程 艷，郭建偉，朱 斌，伊敏敏

（1.陜西省人民醫(yī)院麻醉科，陜西 西安710068；2.陜西省人民醫(yī)院手術(shù)一部，陜西 西安710068）

母體妊娠期精神壓力暴露不僅可能造成不良妊娠結(jié)局，更可能對子代神經(jīng)發(fā)育及認(rèn)知功能產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響。大量的實驗證明，妊娠期壓力暴露可導(dǎo)致不同程度的子代海馬結(jié)構(gòu)和功能損傷，包括海馬區(qū)域的神經(jīng)元數(shù)目減少、錐體神經(jīng)元頂端樹突萎縮、線粒體呼吸酶活性降低及線粒體膜電位降低等［1-7］。腦白質(zhì)（white matter，WM）主要由成束的有髓鞘或無髓鞘軸突和產(chǎn)生髓鞘的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞組成，WM 占人類總腦容量的近50%，WM 對于跨越不同腦區(qū)的電信號傳輸至關(guān)重要，因此WM 損傷可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)行為和認(rèn)知障礙［8，9］。近些年來的研究發(fā)現(xiàn)，認(rèn)知功能與腦白質(zhì)的發(fā)育及其完整性的維持有密切聯(lián)系，白質(zhì)的發(fā)育及占據(jù)白質(zhì)大部分的有髓神經(jīng)纖維髓鞘化過程發(fā)生于生命早期，恰與認(rèn)知技能和能力的出現(xiàn)相吻合。因此，有髓神經(jīng)纖維的形成和完善及WM 完整性的保持在生命早期認(rèn)知能力的發(fā)展中起到重要作用。

本研究擬通過壓力束縛SD 大鼠母體妊娠期壓力暴露模型，通過對子代鼠行為學(xué)及腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)測定，探究母體妊娠期精神壓力暴露是否損害子代鼠認(rèn)知功能及腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)，并探究認(rèn)知功能改變與腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)改變之間的關(guān)系，以期為進(jìn)一步臨床干預(yù)及治療策略提供理論依據(jù)，具有重要的理論研究價值。

1 材料與方法

1.1 動物實驗及其分組

親代鼠（KM SD 大鼠，購自西安交通大學(xué)動物實驗中心）分為壓力束縛暴露組（PE 組）和對照組（C 組）兩組，每組15 只雌性和5 只雄性SD 大鼠，將處女雌性SD 大鼠與雄性SD 大鼠（3∶1）放置過夜進(jìn)行交配，次日晨檢查雌性SD 大鼠陰道涂片，確定涂片為陽性的日期即為胚胎第0 天，然后將懷孕的雌性SD 大鼠分開飼養(yǎng)。壓力束縛暴露：妊娠第14～20 天每天3 次暴露與束縛壓力下，持續(xù)45 min～1 h/次。1 月齡子代鼠進(jìn)行行為學(xué)測試（Morris 水迷宮和Y 迷宮測試）。行為學(xué)測試完成后，子代鼠進(jìn)行4%水合氯醛（300～350 mg/kg，實驗室配置）腹腔注射麻醉后，行心臟灌注（生理鹽水+4%甲醛，西安赫特生物科技有限公司）固定腦標(biāo)本，待灌注良好后，取腦置入之前配制好的混合固定液（2%多聚甲醛+2.5%戊二醛，實驗室配置）中進(jìn)行標(biāo)本固定。將固定好的標(biāo)本進(jìn)行電鏡包埋，制作電鏡切片，使用現(xiàn)代體視學(xué)方法計算腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度及總體積和髓鞘總長度及總體積，以及對髓鞘的內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長進(jìn)行計算和分析。

1.2 母體妊娠期壓力束縛動物模型

約束裝置（實驗室自制）是一個直徑約6.8 cm的透明塑料管帶有呼吸孔和封閉端，長度可以調(diào)節(jié)以適應(yīng)動物的大小。妊娠SD 大鼠在妊娠第14～20天每天3 次暴露于束縛壓力下，持續(xù)45 min～1 h，每次壓力暴露的時間在時間段內(nèi)（08：00 am～11：00 am，11：00 am～02：00 pm 和04：00 pm～07：00 pm）隨機(jī)限制時間［10］。

