王威振，楊盼盼 ，遆永瑞，唐玉超，徐雷鋒，吳學(xué)尉, ，宋子涵 ，明 軍

（1.云南大學(xué)農(nóng)學(xué)院，云南昆明 650091；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所，蔬菜生物育種全國重點實驗室，北京 100081）

百合通常指百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物，百合屬中真正中文名稱為“百合”的種是指Lilium browniivar.viridulum，也被稱為龍牙百合[1]。百合廣泛分布于北半球，是非常重要的高檔蔬菜、藥材，也是世界4 大切花之一。同時它也是中國衛(wèi)生部審批通過的首批藥食同源植物之一，具有確定醫(yī)藥療效，而且還具有很高的食用、觀賞價值[2-3]。百合中含有豐富的多糖、多酚、黃酮和皂苷等活性成分，多糖是主要活性功能成分之一[4]，具有抗氧化、降血糖、降血脂等多種生理活性功能作用[5]。

近年來，隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖成為一個重要的公共健康問題，而營養(yǎng)過剩成為肥胖的重要誘因[6]。飲食中的脂肪攝入量經(jīng)常被認(rèn)為是肥胖的增加的罪魁禍?zhǔn)?，且膳食脂肪攝入量與肥胖呈正相關(guān)[7]。在人體消化系統(tǒng)中膳食脂肪的消化主要依靠胰腺脂肪酶（human pancreatic lipase，HPL），如果可以抑制胰脂肪酶就可以減少脂肪吸收，從而控制和治療肥胖[8]。目前市場上應(yīng)用的胰脂肪酶抑制劑類減肥產(chǎn)品主要是奧利司他[9-10]。盡管奧利司他具有良好的減肥作用，但會引起一些較為嚴(yán)重的副作用，如腹瀉、腹脹、油性糞便、大便緊急感，以及一些對肝臟的負(fù)面影響[11-13]。因此，探尋一種天然的、安全有效的藥食同源類降脂產(chǎn)品具有重要的現(xiàn)實意義。李鑫鑫等[14]檢測了12 種植物粗多糖對胰脂肪酶抑制率，均具有一定的抑制效果，同時多具有良好的抗氧化活性，而龍牙百合多糖在降血脂抗肥胖方面鮮見報道。

百合多糖提取方法主要有熱水浸提法、超聲法、微波輔助法、高壓法和酶法等，而不同的提取方法會影響多糖的得率、結(jié)構(gòu)和生物活性[15-17]。王榮琨等[18]比較了超聲輔助提取、壓力輔助提取法和不同pH 水浸提法所得竹蓀純多糖的提取率，其中超聲提取法提取率最高，且其抗氧化活性最強(qiáng)。馬高興等[19]采用熱水浸提法和超聲提取法提取杏鮑菇多糖測定了其免疫活性，結(jié)果表明超聲提取杏鮑菇多糖具有更高的免疫活性。

目前在百合多糖的報道中，主要對卷丹和蘭州百合多糖提取工藝及功能研究較多，而針對龍牙百合多糖提取工藝優(yōu)化及其多糖的結(jié)構(gòu)功能鮮有報道。超聲輔助提取能有效提高百合多糖得率，且所得多糖可能具有較高的生物活性。因此，本實驗主要研究了超聲輔助提取龍牙百合多糖的最佳工藝參數(shù)和初步分離純化方法，并以純化的多糖進(jìn)行抗氧化、降血脂功效初步驗證，以期為龍牙百合的深加工和新產(chǎn)品開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

龍牙百合 8 月份采收自湖南隆回，將其鱗片洗凈，60 ℃烘干至恒重，破壁機(jī)打粉過100 目篩網(wǎng)，置于干燥器中常溫保存?zhèn)溆茫籒aOH、硫酸、苯酚 北京化工廠有限責(zé)任公司；無水葡萄糖 山東齊魯生物科技有限公司；牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)、D-半乳糖醛酸、蒽酮、橄欖油、VC源葉生物科技有限公司；DPPH 試劑盒、ABTS 試劑盒 蘇州科銘生物技術(shù)有限公司；酚酞 上海凜恩科技發(fā)展有限公司；奧利司他 魯南制藥集團(tuán)股份有限公司；胰脂肪酶 上海阿拉丁生化科技股份有限公司；聚乙二醇4000 日本青木工貿(mào)株式會社；無水乙醇 天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鉀 北京化學(xué)試劑公司；十二水合磷酸氫二鈉 西隴化工股份有限公司；正丁醇國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

