向志宇，阿卜杜米吉提·艾海提，韓 雪，戴小華，史慧君，姚 剛

（新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052）

黑色素瘤，又稱惡性黑色素瘤（malignant melanoma，MM），被稱為“皮膚癌王”，是皮膚癌當(dāng)中最危險的一種，增殖能力極強(qiáng)。近年來，動物黑色素瘤發(fā)病率逐漸升高，尤其是馬屬動物、貓、犬類。在年齡超過5 歲的灰馬中，其發(fā)病率高達(dá)50%[1-2]。對馬健康甚至馬產(chǎn)業(yè)的發(fā)展造成巨大的影響。目前傳統(tǒng)治療黑色素瘤的藥物只有少數(shù)幾種，如達(dá)卡巴嗪、替莫唑胺和紫杉醇，但它們的有效率仍低于15%，治療有效率低[3]。因此，急需研發(fā)新型防控黑色素瘤的藥物。

石斛酚（Gigantol）是從幾種藥用蘭花中分離出來的一種雙芐基型酚類化合物。這種生物活性化合物已被證明具有顯著的抗氧化、抗痙攣、抗炎作用和抗癌等功能[4]。研究表明石斛酚對多種癌細(xì)胞的惡性行為具有明顯抑制作用，包括非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌和肝癌等[5-7]。然而石斛酚對黑色素瘤的作用還未見報道。研究發(fā)現(xiàn)，microRNA（miRNA）在黑色素瘤惡性進(jìn)展中扮演至關(guān)重要的角色[8]，因此，本研究試圖探索石斛酚在黑色素瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并利用miRNA-seq 技術(shù)挖掘石斛酚的潛在靶點(diǎn)miRNA，進(jìn)而揭示其對黑色素瘤發(fā)生發(fā)展的作用機(jī)制，以期為石斛酚應(yīng)用于治療黑色素瘤提供理論基礎(chǔ)，從而減輕黑色素瘤對馬健康與馬產(chǎn)業(yè)的危害。

1 材料與方法

1.1 材料

供試石斛酚購自上海純優(yōu)生物科技有限公司；小鼠黑色瘤細(xì)胞B16購自中科院上海細(xì)胞庫；Total RNA Extractor（Trizol）購自生工生物工程（上海）股份有限公司；Qubit2.0 RNA 檢測試劑盒購自西安楓嶺生物技術(shù)有限公司；CCK-8 試劑購自北京博奧森生物科技有限公司；DMSO 購自福州奧研實(shí)驗(yàn)器材有限責(zé)任公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基、0.25%Trpsin&0.02%EDTA、青霉素-鏈霉素溶液和60 mm 細(xì)胞培養(yǎng)皿購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清FBS（貨號04-001-1ACS）購自杭州四季青生物工程材料有限公司；瓊脂購自XHLY COMPANY LTD。

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號CS170）購自北京東南信誠科技有限公司；酶標(biāo)儀（型號150918C）購自上海普邁生物科技有限公司；Qubit2.0熒光計(jì)（型號Q32866）購自上海普瑾醫(yī)療科技有限公司；電泳儀（型號DYY-11）購自北京市六一儀器廠；臺式高速低溫離心機(jī)（型號Thermo Scientific Sorvall Legend Micro 21R）購自上海朗賦實(shí)業(yè)有限公司；微量分光光度計(jì)（型號SMA4000）購自美林恒通（北京）儀器有限公司上海分公司。

1.2 方法

小鼠黑色素瘤細(xì)胞系B16用含有10%FBS、100 U·mL-1青霉素和100 mg·mL-1鏈霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)，并在37 ℃、5%CO2條件下于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每1 d或2 d更換一次新鮮培養(yǎng)基。一旦細(xì)胞融合達(dá)到80%～90%就將細(xì)胞傳代培養(yǎng)，并將第3 代細(xì)胞整合用于后面的實(shí)驗(yàn)。石斛酚使用0.004%DMSO 溶解，濃度為44 mmol·L-1，然后用DMEM高糖培養(yǎng)基稀釋成相應(yīng)的濃度，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