1.3 子代鼠行為學(xué)測試

1.3.1 Morris 水迷宮 實驗所用水迷宮儀器（Morris 水迷宮分析系統(tǒng)Smart 軟件，中國成都泰盟），水池直徑約120 cm，平臺直徑約8 cm、高約15 cm，平臺有效區(qū)域直徑約10 cm，計算機(jī)可根據(jù)水池正中心上方的攝像頭自動追蹤并記錄小鼠的游泳過程。實驗前將圓形水池劃分成4 個象限，然后在每個象限確定一個入水點。在隨機(jī)一個象限正中放入平臺，控制水溫在（20.0±2.0）℃。在水中加入二氧化鈦染成乳白色且使水面沒過平臺1 cm 左右以免讓動物看清水下平臺。實驗小鼠的頭部均用苦味酸染色以便攝像機(jī)捕捉、記錄。測試共5 d，分為定位航行試驗（前4 d）和空間探索試驗（最后一天）兩部分。記錄定位航行試驗中小鼠每次試驗的潛伏期（即從小鼠進(jìn)水到其四肢全部站上平臺的時間），若小鼠超過90 s 還沒有站上平臺，其潛伏期則記為90 s。計算小鼠每天4 次試驗的平均潛伏期。記錄空間探索試驗中小鼠穿越平臺有效區(qū)域的次數(shù)以及其在平臺原本所處象限的滯留時間百分比。［11］

1.3.2 Y 迷宮測試 實驗所用Y 型迷宮（Y 迷宮分析系統(tǒng)Smart 軟件，中國成都泰盟）由灰色有機(jī)塑料制成，由3 個臂組成，相鄰臂之間的角度為120°，每個臂為8 cm×30 cm×15 cm（寬×長×高），計算機(jī)可根據(jù)迷宮正中心上方的攝像頭自動追蹤并記錄小鼠的探索過程；隨機(jī)指定3 個相同的臂：（1）起始臂，小鼠開始探索（始終打開）；（2）新穎臂，在第一次試驗期間被阻塞，但在第二次試驗期間打開；（3）其他臂（始終打開）；關(guān)閉新穎臂，將小鼠背向迷宮中心置入起始臂中，允許其在起始臂和其他臂中定向探索15 min；定向探索結(jié)束1 h 后，打開新穎臂，將小鼠背向迷宮中心置入起始臂中，允許小鼠在3 個臂中自由探索10 min；通過使用安裝迷宮正中上方的相機(jī)，所有試驗都記錄在錄像機(jī)上；隨后分析視頻記錄，并分析新穎臂中的探索距離、探索次數(shù)和探索時間。［12-14］

1.4 現(xiàn)代體視學(xué)方法測定腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)