Pilot2-4M 型真空冷凍干燥機(jī) 博醫(yī)康（北京）儀器有限公司；WFZ UV-2802PC 型紫外分光光度計尤尼柯（上海）儀器有限公司；BSM-220.4 型電子天平 上海卓精電子科技有限公司；JBT/C-YCL 600T/3P（D）型超聲波藥品處理機(jī) 濟(jì)寧金百特電子有限責(zé)任公司；HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 常州越新儀器制造有限公司；DHG-9143BS-III 型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；H4-20K 型臺式高速離心機(jī) 湖南可成儀器設(shè)備有限公司；THD-200D 型臺式恒溫振蕩器 北京天林恒泰科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 龍牙百合粗多糖的提取工藝 取龍牙百合粉3.00 g，按照單因素實驗條件超聲輔助提取，提取結(jié)束后多糖液用70%乙醇溶液過夜醇沉，6000 r/min離心10 min 棄去上清液得到沉淀，室溫酒精揮發(fā)1 h后放入烘箱中60 ℃烘干至恒重，稱重，重復(fù)3 次。按照公式（1）計算多糖得率。

式中：A：多糖得率；m1：粗多糖質(zhì)量，g；m2：原料質(zhì)量，g。

1.2.2 水溶性粗多糖超聲提取單因素實驗

1.2.2.1 料液比對多糖得率的影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，將蒸餾水按照料液比1:10、1:15、1:20、1:25 和1:30 g/mL 的比例加入錐形瓶中，攪拌均勻后在提取溫度55 ℃，提取時間20 min，超聲功率400 W 條件下進(jìn)行多糖提取，每個料液比梯度3 次平行實驗。

1.2.2.2 浸提時間對多糖得率影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，選取提取時間5、10、15、20 和25 min，在料液比1:10 g/mL，提取溫度55 ℃，超聲功率400 W條件下進(jìn)行多糖提取，每個時間梯度3 次平行實驗。

1.2.2.3 浸提溫度對多糖得率影響 準(zhǔn)確稱取龍牙百合粉3.00 g，選取提取溫度35、45、55、65 和75 ℃，在料液比1:10 g/mL，提取時間20 min，超聲功率400 W 條件下進(jìn)行多糖提取，每個溫度梯度3 次平行實驗。

1.2.3 水溶性粗多糖提取的正交試驗 在單因素實驗基礎(chǔ)上以料液比、浸提時間和浸提溫度為因素，每個因素取3 個水平進(jìn)行L9（34）正交試驗對提取條件進(jìn)一步優(yōu)化，因素與水平見表1。

表1 正交試驗因素與水平Table 1 Factors and their levels used in orthogonal arraydesign

1.2.4 龍牙百合粗多糖除蛋白純化 將制備好的龍牙百合粗多糖10.00 g 以1:60 g/mL 的料液比加入蒸餾水于60 ℃水浴鍋匯中攪拌充分溶解，將多糖溶液用1%的醋酸調(diào)節(jié)pH 至6.4，加入木瓜蛋白酶于60 ℃水浴鍋酶解3 h。冷卻至室溫后，6000 r/min 條件離心3 min，收集上清液。在上清液中加入1/2 體積Sevag 試劑（氯仿:正丁醇3:1），劇烈振蕩40 min，6000 r/min 離心5 min 除蛋白層，吸取上清，重復(fù)進(jìn)行Sevage 去蛋白操作，直至無法去除蛋白層。除蛋白后樣液用5000 d 透析袋透析，流水透析1 d，純水1 d，透析液用3 倍體積無水乙醇醇沉，4 ℃冰箱靜置過夜。6000 r/min 離心5 min 分離沉淀，分別用丙酮，乙醚洗滌2 遍，真空冷凍干燥得純化多糖[20-22]。

1.2.5 多糖成分測定分析

1.2.5.1 基本成分測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，采用苯酚-硫酸法測定總糖含量[23]；以半乳糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，采用咔唑-硫酸比色法測量糖醛酸含量[21]；以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，采用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白質(zhì)含量[24]。