將B16 細(xì)胞分成5 組，依次加0，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚處理24 h，用于CCK-8 檢測和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，即Control組、石斛酚組1、石斛酚組2、石斛酚組3和石斛酚組4。再將B16細(xì)胞分成2組，依次加0 μmol·L-1和160 μmol·L-1石斛酚處理24 h，收集細(xì)胞，用于RNA提取及miRNA測序?qū)嶒?yàn)，即Control組和石斛酚組。

1.2.1 CCK-8檢測細(xì)胞增殖能力 將B16細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種量為每孔5×103個細(xì)胞，同時設(shè)置6個復(fù)孔，具體分組和石斛酚處理方式同上，處理完畢，每孔加入10 μL CCK-8試劑，放置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀上測定450 nm處的OD值。

1.2.2 劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力 將B16細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞接種量為每孔5×103個細(xì)胞，同時設(shè)置3個復(fù)孔，具體分組和石斛酚處理方式同上，處理完畢，換為無血清培養(yǎng)基并加入1 μg·mL-1的絲裂霉素C處理1.5 h，再用200 μL pipette tip造成細(xì)胞劃痕，除去細(xì)胞碎片，分別于培養(yǎng)0 h和24 h時進(jìn)行顯微鏡拍照，并測量遷移距離和計(jì)算遷移率。

1.2.3 RNA的提取與驗(yàn)證 具體分組和石斛酚處理方式同上，收集處理完畢的細(xì)胞，加入裂解液后室溫放置5～10 min，使得核蛋白與核酸完全分離；加入0.2 mL氯仿振蕩15 s，室溫放置3 min后于12 000 r·min-1離心10 min；吸取上層水相轉(zhuǎn)移至干凈的離心管中，加入等體積異丙醇，混勻，室溫放置20 min，12 000 r·min-1離心10 min棄上清；加入1 mL 75%乙醇洗滌沉淀12 000 r·min-1離心3 min棄上清；加入30～50 μL RNase-free ddH2O，充分溶解RNA。Qubit2.0探針檢測RNA濃度，1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測。

1.2.4 測序及數(shù)據(jù)預(yù)處理 提取Control組和石斛酚組的RNA，由上海生物工程股份有限公司進(jìn)行質(zhì)檢，合格后，建立Small RNA文庫，兩組樣本經(jīng)PCR擴(kuò)增及純化、文庫質(zhì)檢后上機(jī)測序。隨后，將獲得的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并去除含有帶接頭的、低質(zhì)量的序列，并根據(jù)miRNA特點(diǎn)，保留長度17～35 nt的reads，保證獲得Clean數(shù)據(jù)。

1.2.5 差異miRNA的篩選 針對Control組和石斛酚組的Clean數(shù)據(jù)，利用R語言中的vegan package進(jìn)行主成分分析PCA（principal component analysis）和樣本間相似程度分析后，采用DESeq2進(jìn)行分析，篩選條件設(shè)為：p≤0.05且差異倍數(shù)|FoldChange|≥2，從而獲得兩組間顯著差異的miRNA。

1.2.6 miRNA靶基因預(yù)測及功能注釋 利用miranda算法預(yù)測miRNA靶基因，預(yù)測miRNA靶基因過程中所使用到的閾值參數(shù)為：S≥150，ΔG≤-30 kcal·mol-1和Demandstrict 5'seed pairing，其中S指匹配區(qū)域內(nèi)single-residuepair match scores；ΔG為雙鏈形成時所需的自由能。選出靶基因后，進(jìn)行GO（gene ontology）和KEGG（kyoto encyclopedia of genes and genomes）進(jìn)行功能注釋。

1.3 數(shù)據(jù)處理方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（X±S）表示，運(yùn)用SPSS 25.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，多組樣本間使用單因素方差分析，并采用LSD法進(jìn)行多重比較；兩組樣本間使用t檢驗(yàn)。p＜0.05視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 石斛酚對黑色素瘤B16細(xì)胞增殖能力的影響