（1）計算子代鼠大腦半球白質(zhì)的總體積：隨機(jī)選擇沿冠狀面的子代鼠腦切片數(shù)個，將等距點陣圖與切片隨機(jī)疊加，如圖1A 所示，在解剖顯微鏡（立體顯微鏡，日本尼康）下計數(shù)所有與白質(zhì)重疊的點∑PWM，計算白質(zhì)的總體積VWM（公式：VWM=t×a（p）×∑PWM，其中t 為連續(xù)切片的厚度，a（p）為與每個網(wǎng)格點相關(guān)的面積）［13，15-17］；（2）獲得電鏡照片：從選定的腦切片上獲得包含腦白質(zhì)的組織塊，進(jìn)行電鏡包埋，使用透射電鏡（H-7650 透射電子顯微鏡，日本Hitachi）觀察電鏡切片，每張切片上系統(tǒng)抽樣抽取5 個8 000×及10 個15 000×的視野［13］；（3）計算白質(zhì)中有髓纖維的長度密度和總長度：如圖1B 所示，將無偏計數(shù)框與8 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，計算白質(zhì)中有髓纖維的長度密度LV（mf/wm）（公 式：LV（mf/wm）=2×∑Q（mf）/［a（frame）×∑frame］，其中∑Q（mf）是通過無偏計數(shù)框計數(shù)得出的電鏡照片中有髓纖維的總個數(shù)，a（frame）為單個無偏計數(shù)框的面積，∑frame 為計數(shù)框的總個數(shù)。）和總長度L（mf，wm）（公式：L（mf，wm）=LV（mf/wm）×VWM）［13，15，18］；（4）計算白質(zhì)中有髓纖維的體積密度和總體積及髓鞘的體積密度和總體積：如圖1C 所示，將等距點陣圖與8 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，計數(shù)所有落在白質(zhì)上的點數(shù)∑P（wm）、落在有髓纖維的點數(shù)∑P（mf）及落在髓鞘的點數(shù)∑P（ms），計算有髓纖維的體積密度VV（mf/wm）（公式：Vv（mf/wm）=∑P（mf）/∑P（wm））、髓鞘的體積密度VV（ms/wm）（公式：Vv（ms/wm）=∑P（ms）/∑P（wm））、有髓纖維的總體積V（mf，wm）（公式：V（mf，wm）=Vv（mf/wm）×VWM）及髓鞘的總體積V（ms，wm）（公式：V（ms，wm）=Vv（ms/wm）×VWM）［13］；（5）計算有髓纖維內(nèi)直徑與外直徑：如圖1D 所示，將無偏計數(shù)框與15 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無偏計數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面。通過測量垂直于有髓纖維最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的外直徑，通過測量垂直于軸突最長軸的最長輪廓直徑來估算有髓纖維的內(nèi)直徑，測量內(nèi)、外直徑及計算內(nèi)、外直徑的比值和差值［13，17，19］；（6）計算有髓纖維內(nèi)周長及外周長：如圖1E 所示，將無偏計數(shù)框及等距平行線與15 000×電鏡照片隨機(jī)疊加，確定落在無偏計數(shù)框內(nèi)的神經(jīng)纖維斷面，計算斷面內(nèi)有髓纖維的內(nèi)周長或外周長b（ms）（公式：b（ms）=π/2×d×∑I，其中d 為等距平行線間的垂直距離，∑I 為等距平行線與落在無偏計數(shù)框內(nèi)的髓鞘內(nèi)緣界線或外緣界線交叉的總點數(shù)。），進(jìn)而計算內(nèi)、外周長的比值和差值［13，16，19］。

圖1 腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)的體視學(xué)研究Fig 1 White matter and its ultrastructure calculation

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗數(shù)據(jù)使用SPSS23.0 進(jìn)行統(tǒng)計分析。首先對各組數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性檢驗，若滿足正態(tài)性則用參數(shù)檢驗，若不滿足正態(tài)性則用非參數(shù)檢驗（秩次檢驗）；參數(shù)檢驗使用獨立樣本T 檢驗。P＜0.05 時認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實驗期間親代鼠及子代鼠體重分析

親代鼠選取妊娠第0 天、14 天、20 天，子代鼠選取出生第0 天、15 天、30 天，進(jìn)行體重統(tǒng)計分析。如圖2A 所示，親代鼠妊娠第0 天、14 天、20 天體重：C組 分 別 為 （223.67±10.54）g，（245.87±13.72）g，（251.60±8.86）g，PE 組分別為（226.33±13.14）g，（242.93±10.16）g，（254.2±13.88）g，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。如圖2B 所示，子代鼠出生第0 天、15 天、30 天 體 重：C 組 分 別 為（6.04±0.82）g，（34.88±2.84）g，（73.39±4.62）g，PE 組 分 別 為（6.05±0.76）g，（39.78±2.78）g，（75.19±3.59）g，兩組間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

圖2 兩組親代鼠與子代鼠實驗期間體重比較Fig 2 Weight comparison between the two groups of parent mice and offspring mice during the experiment

