王斯彤，張雨欣，高英旭，劉怡菲，赫 亮，黃 夏，陳 罡

（1.遼寧省林業(yè)科學研究院，沈陽 110032；2.遼寧大學輕型產(chǎn)業(yè)學院，沈陽 110036）

軟棗獼猴桃（Actinidia arguta）為獼猴桃科，獼猴桃屬多年生落葉攀緣藤本植物[1]。其果實中富含大量的維生素及活性成分，且根莖也是良好的藥材，具有較好的藥用價值[2]。黃酮是黃酮類化合物的總稱，是軟棗獼猴桃的主要生物活性成分之一，廣泛存在于自然界中，不僅對植物的生長發(fā)育中起著重要的作用，還具有多種藥用價值[3-5]，如抗氧化[6]、抗炎[7]、抗癌[8]和免疫調(diào)劑[9]等。許多研究發(fā)現(xiàn)，水果蔬菜中的黃酮類化合物能夠抑制炎癥蛋白的表達和炎癥細胞因子的分泌，是天然的炎癥抑制劑[10]。除果實內(nèi)含有大量的黃酮，張雨欣等[11]在軟棗獼猴桃莖中提取到了黃酮，并發(fā)現(xiàn)莖中黃酮含量與果實相差不大。因此，可以充分利用果樹的枝條進行黃酮的提取，增加原材料的來源，達到植物資源綜合利用的目的。

但提取后的莖黃酮中存在大量的可溶性糖和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，大孔吸附樹脂在中草藥化學成分的純化中有獨特的優(yōu)勢和作用[12]。大孔吸附樹脂具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，利用被分離物質(zhì)與大孔吸附樹脂的親和力不同，再用合適的洗脫劑吸附在樹脂上的目標組分洗脫下來[13]，并且大孔吸附樹脂成本低易再生，被廣泛應用于類黃酮等活性成分的富集[14-15]。片劑是目前臨床應用比較廣泛的劑型之一，選擇適宜的輔料和輔料配比決定是否能夠壓出合格的片劑[16]。因此，本研究探討大孔吸附樹脂對軟棗獼猴桃莖黃酮粗提液進行分離純化的最佳條件，并比較不同輔料及黃酮的添加量對片劑的影響，通過正交試驗優(yōu)化片劑制作工藝，以期為軟棗獼猴桃莖黃酮資源的開發(fā)與利用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

軟棗獼猴桃莖黃酮純化的試驗材料來自張雨欣等[6]通過響應面法從軟棗獼猴桃莖中提取的黃酮粗提液。經(jīng)過純化的黃酮用于片劑的制備。

1.2 方法

1.2.1 試劑制備 將黃酮粗提液旋蒸至較小體積，加入3倍無水乙醇，經(jīng)過靜置、離心取上清液，以去除雜質(zhì)。上清液旋蒸、冷凍干燥后備用。

1.2.2 AB-8大孔吸附樹脂的預處理 新樹脂使用前須進行反復清洗，先從柱底進水，頂部排出，清洗1 h后關閉進水閥，反洗結(jié)束。靜置30 min后，待樹脂落下后可進行正洗，從柱頂進水（流速同反洗時流速），從柱底排出，時間為1 h，清洗干凈后樹脂處于待用狀態(tài)。水洗后再經(jīng)酸-堿-醇處理，處理步驟參照王晉[17]的報道進行處理。

1.2.3 AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附與解析試驗 取AB-8大孔吸附樹脂3.0 g于三角瓶中，再加入50 mL黃銅粗提液，將三角瓶置于搖床中震蕩4～10 h，每30 min取1 mL黃酮液測定濃度，繪制靜態(tài)吸附曲線，公式參考1.5。將上述吸附飽和后的大孔吸附樹脂與黃酮粗提液通過抽濾分離，將大孔吸附樹脂加入三角瓶中，再加入50 mL80%乙醇溶液，將三角瓶置于搖床中震蕩4～10 h，每過30 min取1 mL黃酮液并測定其濃度，繪制靜態(tài)解析曲線[18]，公式參考1.5。

靜態(tài)吸附和解析方法參照金科旭等[18]的方法進行試驗。

1.2.4 AB-8大孔吸附樹脂的動態(tài)吸附與解析條件的確定 動態(tài)泄漏曲線：將AB-8大孔吸附樹脂置玻璃層析柱中，取0.63 mg·mL-1的樣品溶液以3 mL·min-1的流速進行上樣，收集流出物，并測量其總黃酮濃度。當濃度達到樣品的1/10時，達到泄漏點，根據(jù)流出物化合物濃度繪制動態(tài)泄漏曲線。