不同濃度石斛酚處理黑色素瘤B16 細(xì)胞24 h 后，利用CCK-8 試劑盒檢測石斛酚對B16 細(xì)胞增殖能力的影響。結(jié)果表明，40，80，160，320 μmol·L-1對B16 細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與Control（0 μmol·L-1）組相比，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚對B16細(xì)胞增殖抑制作用有顯著性差異，其中160 μmol·L-1和320 μmol·L-1石斛酚可極顯著抑制B16細(xì)胞的增殖能力，且呈現(xiàn)濃度依賴性（表1）。

表1 不同濃度石斛酚對黑色素瘤B16細(xì)胞增殖的影響Table1 Effects of different concentrations of Gigantol on the proliferation of Melanoma B16 cells

2.2 石斛酚對黑色素瘤B16細(xì)胞遷移能力的影響

利用不同濃度石斛酚處理黑色素瘤B16細(xì)胞24 h后，進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，于劃痕后0 h和24 h分別拍照，同時測量各組遷移距離并計(jì)算遷移率。結(jié)果表明，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚對B16細(xì)胞均具有一定的抑制作用（圖1），經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析后發(fā)現(xiàn)，與Control（0 μmol·L-1）組相比，40 μmol·L-1和80 μmol·L-1石斛酚對B16細(xì)胞抑制作用無顯著性差別，而160 μmol·L-1和320 μmol·L-1石斛酚可顯著抑制B16細(xì)胞的遷移能力（表2）。

圖1 石斛酚對黑色素瘤B16細(xì)胞遷移能力的影響Figure 1 Effect of Gigantol on melanoma B16 cells migration

表2 不同濃度石斛酚對B16細(xì)胞遷移能力的影響Table 2 Effects of Gigantol different concentrations on B16 cells migration

2.3 提純與分離總RNA

根據(jù)CCK-8 和細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果，利用Total RNA Extractor（Trizol）提取試劑盒提取空白對照組（Control）和160 μmol·L-1石斛酚組B16 細(xì)胞中的總RNA，經(jīng)Qubit2.0探針檢測RNA濃度后，采用瓊脂糖凝膠檢測RNA 完整性以及基因組污染情況。結(jié)果顯示，Control 組和石斛酚組的3 個重復(fù)樣本的18S 和28S 核糖體RNA 條帶較為清晰，明暗度對比較強(qiáng)。另外一些低分子量的彌散性條帶，代表存在tRNA、5S 核糖體RNA 以及其他mRNA 等（圖2）?？梢?，本研究獲得了高純度的RNA，且沒有被基因組污染，為后續(xù)miRNA測序奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

圖2 瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA完整性與污染情況Figure 2 Detection of RNA integrity and contamination by agarose gel electrophoresis

2.4 樣本間相關(guān)性分析

本研究首先對Control 組和石斛酚組之間的Clean數(shù)據(jù)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果顯示組間樣本存在差別（圖3A）。進(jìn)一步采用樣本相關(guān)熱圖展示樣品間基因表達(dá)水平相關(guān)性，結(jié)果顯示樣本之間表達(dá)模式的相似度較高（圖3B）。此結(jié)果表明檢測實(shí)驗(yàn)較為可靠，且樣本選擇較為合理，為后續(xù)差異miRNA分析等奠定理論基礎(chǔ)。