2.2 母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠認(rèn)知功能

如圖3 所示，在Morris 水迷宮定位航行試驗中，C 組 小 鼠4 天 潛 伏 期 分 別 為（57.24±12.84）s，（61.09±12.24）s，（34.48±4.78）s，（23.65±5.53）s，PE 組 小 鼠 潛 伏 期 分 別 為（63.60±8.30）s，（53.55±12.56）s，（65.36±6.59）s，（65.79±6.02）s。第3 天（F=9.72，t=-25.32，P＜0.05）與第4 天（F=0.86，t=-34.23，P＜0.05），與C 組小鼠相比，PE 組小鼠潛伏期顯著性延長。如圖4 所示，在Morris 水迷宮空間探索試驗中，C 組與PE 組小鼠穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)分別為3.39±1.26 次，0.90±0.82次，平臺所在象限滯留時間百分比分別為（26.48±4.19）%，（20.33±2.98）%。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)（F=21.95，t=10.88，P＜0.05）和平臺所在象限滯留時間百分比顯著性減少（F=7.60，t=7.87，P＜0.05）。如圖5 所示，C 組與PE 組小鼠Y 迷宮新穎臂探索距離分別為（43.59±4.52）cm，（111.86±18.92）cm，探索次數(shù)分別為24.78±3.85 次，77.69±9.91 次，探索時間分別為（123.89±14.59）s，（198.07±11.75）s。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠Y 迷宮新穎臂探索距離（F=86.79，t=-23.76，P＜0.05）、探索次數(shù)（F=54.80，t= - 33.57，P＜0.05）及 探 索 時 間（F=4.09，t=-26.11，P＜0.05）明顯增加。

圖3 兩組子代鼠Morris 水迷宮定位航行試驗潛伏期比較Fig 3 Comparison of the time latencies of the Morris water maze positioning navigation test of offspring mice between two groups

圖4 兩組子代鼠Morris 水迷宮空間探索試驗平臺所在象限滯留時間百分比和穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)比較Fig 4 Comparison of the target zone frequency and percentage of time in target zone of the Morris water space exploration test of offspring mice between two groups

圖5 兩組子代鼠Y 迷宮探索結(jié)果Fig 5 Y-maze exploration results between two groups

2.3 母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)

如圖6 所示，C 組與PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積分別 為（283.2±19.83）mm3，（180.69±6.11）mm3；有髓神經(jīng)纖維總長度分別為（10 466.87±831.92）mm，（6 091.29±181.08）mm；有髓神經(jīng)纖維總體積分 別 為（32 079.50±1 091.68）mm3，（30 411.31±965.28）mm3，髓 鞘 總 體 積 分 別 為（8 045.91±153.91）mm3，（6 813.07±58.86）mm3。與C 組小鼠相比，PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積（F=51.40，t=32.13，P＜0.05）、有髓神經(jīng)纖維總長度（F=75.19，t=33.36，P＜0.05）、有髓神經(jīng)纖維總體積（F=0.27，t=7.56，P＜0.05））、髓 鞘 總 體 積（F=37.07，t=48.74，P＜0.05）明顯下降。為了進(jìn)一步探究有髓神經(jīng)纖維髓鞘具體變化，對髓鞘內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長進(jìn)行分析，如表1 所示，與C 組小鼠相比，PE 組小鼠髓鞘內(nèi)直徑（F=21.54，t=17.60，P＜0.05）、外直徑（F=11.20，t=23.22，P＜0.05）明顯下降，內(nèi)周長（F=.39，t=5.62，P＜0.05）、外 周 長（F=13.02，t=- 8.12，P＜0.05）及 內(nèi) 外 周 長 差（F=2.87，t=-9.15，P＜0.05）明顯增加。

表1 兩組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的體視學(xué)分析結(jié)果（）Tab 1 Results of stereoscopic analysis of myelin nerve fiber myelin sheath in the white matter of the brain hemispheres between two groups（）

表1 兩組小鼠大腦半球白質(zhì)內(nèi)有髓神經(jīng)纖維髓鞘的體視學(xué)分析結(jié)果（）Tab 1 Results of stereoscopic analysis of myelin nerve fiber myelin sheath in the white matter of the brain hemispheres between two groups（）