1.2.5.2 百合多糖紅外光譜分析 采用傅里葉紅外色譜法，稱取1.00 mg 完全干燥的多糖樣品，與100 mg完全干燥的KBr 粉末在瑪瑙研缽中研磨均勻，后壓片，用傅里葉變換紅外色譜儀FT-IR 進(jìn)行紅外掃描，掃描范圍 4000～400 cm-1。

1.2.6 體外抗氧化活性測定

1.2.6.1 ABTS+自由基清除率測定 配制多糖樣品溶液（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/mL）。使用ABTS+自由基試劑盒進(jìn)行測定，在734 nm 測吸光值，VC為對照。

式中：A空白：空白對照吸光度；A測定：樣品溶液吸光度。

1.2.6.2 DPPH 自由基清除率測定 配制多糖樣品溶液（0.50、1.00、2.00、5.00、10.00 mg/mL）。使用DPPH 自由基試劑盒進(jìn)行測定，在避光反應(yīng)20 min后6000 r/min 離心1 min 取上清在517 nm 處測定吸光度，VC為對照。計算公式如下：

式中：A空白：空白對照吸光度；A測定：樣品溶液吸光度。

1.2.7 胰脂肪酶抑制率測定 胰脂肪酶測定參考何執(zhí)中等[25]的方法略作改動。取若干錐形瓶，加入5 ml pH 為7.5 的0.025 mol/L 的磷酸緩沖液，將其和橄欖油乳化液于40 ℃預(yù)熱5 min，劇烈振蕩乳化液，取乳化液4 mL 加入錐形瓶，加入1 mL 0.02 g/mL胰脂肪酶，加入酶液開始計時，繼續(xù)保溫5 min。取出后立即加入95%乙醇15 mL，終止酶反應(yīng)。加入3 滴酚酞指示劑，用0.0025 mol/L 氫氧化鈉滴定至溶液呈粉紅色為止，記錄氫氧化鈉消耗量。空白組脂肪酶替換1 mL 蒸餾水。奧利司他做陽性對照。

式中：A：平行組消耗氫氧化鈉滴定液的平均體積，mL；B：空白試驗消耗氫氧化鈉的體積，mL；M：氫氧化鈉滴定的摩爾濃度，mol/L；W：脂肪酶的取樣量，g；T 為反應(yīng)時間，min。

胰脂肪酶抑制活性測定：預(yù)熱完畢后，向測定組和對照組加入抑制劑1 mL，再向測定組加1 mL 脂肪酶，對照組加1 mL 蒸餾水，反應(yīng)5 min，操作同胰脂肪酶抑制率測定。試驗重復(fù)3 次。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有測定指標(biāo)均作3 次平行處理，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。實驗數(shù)據(jù)用IBM SPASS Statistics 26 軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)分析采用Origin 9.2 軟件進(jìn)行分析。方差分析采用（one-way AVONA）進(jìn)行顯著性檢驗，顯著水平P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 超聲輔助提取龍牙百合粗多糖

2.1.1 單因素實驗 從圖1a 中可以看出，其他條件一致的情況下，在料液比1:10 到1:20 g/mL 時，龍牙百合粗多糖得率隨著料液比的增大略有下降。當(dāng)料液比是1:25 g/mL 時，粗多糖得率達(dá)到最大值9.21%，這可能是隨著溶劑用量增大，植物內(nèi)部細(xì)胞與外部溶劑充分接觸，有利于多糖物質(zhì)快速溶出[26]。當(dāng)料液比為1:30 g/mL 時，多糖得率開始下降，這是因為隨著溶劑的增多，多糖溶量達(dá)到飽和，水溶劑與植物內(nèi)部物質(zhì)分子相互作用可能已經(jīng)減弱[27]，水溶劑用量過大使得后面處理過程中多糖損失增大，多糖得率反而下降[28]。因此，料液比選擇1:25 g/mL。

圖1 料液比、浸提時間、浸提溫度對多糖得率的影響Fig.1 Effects of material-to-water ratio, time and temperature on the yield of polysaccharide