圖3 樣本間相關(guān)性分析結(jié)果Figure 3 Correlation analysis results between samples

2.5 miRNA差異化分析

探索差異表達(dá)miRNA有助于挖掘石斛酚治療黑色素瘤的潛在靶向作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與Control組相比，石斛酚組顯著上調(diào)表達(dá)42 個miRNA，顯著下調(diào)表達(dá)11 個miRNA（圖4A）。同時根據(jù)這53 個顯著差異表達(dá)的miRNA 及比較組的Foldchange、P.Value、Q.Value值繪制熱圖（圖4B）。除33個新預(yù)測到的miRNA 外，其余差異表達(dá)miRNA 共20 個，即與Control 組相比，石斛酚組中顯著上調(diào)的miRNA 有mmu-miR-132-5p、mmumiR-144-3p、mmu-miR-212-3p、mmu-miR-5100、mmu-miR-6238、mmu-miR-6239、mmu-miR-6240、mmumiR-690、mmu-miR-6937-5p、mmu-miR-708-5p 和mmu-miR-708-3p；顯著下調(diào)的miRNA 有mmu-miR-1191b-5p、mmu-miR-133a-3p、mmu-miR-3073a-5p、mmu-miR-3091-3p、mmu-miR-335-3p、mmu-miR-5128、mmu-miR-6539、mmu-miR-7661-3p 和mmu-miR-7667-5p。這一結(jié)果提示石斛酚可能通過調(diào)節(jié)這20 個差異表達(dá)miRNA來抑制黑色素瘤的發(fā)生與發(fā)展。

圖4 差異miRNA分析Figure 4 Analysis of the Differential miRNA

2.6 GO富集分析

根據(jù)Control 組和石斛酚組差異表達(dá)的53 個miRNA 預(yù)測出來的靶基因共有2 050 個，對這些靶基因進(jìn)行GO（gene ontology）分析。GO 相關(guān)3個ontology 中的top10富集結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA 靶基因的功能主要與軸突導(dǎo)向（axon guidance）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、DNA 結(jié)合（DNA binding）等有關(guān)（圖5）。這一結(jié)果提示石斛酚可能通過差異表達(dá)miRNA來調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的多種生物學(xué)過程。

圖5 差異miRNA靶基因GO注釋分類柱狀圖Figure 5 Differential miRNA target gene GO annotation classification histogram

2.7 KEGG Pathway分析

本研究又進(jìn)一步針對這53個差異表達(dá)miRNA靶基因進(jìn)行KEGG Pathway分析，結(jié)果顯示，這些靶基因主要涉及Rap1 信號通路（Rap1 signaling pathway）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、嗎啡成癮（Morphine addiction）以及磷脂酶D 信號通路（phospholipase D signaling pathway）等（圖6）。綜上表明，石斛酚可能通過調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞中miRNA及其靶基因的表達(dá)，影響多種信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，從而緩解黑色素瘤的疾病進(jìn)程。

圖6 差異表達(dá)miRNA靶基因KEGG Pathway分析Figure 6 Differential expression of miRNA target gene KEGG Pathway analysis

3 討論與結(jié)論

黑色素瘤位于馬皮膚源性腫瘤的第3 位，是一種惡性腫瘤，在腫瘤研究發(fā)現(xiàn)黑色素瘤最常見于灰色馬，尤其是年齡超過16周歲的老年馬，其特征明顯不同于其他顏色的馬[9]。針對馬黑色素瘤的治療，腫瘤塊的局部控制主要采用手術(shù)切除、病灶內(nèi)化療以及嘗試使用西咪替丁、左旋咪唑等進(jìn)行治療，但效果仍不能滿足現(xiàn)狀。近年來研究發(fā)現(xiàn)馬黑色素瘤的發(fā)病因素與多種分子異常有關(guān)，如STX17G基因突變、ASIPa和MC1RE的異常表達(dá)等，且有研究學(xué)者推薦了重要診斷生物標(biāo)志物RACK1 和PNL2 等，以及潛在的治療靶點(diǎn)CD47、PD-1 和COX-2等[2,10]。由此可見，繼續(xù)基于分子改變挖掘治療黑色素瘤的可能治療藥物及其作用靶點(diǎn)具有重要的臨床意義。