注：與C 組相比，*P＜0.05。

項目外直徑（μm）內(nèi)直徑（μm）內(nèi)外直徑差（μm）內(nèi)外直徑比外周長（μm）內(nèi)周長（μm）內(nèi)外周長差（μm）內(nèi)外周長比PE 組1.18±0.01*1.08±0.01*0.05±0.01 0.92±0.01 21 241.82±177.47*18 353.87±220.57*2 887.95±298.40*0.86±0.01 C 組1.25±0.02 1.15±0.02 0.05±0.01 0.91±0.02 20 977.23±125.77 18 602.64±194.72 2374.60±225.59 0.89±0.01

圖6 不同實驗組大腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)結(jié)果比較Fig 6 Comparison of brain white matter and its ultrastructure between two groups

2.4 腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)與子代鼠行為學(xué)損害負(fù)相關(guān)

如圖7 所示，腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與第3 天及第4 天Morris 水迷宮定位航行試驗潛伏期、Y 迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)和探索時間與負(fù)相關(guān)，與Morris 水迷宮空間探索試驗平臺所在象限滯留時間百分比和穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)正相關(guān)。

圖7 行為學(xué)測試結(jié)果與腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)改變相關(guān)分析Fig 7 Correlation analysis of behavioral test results & white matter and its ultrastructural changes

3 討論

壓力暴露與大腦損傷及認(rèn)知功能障礙密切相關(guān)［4，20］，Sapolsky 等［21］研究發(fā)現(xiàn)，壓力暴露參與神經(jīng)系統(tǒng)，特別是邊緣系統(tǒng)的可塑性，其提出，嚴(yán)重和/或長期壓力削弱海馬依賴性顯式學(xué)習(xí)的能力及其基礎(chǔ)的可塑性。在動物和人類中均已記錄到母體妊娠期壓力暴露對胎兒神經(jīng)發(fā)育的負(fù)面影響以及長期的情緒和行為障礙［1］。在動物實驗中，發(fā)現(xiàn)遭受妊娠期壓力暴露的子代小鼠杏仁核發(fā)育出現(xiàn)差異，表明該暴露可能是子代小鼠出現(xiàn)恐懼相關(guān)行為（如焦慮癥狀）的誘發(fā)因素［2］；而在恒河猴的懷孕早期和晚期，暴露于產(chǎn)前壓力可以抑制胎盤早熟，且在海馬齒狀回中發(fā)現(xiàn)神經(jīng)發(fā)生和海馬體積的減少［22］；Yang 等［3］發(fā)現(xiàn)，妊娠期壓力暴露可能會導(dǎo)致子代鼠海馬CA1 區(qū)長期增強(qiáng)功能受損并長期處于抑制狀態(tài)，而這種突觸可塑性的改變可能與子代鼠空間學(xué)習(xí)和記憶受損有關(guān)。本研究將親代鼠分為PE 組和C 組，PE 組親代雌鼠妊娠第14～20 天暴露于束縛壓力（3 次/d），持續(xù)45 min～1 h/次，對1 月齡子代鼠進(jìn)行Morris 水迷宮和Y 迷宮測試，Morris 水迷宮檢測的被認(rèn)為是動物的空間參考記憶最為經(jīng)典的行為學(xué)檢測方法，Y 迷宮任務(wù)是用于測量空間識別記憶的雙試驗識別測試，研究發(fā)現(xiàn)，與C 組相比，PE 組小鼠第3、4 天Morris 水迷宮定位航行試驗潛伏期顯著延長、空間探索試驗平臺所在象限滯留時間百分比和穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)顯著減少，Y迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)及探索時間明顯增加，實驗結(jié)果提示母體妊娠期精神壓力暴露損害子代鼠認(rèn)知功能，研究結(jié)果與以往的動物研究發(fā)現(xiàn)一致。

