張 梟，李培暠，王 鍵，付東旭，趙柏棚，董文軒，劉月學(xué)

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，沈陽 110161）

山楂屬（Crataegusspp.）為薔薇科（Rosaceae）梨亞科（Pyreae）中一個(gè)古老的屬[1]。中國(guó)的山楂屬植物多達(dá)20個(gè)種，包含大量?jī)?yōu)異種質(zhì)資源，其中栽培山楂以羽裂山楂大果變種（Crataegus pinnatifidavar.majorN.E.Br.）、湖北山楂（Crataegus hupehensisSarg.）、云南山楂[Crataegus scabrifolia（Franch.）Rehder]和伏山楂（Crataegus bretschneideriC.K.Schneid.）為主[2]。毛山楂（Crataegus maximowicziiC.K.Schneid.）為東北地區(qū)特有的野生近緣種，具有早熟、抗寒等優(yōu)良特性。基于植物學(xué)特征及SCoT 分子標(biāo)記結(jié)果發(fā)現(xiàn)，毛山楂與遼寧山楂（Crataegus sanguineaPall.）的親緣關(guān)系較近[3]。簡(jiǎn)化基因組與葉綠體基因組數(shù)據(jù)結(jié)果則證實(shí)，毛山楂為伏山楂的母本基因來源[4-5]。此外，毛山楂與羽裂山楂大果變種、伏山楂等山楂屬植物雜交可育，可作為選育栽培山楂新品種的親本材料[6]。

類黃酮及其衍生物是山楂中含量最高、生物活性研究最多的一類化合物。山楂果實(shí)富含酚類、黃酮類、花青素等活性成分[7-8]，常用于食品和醫(yī)藥行業(yè)[9]。山楂富含的類黃酮及其衍生物主要包括黃酮類、黃酮醇類、黃烷醇類、黃烷酮類和其他苷類等。山楂黃酮類主要以牡荊素、芹菜素、牡荊素鼠李糖苷等為主；黃酮醇類主要包括蘆丁、槲皮素、金絲桃苷等；黃烷醇類有兒茶素、表兒茶素、原花青素等；黃烷酮類主要包括柚皮苷等；其他苷類有矢車菊-3-O-半乳糖苷等[2]。

山楂作為豐富的酚類和黃酮類物質(zhì)的來源，可被廣泛用于預(yù)防或改善氧化引起的相關(guān)疾病[8]。山楂總酚或總黃酮的含量與其清除自由基的能力呈線性關(guān)系[10]。山楂80%乙醇提取物中含有原花青素B2、表兒茶素、綠原酸、金絲桃苷和異槲皮苷等物質(zhì)，可顯著提高CuZn-SOD 和CAT 的活性和mRNA 水平，揭示山楂可能通過增加內(nèi)源性抗氧化酶的活性，從而實(shí)現(xiàn)其在體內(nèi)的抗氧化機(jī)制[11]。山楂中的多酚和黃酮類化合物，也被證明對(duì)預(yù)防和治療炎癥有顯著效果。LIU等[12]發(fā)現(xiàn)，從山楂提取的黃酮類化合物可以起到抗炎作用，緩解TNF-α誘發(fā)的Caco-2 細(xì)胞的腸上皮屏障缺失，改善上皮細(xì)胞的通透性。山楂中提取的低聚原花青素可減少促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α的基因表達(dá)，最終緩解大鼠的促炎癥免疫反應(yīng)[13]。此外，山楂的多酚和黃酮類物質(zhì)對(duì)于降低血糖具有一定的功效。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，山楂80%甲醇提取物能夠降低血糖水平，增加胰腺的血漿胰島素釋放，從而減輕高脂飲食誘導(dǎo)的血脂異常小鼠的糖尿病癥狀[14]。XIN等[15]發(fā)現(xiàn)山楂中的槲皮素和金絲桃苷是抑制α-葡萄糖苷酶的重要生物活性來源。山楂中提取的黃酮類化合物對(duì)鏈脲霉素誘導(dǎo)的大鼠糖尿病心肌病具有保護(hù)作用[16]。

黑色毛山楂為本團(tuán)隊(duì)前期從紅色毛山楂中選出的果實(shí)黑色且富含類黃酮物質(zhì)的實(shí)生后代資源[17]。本研究通過比較黑色與紅色毛山楂果實(shí)色差值，結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)黑色與紅色毛山楂果實(shí)類黃酮化合物種類及含量的差異，為富含黃酮類物質(zhì)山楂新品種的選育，提升山楂果實(shí)品質(zhì)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本試驗(yàn)于2022年8月下旬，在國(guó)家山楂種質(zhì)資源圃（沈陽）內(nèi)采集毛山楂實(shí)生后代中的黑色毛山楂與紅色毛山楂（圖1）。每份資源從3 棵樹上采集成熟度一致的果實(shí)，一部分用于果實(shí)色差值的測(cè)定，另一部分液氮速凍后-80 ℃低溫保存，用于類黃酮物質(zhì)含量的測(cè)定。