動態(tài)洗脫曲線：方法同動態(tài)泄漏曲線，上樣完畢后用水洗脫，再用80%乙醇洗脫樹脂上的黃酮。每10 mL流出液測定黃酮含量及解析率。制作解析率隨洗脫體積變化的圖像，得到最佳洗脫量。

水洗劑用量的確定：先進行上樣，上樣完畢用水洗脫，繪制黃酮損失量隨水洗體積變化的圖像，當黃酮損失量為0時的水洗量為最佳水洗劑用量。

使用同樣的方法，在其他條件相同的情況下，對比不同上樣濃度（0.43，0.53，0.63，0.72，0.82 mg·mL-1）、上樣流速（1，2，3，4，5 mL·min-1）、上樣液pH 值（2，3，4，5，6，7，8）、洗脫液流速（2，3，4，5，6 mL·min-1）、洗脫液濃度（乙醇濃度分別為40%、50%、60%、70%、80%、90%）等對黃酮吸附和解析率的影響，并繪制變化曲線。

1.3 高效液相色譜鑒定

色譜條件和標準品溶液的制備參照何艷等[19]的方法，分別取一定量的粗黃酮樣品和純化后的黃酮樣品用甲醇溶解，再用0.45 μm微孔濾膜過濾即得樣品溶液。

1.4 軟棗獼猴桃莖黃酮片劑的制備

1.4.1 片劑的制備方法 使用粉末直接壓片法制作片劑。

1.4.2 片劑各指標的測定方法 分別對片劑的外觀、片重、硬度、崩解時限進行測定，測定標準參照《中國藥典》（2020年版）[20]四部制劑通則項下規(guī)定。

1.4.3 片劑輔料的選擇 本研究添加的輔料為填充劑（淀粉、微晶纖維素）、崩解劑（羧甲基纖維素鈉、羧甲基淀粉鈉12%）、潤滑劑（硬脂酸鎂、滑石粉），在其他條件相同的情況下進行兩兩比較，篩選合適的輔料。

1.4.4 片劑各成分添加量的確定 在其他條件相同的情況下，分別選擇不同比例的黃酮（28%、33%、38%、43%、48%）、淀粉（28%、33%、38%、43%、48%）、羧甲基纖維素鈉（8%、10%、12%、14%、16%）、硬脂酸鎂（0.3%、0.5%、0.7%、0.9%、1.1%）、甘露醇（6%、11%、16%、21%、26%）加入片劑中，按照綜合評價標準的項目與評分進行打分。

1.4.5 片劑的評分標準 根據(jù)片劑的外觀、片重差異、硬度、崩解時限表現(xiàn)進行評分，其中，外觀總分為4分、片重差異總分為4分、硬度總分為6分、崩解時限總分為6分，最終總分為20分。分數(shù)越高代表片劑的質(zhì)量越好。

1.5 計算公式

式中：C0為黃酮粗提液濃度（mg·mL-1）；C1為樹脂吸附后三角瓶中黃酮的濃度（mg·mL-1）。

式中：C0為黃酮粗提液濃度（mg·mL-1）；C1為樹脂吸附后三角瓶中黃酮的濃度（mg·mL-1）；C2為樹脂吸附后三角瓶中黃酮的濃度（mg·mL-1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 AB-8大孔樹脂對軟棗獼猴桃莖黃酮的靜態(tài)吸附與解析曲線

通過在AB-8 大孔樹脂對軟棗獼猴桃莖黃酮的靜態(tài)吸附與解析的實驗研究中發(fā)現(xiàn)，隨著吸附和解析時間的延長，吸附率和解析率都逐漸增大，達到飽和點后又趨于恒定。靜態(tài)吸附曲線在0～2 h時由于內(nèi)外物質(zhì)濃度差較大，樹脂表面的吸附位點較多，黃酮類化合物迅速被樹脂吸附，吸附曲線較陡（圖1）。2 h后隨著樹脂接近吸附飽和狀態(tài)，表面可吸附位點減少，吸附速率增長緩慢，當吸附時間達到4 h 后，吸附率接近恒定，達到61.35%。靜態(tài)解析曲線隨著時間的延長解析速率逐漸增大（圖2），3.5 h 后趨于恒定，最大解析液濃度為70.64%。通過分析發(fā)現(xiàn)，AB-8大孔吸附樹脂對軟棗獼猴桃莖黃酮的吸附與解析能力均較好，適合用于軟棗獼猴桃莖黃酮類物質(zhì)的純化。

