勻，本實(shí)驗(yàn)優(yōu)先考慮PA 作為制備復(fù)合聚酰胺納濾膜的支撐體。

圖4 8 種微濾膜表面SEM 圖Fig.4 SEM images of the surface of 8 kinds of microfiltration membranes

2.3.3 8 種材料微濾膜分離效果分析 8 種微濾膜對(duì)PSMF 的分離效果：PA＞PAN＞CA＞MCE＞PVDF＞PES＞PTFE＞PP。由圖5（a）為PSMF 原料液-質(zhì)圖，原料液中含有12 種黃酮類(lèi)化合物。圖5（b）～圖5（e）分離程度較弱，大部分化合物未被分離。圖5（f）～圖5（i）分離程度有所提高，其中PA 膜分離效果最好，分離出5 個(gè)組分，分別為桑色素、山奈酚、野漆樹(shù)苷、羥基芫花素和槲皮素。PA 薄膜的這種強(qiáng)的結(jié)合親和力源于酰胺基團(tuán)與目標(biāo)化合物分子的供質(zhì)子基團(tuán)之間的氫鍵相互作用[24]。采用場(chǎng)發(fā)射掃描電鏡觀察微濾膜過(guò)膜后PSMF 凍干粉的形貌，與其他凍干顆粒相比，PA 凍干粉顆粒更均勻。由膜通量、掃描電鏡和液相出峰共同確定了選用PA 膜分離PSMF，可以達(dá)到較好的分離效果。

其中桑色素含量最高（Morin）含量最多，其分子式為C15H10O7（表4、圖6），桑色素具有許多藥理功能，包括抗氧化劑、抗癌劑、抗炎抗菌藥物等。ZHANG 等[25]通過(guò)對(duì)細(xì)胞抑制、周期分析、細(xì)胞凋亡、mRNA 表達(dá)和通過(guò)活性氧產(chǎn)生的抗氧化機(jī)制研究，驗(yàn)證了桑色素在誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡中起重要作用。JARINYAPORN等[26]發(fā)現(xiàn)桑色素可以抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠的脂肪的生成。

表4 PSMF 成分組成分析結(jié)果Table 4 Composition of PSMF

2.3.4 BTESE/PA 復(fù)合膜表征以及分離效果分析PA 薄膜具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性且耐溶劑性強(qiáng)，且對(duì)于PSMF 有較好的分離效果，將PA 膜過(guò)膜液進(jìn)行納濾分離，納濾膜為實(shí)驗(yàn)室自制的BTESE/PA 復(fù)合膜，膜表面形貌如圖7（右）所示。

圖7 PA 膜表面（左）、BTESE/PA 復(fù)合膜表面（右）SEM 照片F(xiàn)ig.7 SEM diagram of PA membrane surface (left) and BTESE/PA composite membrane surface (right)

由圖7 可知，膜表面小部分針孔被有機(jī)硅膠層修飾，膜整體連續(xù)、平整無(wú)明顯缺陷。同時(shí)由圖7（右）可見(jiàn)，BTESE/PA 復(fù)合膜的結(jié)構(gòu)清晰。經(jīng)過(guò)復(fù)合膜分離后的PSMF 溶液的液-圖以及組分如圖8 所示。由圖8 可見(jiàn)，BTESE/PA 復(fù)合膜過(guò)濾后PSMF分離出三個(gè)組分?？赡苁荁TESE 納米粒子增加了PA膜的表面厚度和親水性，BTESE 納米粒子改變了PA膜的表面，使其結(jié)構(gòu)更加緊密，截留更小的分子[27]。隨著植物黃酮的功效在歐美市場(chǎng)被認(rèn)可，黃酮類(lèi)化合物的應(yīng)用領(lǐng)域越來(lái)越廣，但由于黃酮類(lèi)化合物具有水溶性低的天然特性，限制了PSMF 在功能性飲料、化妝、普通食品等領(lǐng)域的應(yīng)用。通過(guò)PA 和BTESE/PA 膜過(guò)濾后的溶液，有效的解決了這個(gè)問(wèn)題。溶解度由55.22%提升至90.31%，過(guò)濾后的PSMF 水溶性明顯提高。過(guò)膜后熱穩(wěn)定性好，食品熱加工不會(huì)破壞其生物活性，同時(shí)還保留著部分抗氧化活性，方便儲(chǔ)存。PSMF 作為一種天然的食品添加劑，其開(kāi)發(fā)利用價(jià)值應(yīng)給予重視，BTESE/PA 有機(jī)納濾膜在黃酮分離中的應(yīng)用應(yīng)當(dāng)給予肯定。

圖8 BTESE/PA 復(fù)合膜過(guò)膜液的液-質(zhì)聯(lián)用結(jié)果Fig.8 BTESE/PA composite membrane permeate liquid-mass spectrometry diagram