石斛酚是一種從石斛屬蘭花中分離出來的雙芐基型酚類化合物，現(xiàn)已被證明具有多種藥理作用，包括抗癌，但其對黑色素瘤的作用機(jī)制尚未見相關(guān)報道。本研究采用0，40，80，160，320 μmol·L-1石斛酚處理B16 細(xì)胞，是根據(jù)前人研究石斛酚對膀胱癌和乳腺癌作用時使用的藥物濃度而設(shè)定，且采用CCK-8 檢測細(xì)胞增殖能力的結(jié)果顯示，石斛酚對黑色素瘤B16細(xì)胞的增殖能力具有劑量依賴性的抑制作用；采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞遷移能力的結(jié)果顯示，石斛酚對黑色素瘤B16 細(xì)胞的遷移能力亦具有一定程度的抑制作用。以上研究結(jié)果與前人在其他癌中研究石斛酚的抗癌作用結(jié)果一致[6,11]?？梢娛訕O有可能是治療黑色素瘤的潛在藥物，但具體分子機(jī)制尚不清楚。

微小RNA（microRNA,miRNA）是一類長為20～25 個核苷酸的小分子，絕大多數(shù)miRNA 的初級轉(zhuǎn)錄本位于宿主基因的非編碼翻譯區(qū)，主要遵從經(jīng)典miRNA 成熟途徑，加工剪切成成熟體而發(fā)揮調(diào)控作用。此外miRNA存在于所有的真核細(xì)胞中，具有高度保守性，并且與癌癥、心血管疾病、細(xì)胞外囊泡、神經(jīng)退行性疾病等均密切相關(guān)[12]。研究表明miRNA 參與調(diào)節(jié)黑色素瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞鐵死亡[13]、細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]等，因此本研究以miRNA為切入點(diǎn)來探討石斛酚對黑色素瘤的潛在作用靶點(diǎn)。

本研究選用的小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞為當(dāng)前研究黑色素瘤機(jī)制的關(guān)鍵研究對象[15-16]，此細(xì)胞穩(wěn)定無污染，且易于獲得。根據(jù)CCK-8 結(jié)果計(jì)算的石斛酚處理B16 細(xì)胞24 h 時的IC50（IC50=133.6 μmol·L-1），同時劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示160 μmol·L-1時可顯著抑制B16細(xì)胞的遷移，因此本研究最終選取160 μmol·L-1石斛酚處理B16細(xì)胞24 h進(jìn)行后續(xù)測序分析。

分析53 個差異表達(dá)miRNA 靶基因，得到2 050 個靶基因，并對其進(jìn)行GO 功能分析，結(jié)果顯示，差異表達(dá)miRNA 靶基因功能主要是參與軸突導(dǎo)向、細(xì)胞質(zhì)、DNA 結(jié)合等，KEGG 分析發(fā)現(xiàn)靶基因主要與Rap1 信號通路[17]、鈣信號通路[18]、嗎啡成癮[19]以及磷脂酶D信號通路[20]等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路關(guān)系密切，而這些信號通路已被多項(xiàng)研究證實(shí)在黑色素瘤中發(fā)揮重要的作用。綜上可見，石斛酚可能通過調(diào)節(jié)癌細(xì)胞中miRNA 表達(dá)來影響多種生物學(xué)過程及相關(guān)信號通路轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而發(fā)揮治療黑色素瘤的作用。本研究結(jié)果有助于深入了解黑色素瘤的發(fā)病機(jī)制，可為石斛酚在馬業(yè)臨床治療中提供強(qiáng)有力的理論依據(jù)。

石斛酚對黑色素瘤的惡性進(jìn)展具有抑制作用，且利用Small RNA-seq 測序技術(shù)為馬黑色素瘤發(fā)病機(jī)理及石斛酚臨床推廣應(yīng)用提供了理論框架，篩選得到的差異表達(dá)miRNA 可能是治療該疾病的關(guān)鍵分子。然而，目前本研究篩選得到的53 個差異表達(dá)miRNA 在黑色素瘤中的詳細(xì)功能尚未被闡明，甚至有部分miRNA 的生物學(xué)功能至今未被揭示，未來需重點(diǎn)針對這些差異表達(dá)miRNA 的功能及調(diào)控機(jī)制展開石斛酚對黑色素瘤影響的相關(guān)研究。