從圖1b 中可以看出，其他條件一致的情況下，在5 到20 min 時龍牙百合粗多糖得率隨著浸提時間的增加而呈現(xiàn)上升趨勢，在20 min 的時候多糖得率達(dá)到最大值8.95%。當(dāng)浸提時間為25 min 時，多糖得率明顯下降，這可能是由于超聲具有強(qiáng)剪切作用，使大分子多糖糖苷鍵斷裂[29]，過長的浸提時間導(dǎo)致?lián)p失變大。因此，適宜超聲提取時間在20 min。

從圖1c 中可以看出，其他條件一致的情況下，在35 到45 ℃時龍牙百合粗多糖的得率隨著浸提溫度升高而明顯提高，在45 到65 ℃時龍牙百合粗多糖得率平緩上升，當(dāng)浸提溫度為65 ℃時，多糖得率達(dá)到最大值9.18%。當(dāng)溫度為75 ℃時，多糖得率呈現(xiàn)明顯下降趨勢，一方面可能是溫度過高使得多糖降解[30]，另一方面，是溫度過高使得其他物質(zhì)溶出，增加了溶液的粘稠度，阻礙了多糖溶出[31]。因此，浸提溫度選擇65 ℃。

2.1.2 正交試驗提取優(yōu)化 根據(jù)上述單因素實驗，以料液比、浸提時間、浸提溫度為影響因素，進(jìn)行三因素三水平的正交試驗，因素與水平見表1，試驗結(jié)果見表2。

表2 正交試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

由表2 可以看出，各因素對龍牙百合粗多糖提取得率影響主次順序為C（浸提溫度）＞B（浸提時間）＞A（料液比），即影響得率的最大因素是浸提溫度，其次是浸提時間，料液比影響較小。這與余倩莎等[32]熱水浸提法的研究結(jié)果：提取溫度＞料液比＞提取時間不同，可能是在超聲的作用下，多糖在溶劑較少時也能充分析出，使得料液比的影響變小。龍牙百合粗多糖提取的最佳工藝組合為A2B3C3，即料液比1:20，提取時間20 min，浸提溫度75 ℃。以此條件進(jìn)行試驗，粗多糖得率達(dá)11.98%，轉(zhuǎn)化為多糖提取率后為7.00%。這在結(jié)果上比余倩莎等[32]使用熱水浸提法優(yōu)化后工藝：提取溫度60 ℃，料液比1:5 g/mL，提取時間30 min，提取次數(shù)5 次，提取龍牙百合多糖提取率6.27%要高，且超聲輔助提取明顯比熱水浸提法效率也更高。因此選擇料液比1:20 g/mL，浸提時間20 min，浸提溫度75 ℃為龍牙百合粗多糖最佳提取工藝。

2.2 龍牙百合多糖結(jié)構(gòu)特性分析

2.2.1 化學(xué)組成 龍牙百合粗多糖及去蛋白多糖化學(xué)組成如表3 所示。龍牙百合粗多糖的總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量分別為58.46%、8.06%和10.85%，去蛋白后總糖、糖醛酸和蛋白質(zhì)含量分別為84.78%，15.41%和4.73%，較陳小蒙等[21]采用相同方法的蛋白脫除率低，這可能是在具體脫除蛋白過程中Sevege試劑組成成分比例不同。

表3 龍牙百合多糖化學(xué)組成Table 3 Chemical composition of Lilium brownii var.viridulum polysaccharides

2.2.2 紅外光譜分析 龍牙百合多糖的傅里葉紅外光譜圖見圖2。吸收光譜在3392.78 和2927.46 cm-1處有強(qiáng)且寬的的吸收峰，是多糖上的O-H 形成分子間、內(nèi)氫鍵和C-H 伸縮振動的信號[33]；1649.44 和1421 cm-1處的強(qiáng)吸收峰分別是由C=O彎曲震動和C-H 彎曲震動引起，表明多糖為酸性多糖[34]，這與化學(xué)組成測定中存在糖醛酸相符；在1377～1240 cm-1處吸收峰由糖的C-H 變角震動引起，它和C-H 鍵的伸縮振動構(gòu)成了糖類的特征吸收峰[21]；1249.23 cm-1附近的吸收峰應(yīng)為磺酸基的S=O 伸縮震動峰，證明了多糖組分中有S 元素的存在，表明多糖中可能有硫酸根。1154.77、1026.36 cm-1兩個峰為吡喃糖環(huán)特征吸收峰，是其糖苷鍵C-O-C 的非對稱振動峰，是葡聚糖典型的紅外光譜信號[35]；紅外光譜在890 cm-1附近無吸收峰，而在807.68 cm-1附近形成峰表明多糖主要為α型糖苷鍵，且為吡喃己糖[36]，這與陳小蒙等[21]熱水提取法提取龍牙百合多糖研究結(jié)果一致。