圖1 AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)吸附曲線Figure 1 Static adsorption curve of AB-8 macroporous adsorption resin

圖2 AB-8大孔吸附樹脂的靜態(tài)解析Figure 2 Static analytical curve of AB-8 macroporous adsorption resin

2.2 AB-8大孔吸附樹脂對軟棗獼猴桃莖黃酮的動態(tài)吸附與解析試驗

2.2.1 動態(tài)泄漏曲線的繪制 由圖3可知，樣品體積從0～20 mL的過程中，流出液中黃酮類化合物的濃度趨近于0，說明樣品溶液中的黃酮類化合物可以被樹脂完全吸附。當樣品體積為25 mL時，流出黃酮濃度達到0.063 mg·mL-1，是樣品濃度的1/10，達到AB-8大孔吸附樹脂的泄漏點。因此，選擇25 mL作為最終樣品體積。

圖3 AB-8大孔吸附樹脂的動態(tài)泄漏曲線Figure 3 Dynamic leakage curve of AB-8 macroporous adsorption resin

2.2.2 上樣濃度的確定 隨著樣品濃度的逐漸增加，AB-8大孔吸附樹脂吸附率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢（圖4）。樣品溶液的濃度為0.43～0.63 mg·mL-1時，黃酮類化合物與樹脂的接觸面積不斷增加，吸附速率逐漸增長，當樣品濃度達到0.63 mg·mL-1時，樹脂的吸附率最大，為75.43%。因此，0.63 mg·mL-1為樣品溶液最佳濃度。

圖4 樣品濃度對AB-8大孔吸附樹脂吸附率的影響Figure 4 Effect of sample concentration on adsorptionrate of AB-8 macroporous adsorption resin

2.2.3 上樣液流速的確定 不同樣液流速會影響樹脂對黃酮類化合物的吸附率。由圖5可知，隨著樣液流速的增加，吸附率呈先增長后降低的趨勢，在樣液流速為3 mg·mL-1時，樹脂吸附率最高，說明此時的樣液能夠與樹脂充分接觸和吸附。樣液流速過快會造成樣液中的黃酮類化合物未被吸附完全就流出，也有可能是流速過快造成樹脂吸附性能降低。因此最佳上樣液流速為3 mg·mL-1。

圖5 樣液流速對AB-8大孔吸附樹脂吸附率的影響Figure 5 Influence of sample liquid flow rate on adsorption rate of AB-8 porous adsorption resin

2.2.4 上樣液pH值的確定 上樣液pH值是影響樹脂吸附率的關鍵因素。由圖6可知，隨著上樣液pH值從2逐漸增高至8，吸附率呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢，在pH值增至5時，樹脂的吸附率達到75.43%，為最高吸附率，因此，上樣液pH值設置為5最佳。

圖6 樣液pH值對AB-8大孔吸附樹脂吸附率的影響Figure 6 Effect of pH value of sample solution on adsorption macroporous adsorption resin rate of AB-8 macro

2.2.5 動態(tài)洗脫曲線的繪制 由圖7可知，黃酮的解析過程是隨著洗脫劑體積的增加，解析率先升高后趨于恒定。洗脫劑體積在0～20 mL時，黃酮解析率快速增加，在洗脫劑達到30 mL或更多時，解析率趨于恒定，因此，最佳洗脫劑體積為30 mL，解析率為65.60%。

圖7 動態(tài)洗脫曲線Figure 7 Dynamic elution profile

2.2.6 水洗劑用量的確定 為去除樹脂間存在的少量水溶性雜質(zhì)和未能吸附上的黃酮，需要通過水洗將雜質(zhì)洗脫下來。在本研究中，隨著水洗劑體積的增加，黃酮損失量逐漸降低，當水洗劑體積達到40 mL時，黃酮損失量趨近于0（圖8），因此，最佳水洗劑體積為40 mL。

圖8 水洗體積的確定Figure 8 Determination of washing volume

2.2.7 洗脫劑流速的確定 洗脫劑流速是影響黃酮解析率的關鍵因素。由圖9可知，隨著洗脫劑流速的加快，解析率先升高后降低，在洗脫劑流速為3 mL·min-1時解析率最大，為60.82%。因此，最佳洗脫劑流速為3 mL·min-1。

圖9 洗脫劑流速對AB-8大孔吸附樹脂解析率的影響Figure 9 Influence of flow rate of eluent on the resolution rate of AB-8 rous adsorption resin