人體研究發(fā)現(xiàn)，母親的妊娠期壓力暴露與孩子的運動和智力發(fā)育延遲以及語言能力較弱之間存在關(guān)聯(lián)。Huizink 等［23］利用Bayley 嬰兒發(fā)育量表發(fā)現(xiàn)，母親較高的每日煩惱（壓力）和焦慮水平都是導(dǎo)致孩子智力低下的獨立危險因素，且妊娠中期壓力暴露可能是8 個月大嬰兒運動和智力發(fā)育延遲的決定因素之一，并且可能是以后出現(xiàn)發(fā)育問題的危險因素［23］；在一項針對加拿大魁北克在嚴(yán)重冰暴中懷孕的婦女的研究發(fā)現(xiàn)，母親經(jīng)歷的客觀壓力（包括傷害，損失和變化）與Bayley 量表的較低得分以及其2 歲幼兒的語言能力較低有關(guān)［24］。在使用動物進(jìn)行的對照實驗中，目前引入的妊娠期精神壓力暴露應(yīng)激因子，包括約束、慢性音譯、固定化、隔離、社會壓力以及急性感覺或情緒緊張等，其中壓力限制（及約束）模型應(yīng)用最為廣泛［10］。因此，本研究應(yīng)用母體妊娠期壓力束縛動物模型發(fā)現(xiàn)，母體妊娠期精神壓力暴露可明顯損害子代鼠認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)記憶能力，研究結(jié)果與以往的動物研究發(fā)現(xiàn)一致。如果孕鼠在妊娠期間暴露于重度壓力，可能會對胎兒產(chǎn)生負(fù)面影響。研究表明，重度壓力可以影響孕鼠的生理和行為狀態(tài)，進(jìn)而對胎兒的發(fā)育產(chǎn)生不良影響，如胎兒發(fā)育受限，原因肯能是重度壓力可能導(dǎo)致孕鼠體內(nèi)產(chǎn)生應(yīng)激激素，如皮質(zhì)醇，高水平的皮質(zhì)醇可能穿過胎盤進(jìn)入胎兒體內(nèi)，影響其發(fā)育，這可能導(dǎo)致胎兒生長受限，出生時體重較輕［25］。孕鼠妊娠期重度壓力暴露是指孕鼠在妊娠期間暴露于高強(qiáng)度、長時間的應(yīng)激刺激。這種應(yīng)激刺激可以包括各種實驗室條件下對孕鼠施加的壓力或應(yīng)激性刺激，如電擊、噪音、冷水浸泡等，這些刺激可能導(dǎo)致孕鼠產(chǎn)生生理和行為上的應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而對孕鼠和胎兒的生理狀態(tài)和發(fā)育產(chǎn)生影響［25，26］。本研究兩組間子代鼠出生后體重差異無統(tǒng)計學(xué)意義，可能與暴露強(qiáng)度和暴露時間有關(guān)，本實驗孕期精神束縛壓力暴露程度遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于重度壓力暴露。