2.3.5 PSMF、PA 過(guò)膜液以及BTESE/PA 透過(guò)液性能表征 采用熱重分析儀分別對(duì)PSMF 提取液、微濾膜透過(guò)液以及BTESE/PA復(fù)合膜過(guò)膜液的熱穩(wěn)定性進(jìn)行表征，溫度范圍為50～800 ℃，在N2氛圍下操作。由圖9 可見(jiàn)，100 ℃之前，熱失重曲線(xiàn)幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明在100 ℃之前，提取物穩(wěn)定，沒(méi)有出現(xiàn)物質(zhì)的熱分解；100～210 ℃之間，熱失重曲線(xiàn)開(kāi)始出現(xiàn)緩慢下降趨勢(shì)，說(shuō)明物料分解溫度，開(kāi)始出現(xiàn)熱分解現(xiàn)象，樣品失重約為5%；在210～280 ℃之間，熱失重曲線(xiàn)大幅度下降，大部分被熱分解，樣品失重約為42%，此時(shí)三種物質(zhì)的失重速率達(dá)到最大，其中PSMF提取液失重速率＞PA 透過(guò)液失重速率＞BTESE/PA復(fù)合膜過(guò)膜液失重速率，相比較而言，透過(guò)BTESE/PA 復(fù)合膜的黃酮提取物熱穩(wěn)定性有所提高；280 ℃之后，熱失重曲線(xiàn)下降趨勢(shì)減小，為物料及灰分的熱分解。800 ℃以后PSMF 提取液、微濾膜透過(guò)液以及BTESE/PA 復(fù)合膜過(guò)膜液的殘留質(zhì)量分別為1.43%、0.76%和0.26%，由此表明通過(guò)BTESE/PA復(fù)合膜的PSMF 溶液受熱后殘留的灰分更少雜質(zhì)更少，純度更高，進(jìn)一步表明BTESE/PA 復(fù)合膜對(duì)PSMF 溶液有較好的分離效果。

圖9 PSMF、PA 過(guò)膜液以及BTESE/PA 透過(guò)液熱重曲線(xiàn)Fig.9 Thermogravimetric curves of PSMF, PA film passing solution and BTESE/PA penetrating solution

2.4 抗氧化活性

由圖10 可知，不同小寫(xiě)字母表示PSMF、BTESE/PA 過(guò)膜液、VC的抗氧化活性在不同濃度時(shí)的差異顯著（P＜0.05），在所測(cè)定濃度范圍內(nèi)，VC對(duì)·OH、O2-·和DPPH·始終保持很高的清除能力，隨VC的濃度增加，其還原力也隨之提高。經(jīng)過(guò)膜過(guò)濾后的PSMF 溶液在·OH、DPPH·的清除率和還原力上有所提升：還原力＞·OH 清除率＞DPPH·清除率，但過(guò)膜后O2-·清除率低于PSMF 原料液的清除率。PSMF 過(guò)膜液的·OH 清除率略高于原料液，其可能是因?yàn)槟⒋蠓肿拥碾s質(zhì)截留，小分子的黃酮類(lèi)化合物透過(guò)，王帥[28]以白皮杉醇PIC 為例，證明了抽氫反應(yīng)·OH清除的優(yōu)勢(shì)通道，PSMF 富含酚羥基結(jié)構(gòu)，因此清除率有所上升；O2-·清除能力與酚羥基有直接的關(guān)系[29]，當(dāng)酚羥基被金屬離子螯合時(shí)，清除能力下降，PSMF中的鄰二酚結(jié)構(gòu)也會(huì)抑制O2-·清除；DPPH·[30]清除機(jī)理以H 原子轉(zhuǎn)移為主導(dǎo)，因此其清除率曲線(xiàn)與·OH 清除曲線(xiàn)相似；PSMF 過(guò)膜液的還原力略高于原料液，其因可能是過(guò)膜后的PSMF 溶液呈中性，化合物穩(wěn)定，不發(fā)生自氧化作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的清除能力，隨化合物濃度增加而提高。

圖10 PSMF、BTESE/PA、VC 抗氧化活性曲線(xiàn)Fig.10 Schematic diagram of antioxidant activity test of PSMF,BTESE/PA and VC

綜上，PSMF 具有較好的清除自由基的能力，其抗氧化能力隨濃度升高而增大，最終趨近于VC的抗氧化能力，PSMF 過(guò)膜液對(duì)超氧陰離子的清除率低PSMF 于原料液，除此之外過(guò)膜液的抗氧化性能均有所提高。PSMF 是將牡丹籽榨油后剩余的殘?jiān)厥蘸筮M(jìn)行提取，提高了資源再利用，且具有較強(qiáng)的清除·OH、O2-·、DPPH·和還原力的能力，并均呈一定的量效關(guān)系（表5）。

表5 不同抗氧化劑清除自由基的IC50 值Table 5 IC50 values of different antioxidants for scavenging free radicals

3 結(jié)論

本研究以總黃酮提取量為參考指標(biāo)，以乙醇-水（v/v）溶液為提取劑，經(jīng)過(guò)響應(yīng)面優(yōu)化得出最佳的提取條件為料液比1:15，提取溫度50 ℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%，提取時(shí)間為30 min，預(yù)測(cè)總黃酮提取量（240.28±2.25）μg/mL。采用LC-MS 技術(shù)分析PSMF共有12 種化合物。篩選了8 種不同的微濾膜進(jìn)行分離研究，發(fā)現(xiàn)PA 膜分離效果較好，其中桑色素的相對(duì)含量最多。納濾膜選用實(shí)驗(yàn)室自制的BTESE/PA 復(fù)合膜，截留分子量在400 Da 左右，分離后的PSMF純度和熱穩(wěn)定性略提高，水溶性顯著提升。抗氧化測(cè)試結(jié)果顯示BTESE/PA 復(fù)合膜的抗氧化效果比未處理的PMSF 有所提升。本研究對(duì)牡丹籽粕中的活性成分進(jìn)行分析，結(jié)果表明PSMF 是一種新型的植物黃酮資源，組成豐富，具有一定的研究空間。目前，對(duì)牡丹籽粕的研究較少，尤其是在分離提純和活性探究的空間還很大，例如單一黃酮類(lèi)化合物的提純以及對(duì)提純后提取物的抑菌活性、抗氧化、抗癌等方面的分析還有待深入研究。