圖2 龍牙去蛋白多糖的傅里葉變換紅外光譜圖Fig.2 FIIR spectrum of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum

2.3 龍牙百合去蛋白多糖功能特性分析

2.3.1 抗氧化活性分析 由圖3a 可知，龍牙百合去蛋白多糖具有一定的DPPH 自由基清除作用，清除能力弱于陽性對照VC。隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對DPPH 自由基的清除能力逐漸強(qiáng)。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL時，其對DPPH 自由基的清除率達(dá)8.75%。龍牙百合去蛋白多糖在質(zhì)量濃度在10 mg/mL 時顯著低于李化強(qiáng)等對龍牙百合精制多糖和粗多糖對DPPH 自由基清除率的研究[37]，這可能是由于材料、超聲提取條件和純化程度差異造成的。

圖3 龍牙百合去蛋白多糖DPPH 和ABTS+自由基清除率測定Fig.3 Scavenging ability of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum against DPPH and ABTS+ radical

由圖3b 可知，龍牙百合去蛋白多糖具有良好的ABTS+自由基清除作用，清除能力弱于陽性對照VC。隨著多糖溶液質(zhì)量濃度的增加，對ABTS+自由基的清除率呈上升趨勢。當(dāng)多糖質(zhì)量濃度達(dá)到10 mg/mL 時，其對ABTS+自由基清除率達(dá)38.59%。

2.3.2 龍牙百合去蛋白多糖對胰脂肪酶抑制作用由圖4 可知，陽性對照奧利司他和龍牙百合去蛋白多糖隨著濃度的增加對胰脂肪酶的抑制率顯著增加，當(dāng)濃度大于2 mg/mL 時，龍牙百合去蛋白多糖對胰脂肪酶的抑制效果好于奧利司他。當(dāng)龍牙百合去蛋白多糖濃度在5 mg/mL 時，對胰脂肪酶的抑制率可達(dá)到86.22%，優(yōu)于蓮子紅衣多糖和黑木耳等中藥多糖[38-39]。這說明，龍牙百合去蛋白多糖對胰脂肪酶的抑制效果較好，具有降血脂藥物替代潛力。

圖4 龍牙百合去蛋白多糖對胰脂肪酶抑制率測定Fig.4 Effect of refined polysaccharides from Lilium brownii var. viridulum on pancreatic lipase activity

3 結(jié)論

本文以龍牙百合制成的干粉為原料，在超聲輔助條件下選擇料液比、浸提時間、浸提溫度進(jìn)行龍牙百合粗多糖制備單因素實驗，進(jìn)一步通過正交試驗對多糖制備條件進(jìn)行了優(yōu)化，獲得超聲輔助提取龍牙百合粗多糖的最佳提取工藝，為料液比1:20 g/mL，浸提時間20 min，浸提溫度75 ℃，該條件下的粗多糖得率為11.98%。去蛋白的龍牙百合多糖的總糖、糖醛酸、蛋白質(zhì)含量分別為84.78%、15.41%和4.73%，表明龍牙百合多糖中含有中性糖較多，去蛋白效果良好。紅外光譜分析表明，龍牙百合多糖是一種酸性多糖。龍牙百合多糖具有一定的抗氧化能力和良好降血脂能力，對胰脂肪酶的抑制率高達(dá)86.22%，具有開發(fā)降血脂食品藥品的潛力。研究結(jié)果為龍牙百合多糖開發(fā)抗氧化、降血脂功能食品提供理論依據(jù)，而不同提取方法對多糖抗氧化活性影響和體內(nèi)降血脂活性需進(jìn)一步研究探討。