2.2.8 洗脫劑濃度的確定 洗脫劑的濃度高低，會影響大孔吸附樹脂的解析效率。由圖10可知，隨著洗脫劑濃度的逐漸加大，解析率逐漸升高，在濃度達到80%時，解析率最高為60.82%，之后隨著洗脫劑濃度的增大，樹脂解析率迅速下降。因此，洗脫劑最佳濃度為80%。

圖10 洗脫劑濃度對AB-8大孔吸附樹脂解析率的影響Figure 10 Effect of eluent concentration on resolution macroporous adsorption resin rate of AB-8 macropo

2.3 軟棗獼猴桃莖黃酮純化物的鑒定

2.3.1 高效液相色譜分析 本研究通過對軟棗獼猴桃莖黃酮純化前后進行高效液相色譜分析，對比發(fā)現(xiàn)純化前（圖11b）比純化后（圖11c）的黃酮內(nèi)雜質(zhì)減少。本試驗對蘆丁和槲皮素標準品進行了液相色譜分析，在所設定的試驗條件下，蘆丁峰值出現(xiàn)時間為16.614 min，槲皮素峰值出現(xiàn)時間為34.347 min（圖11a）。這與純化后的軟棗獼猴桃莖黃酮液相色譜中的16.631 min時出現(xiàn)的峰值重合，存在的誤差在允許范圍內(nèi)，與蘆丁標準品出峰時間基本相同，說明軟棗獼猴桃莖黃酮內(nèi)含有蘆丁，在32.531 min處可見有小吸收峰出現(xiàn)，與槲皮素標準品峰值出現(xiàn)的時間較為相近，說明軟棗獼猴桃莖黃酮內(nèi)含少量槲皮素。

圖11 軟棗獼猴桃莖黃酮純化前后以及標準物的高效液相色譜圖Figure 11 High performance liquid chromatogram of before and after purification and the standard substance from Actinidia arguta

2.4 軟棗獼猴桃莖黃銅片劑的制備

2.4.1 輔料的選擇及用量的確定 輔料是維持片劑穩(wěn)定性的重要組成部分，其種類和用量的選擇能夠優(yōu)化片劑口服效果。通過對比不同填充劑對片劑的影響，發(fā)現(xiàn)淀粉的綜合評分高于微晶纖維素（表1）。在淀粉添加量對片劑影響的研究發(fā)現(xiàn)，當?shù)矸厶砑恿吭?8%時（圖12a），片劑的綜合評分最高，且片劑的外觀良好、片重差異較小、硬度適中、崩解時間較短。對比崩解劑羧甲基纖維素鈉與羧甲基淀粉鈉的作用效果，發(fā)現(xiàn)兩者外觀相差不大，但羧甲基淀粉鈉硬度在20～30 N之間，片劑硬度不夠，不符合片劑硬度的相關規(guī)定。當羧甲基纖維素鈉添加量在10%時（圖12b），片劑的綜合評分最高，此時片劑的外觀優(yōu)良、片重差異低、硬度和崩解時限都處于較佳水平。在潤滑劑的選擇上，硬脂酸鎂和滑石粉的外觀、硬度表現(xiàn)差異不大，但硬脂酸鎂對人體無害且能夠有效降低片劑的粗糙性，更適合添加到片劑當中。由圖12c可知，當硬脂酸鎂的添加量在0.50%時，片劑的外觀最佳。甘露醇添加量對片劑的綜合評分影響不大，考慮片劑的口感和硬度、崩解時限，選擇甘露醇添加量為16%時最好（圖12d）。

表1 軟棗獼猴桃莖黃酮片劑制備輔料的選擇Table 1 Selection of excipients for preparation of Actinidia arguta stem flavone tablets

圖12 輔料添加對片劑綜合評分的影響Figure 12 Effect of excipients on the overall score of tablets

2.4.2 軟棗獼猴桃莖黃酮添加量的確定 為確定不同黃酮添加量對片劑的影響（圖13），對比發(fā)現(xiàn)軟棗獼猴桃黃酮含量在33%時，片劑的硬度和崩解時限最佳，且綜合評分最高，適合用于片劑的制備。

圖13 黃酮添加量對片劑綜合評分的影響Figure 13 Effect of the amount of raw material added on the comprehensive score of the tablet

2.4.3 正交試驗設計結(jié)果 為確定軟棗獼猴桃莖黃酮片劑的最佳處方，利用正交試驗法，對其中3個因素進行L9（33）三因素三水平的正交試驗。通過綜合評分確定其各原料的添加量。由表2可知，3個影響因素對片劑的影響程度依次為C＞B＞A（即羧甲基纖維素鈉的添加量＞淀粉的添加量＞軟棗獼猴桃莖黃酮），且片劑的最佳處方A2B1C1，即軟棗獼猴桃莖黃酮添加量為38%，淀粉添加量為38%，羧甲基纖維素鈉的添加量為8%。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Orthogonal experimental results