在受孕后，胎兒的大腦開始形成，隨著孕期的進(jìn)展，胎兒的WM 也逐漸發(fā)生變化。WM 是大腦中的一種組織類型，由神經(jīng)纖維束組成，主要負(fù)責(zé)傳遞神經(jīng)信號。在受孕后的第3 周，神經(jīng)管開始形成，神經(jīng)管是胎兒中樞神經(jīng)系統(tǒng)的前體，最終發(fā)展成腦和脊髓，WM 的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)開始形成；在受孕后的第6～12 周，神經(jīng)細(xì)胞開始從胎兒的腦室區(qū)域遷移到其他區(qū)域，這個過程是大腦皮層形成的關(guān)鍵步驟，也是WM 發(fā)展的關(guān)鍵階段；在受孕后的第12 周后，神經(jīng)細(xì)胞開始形成髓鞘，這是一種覆蓋神經(jīng)纖維的脂質(zhì)層，髓鞘對于神經(jīng)信號的傳導(dǎo)非常重要，它增強(qiáng)了神經(jīng)沖動的傳遞速度，這個過程對WM 的發(fā)展至關(guān)重要；在胎兒發(fā)育的后期階段，神經(jīng)細(xì)胞的連接增加，并且神經(jīng)元進(jìn)一步分化，這些神經(jīng)元之間的連接形成了復(fù)雜的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)，支持各種認(rèn)知和運動功能［27，28］。當(dāng)脂質(zhì)髓鞘形成在神經(jīng)元軸突周圍時，其作用是增加電脈沖的傳導(dǎo)速度，從而改善大腦的連通性，髓鞘化在整個兒童早期（生命的前5年）迅速發(fā)展。這種個體發(fā)生模式受到神經(jīng)活動的嚴(yán)格調(diào)控，并且與認(rèn)知技能和能力的出現(xiàn)相吻合，有髓神經(jīng)纖維的形成和完善及WM 完整性的保持在嬰幼兒認(rèn)知能力的發(fā)展中起到重要作用［9，29］。本研究發(fā)現(xiàn)，與C 組相比，PE 組小鼠腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度及總體積、髓鞘總體積明顯下降，對有髓神經(jīng)纖維的內(nèi)外直徑及內(nèi)外周長的進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，PE 組子代小鼠髓鞘內(nèi)外直徑明顯下降，內(nèi)周長明顯下降而外周長明顯增加，提示生命早期腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)受損可能與認(rèn)知功能損害有關(guān)，與以往研究一致。本研究對子代鼠行為學(xué)測試結(jié)果與腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)改變相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，腦白質(zhì)總體積、有髓神經(jīng)纖維總長度、有髓神經(jīng)纖維總體積、髓鞘總體積與第3 天及第4 天Morris水迷宮定位航行試驗潛伏期、Y 迷宮新穎臂探索距離、探索次數(shù)和探索時間與負(fù)相關(guān)，與Morris 水迷宮空間探索試驗平臺所在象限滯留時間百分比和穿越平臺有效區(qū)域次數(shù)正相關(guān)。因此，母體妊娠期精神壓力暴露，可能通過損害生命早期腦白質(zhì)的發(fā)展、形成及髓鞘化過程，而損害子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)，并進(jìn)而降低子代鼠認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力。以往研究雖然提出腦白質(zhì)的形成、發(fā)展及其髓鞘化過程對認(rèn)知功能可能有重要影響，但未從腦白質(zhì)超微結(jié)構(gòu)角度進(jìn)行相關(guān)研究，本研究利用現(xiàn)代體視學(xué)三維定量測量方法，揭示生命早期腦白質(zhì)損害與認(rèn)知功能下降之間的關(guān)系，具有創(chuàng)新性和研究價值。

綜上所述，母體妊娠期精神壓力暴露可損害子代鼠認(rèn)知功能及腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)，且認(rèn)知功能與腦白質(zhì)間存在相關(guān)關(guān)系。白質(zhì)中固有的抗氧化性能可能相對較低［30，31］，而富含脂質(zhì)和蛋白質(zhì)的髓鞘可以為過氧化反應(yīng)提供豐富的底物而導(dǎo)致大量ROS 的產(chǎn)生。氧化應(yīng)激本身可能導(dǎo)致膜完整性破壞，如脂質(zhì)過氧化可能與滑膜膜中磷脂不對稱性的喪失有關(guān)［32］。有髓神經(jīng)纖維髓鞘主要由OLs 構(gòu)成，有研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)OLs 和OPC 的細(xì)胞死亡［33］，或抑制少突膠質(zhì)細(xì)胞祖細(xì)胞的分化即其破壞OLs 的成熟［34］，因此氧化應(yīng)激可能通過破壞髓鞘結(jié)構(gòu)而影響WM 的傳導(dǎo)功能，進(jìn)而導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙。氧化應(yīng)激在腦白質(zhì)損害影響認(rèn)知功能中有重要作用，但本研究未測定腦內(nèi)氧化應(yīng)激水平，后續(xù)可進(jìn)一步研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

程艷：參與研究設(shè)計、實驗設(shè)置、數(shù)據(jù)采集、數(shù)據(jù)分析和解釋以及撰寫本文；郭建偉：在解釋數(shù)據(jù)、修改手稿和構(gòu)思想法方面做出了貢獻(xiàn)；朱斌：參與完成動物實驗水迷宮和Y 迷宮測試；伊敏敏：參與子代鼠腦白質(zhì)及其超微結(jié)構(gòu)的計算過程。

所有作者聲明不存在利益沖突關(guān)系。