2.2.4 軟棗獼猴桃莖黃酮片劑的質(zhì)量測定 本研究分別從外觀、重量、硬度、蹦極時限等方面對片劑的質(zhì)量進行了測定。由圖14可知，片劑呈圓形淺棕色，表面完整光滑、色澤均勻，并無可見雜質(zhì)。在對重量檢測中發(fā)現(xiàn)（表3），平均片重為0.243 0 g，片重差異為1.19%，不合格片數(shù)為0。在隨機抽取的10個片劑中發(fā)現(xiàn)（表4），平均硬度為45.01 N，硬度均在40～50 N之間，硬度適中，不合格片數(shù)為0。在對片劑進行崩解時限檢測中發(fā)現(xiàn)（表5），崩解時限均在720 s（12 min）內(nèi)，平均崩解時限為659 s，不合格片數(shù)為0。以上檢測結(jié)果均符合《中國藥典》（2020年版）的相關規(guī)定。

表3 重量差異檢查結(jié)果Table 3 Weight difference check results

表4 硬度檢查結(jié)果Table 4 Hardness check result

表5 崩解時限檢查結(jié)果Table 5 Disintegration time limit inspection results

圖14 軟棗獼猴桃莖黃酮片劑Figure 14 Actinidia arguta stems flavonoids tablets

3 討論與結(jié)論

黃酮類化合物的來源主要是從天然植物中提取，再進行純化[21]。黃酮類化合物純化方法很多，其中大孔樹脂吸附法是目前常用的方法。大孔樹脂吸附法是提取分離中藥成分的一種有效方法[22]，該方法具有較高的物理化學穩(wěn)定性，吸附和解析性好，再生簡單并且能夠降低純化成本[23]。樹脂吸附法的關鍵是確定被分離純化物質(zhì)的體積大小，進而選擇合適的大孔樹脂孔徑，根據(jù)分子中的酚羥基、羧基等來確定樹脂型號以及分離條件[24]，不同的化合物因其理化性質(zhì)不同其純化條件也各有差異[25]。萬鵬聰?shù)萚26]通過大孔吸附樹脂純化沙棘異功方中總黃酮純度提高了9.49 倍，且抗氧化能力有明顯提高。周桃英等[27]在對比6 種大孔吸附樹脂對荷葉總黃酮的吸附研究中發(fā)現(xiàn)AB-8 大孔樹脂吸附速度快、解析率高，是理想的樹脂類型。洗脫劑的使用可根據(jù)樹脂的極性和化合物類型進行選擇，對于非極性樹脂，選擇極性小的洗脫劑洗脫能力強，對于極性大的樹脂和化合物，使用極性強的溶劑更好分離[28]。

高效液相色譜法（high performance liquid chromatography,HPLC）相比于經(jīng)典液相色譜法具有分析時間短、效率高、穩(wěn)定性強等特點[29]。在對毛竹葉中總黃酮的含量測定研究中發(fā)現(xiàn)相比于分光光度法，HPLC 法相對干擾少，測定的結(jié)果精確可靠[30]。在對山楂黃酮含量測定的研究中發(fā)現(xiàn)，建立外標法定量測定的結(jié)果重復性高，穩(wěn)定性好[31]。片劑的制備首先要考慮其處方篩選和制備工藝是否能夠壓出合格的片劑，其次是服用方便、療效確切、毒副作用小，盡最大可能發(fā)揮黃酮對人體的藥理作用[32]。

影響大孔吸附樹脂對軟棗獼猴桃莖中黃酮的純化效果因素較多，包括樹脂的選擇、上樣液的濃度、pH 值、流速以及洗脫劑的選擇和流速，經(jīng)過篩選獲得純化的最佳條件，純化后的黃酮純度可達71.25%。利用高效液相色譜法對比純化前后吸收峰出現(xiàn)的時間，說明軟棗獼猴桃莖黃酮內(nèi)含有蘆丁。純化后的黃酮再添加一定的輔料制成片劑，利用單因素和正交試驗優(yōu)化片劑的最佳處方，制作出來的片劑各項指標均符合相關規(guī)定，可為黃酮片劑的推廣和應用提供參考，將有助于進一步開發(fā)黃酮類化合物在抗癌、心血管保護等作為治療藥物和食品保健方面的應用前景，帶來更大的社會效益和經(jīng)濟效益。