圖1 黑色與紅色毛山楂成熟果實(shí)Figure 1 The ripe fruits of black and red hawthorn (Crataegus maximowiczii)

供試標(biāo)準(zhǔn)品有矢車菊素-3-O-葡萄糖苷（Cyanidin-3-O-glucoside）、矢車菊-3-O-半乳糖苷（Cyanidin3-Ogalactoside）、原花青素（Proanthocyanidins）、原花青素B1（Proanthocyanidin B1）、兒茶素[(±)-Catechin hydrate]、表兒茶素[(-)-Epicatechin]、購(gòu)自北京百靈威科技有限公司；蘆丁（Rutin）、異槲皮素（Quercetin-3-glucoside）、金絲桃苷（Hyperoside）、綠原酸（Chlorogenic acid）和新綠原酸（Neochlorogenic acid），購(gòu)自西格瑪奧德里奇公司，純度均為90%以上。

1.2 方法

1.2.1 山楂果實(shí)顏色的測(cè)定 使用LS170色差儀（深圳市林上科技有限公司）測(cè)定山楂果實(shí)亮度L*、色相a*與b*值。L*值衡量的是果實(shí)的亮度，0～100數(shù)值代表由暗到亮的過程。+a*到-a*值的轉(zhuǎn)變過程代表紅色減退、綠色增強(qiáng)；+b*到-b*值的轉(zhuǎn)變過程代表黃色減退、藍(lán)色增加[18]，并根據(jù)數(shù)據(jù)計(jì)算彩度值[C=（a*2+b*2）1/2]和色相角[h°=arctan（b*/a*）]。每份種質(zhì)資源選擇10個(gè)成熟度及大小一致的果實(shí)，果皮測(cè)定果實(shí)橫徑中央部位正面、對(duì)面和側(cè)面3個(gè)點(diǎn)；果肉測(cè)定果實(shí)橫截面中心部位3個(gè)點(diǎn)，取平均值。

1.2.2 山楂果實(shí)類黃酮物質(zhì)的提取 山楂果實(shí)樣品打碎或磨成粉末后，進(jìn)行48 h凍干處理，將凍干粉末保存在-20 ℃下備用。準(zhǔn)確稱量20 mg樣品，將其加入1 mL 80%甲醇水溶液（甲醇體積∶水體積=80∶20），4 ℃下用超聲設(shè)備提取20 min，12 000 r·min-1離心12 min，取上清液轉(zhuǎn)移至2 mL EP管內(nèi)，重復(fù)3次，真空離心干燥，濃縮樣品至EP管內(nèi)。用甲醇400 μL定容，微孔濾膜過濾后檢測(cè)。

1.2.3 色譜質(zhì)譜采集條件Waters ACQUITY UPLC I-Class/Xevo G2-XS QTOF超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters，USA）條件：色譜柱，ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0×150 mm，1.8 μm）；進(jìn)樣量為1 μL；流速為1.0 mL·min-1，柱溫設(shè)定為30 ℃。流動(dòng)相采用包含A（0.1%甲酸）和B（乙腈）的二元流動(dòng)相系統(tǒng)。梯度洗脫的濃度梯度：0～1 min為5%B+95%A；1～8 min 為30%B+70%A；8～12 min為40%B+60%A；12～16 min為95%B+5%A；16～21 min 為100%B；21～25 min 為5%B+95%A。流動(dòng)相的流速為400 μL·min-1。二極管陣列檢測(cè)器進(jìn)行全波長(zhǎng)（200～500 nm）掃描，質(zhì)譜系統(tǒng)為飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀（Waters Xevo G2-XS QTOF，America）。ESI正離子模式進(jìn)行全掃描分析，質(zhì)量掃描范圍100～1 500 m/z；脫溶劑氣為N2；脫溶劑氣溫度400 ℃，脫溶劑氣流量800 L·Hr-1，離子源溫度150 ℃，錐孔電壓30 V，為了獲得豐富的碎片信息，碰撞電壓為20～50 V。

定量分析：有標(biāo)準(zhǔn)品的用標(biāo)準(zhǔn)品定量分析，無標(biāo)準(zhǔn)品的黃酮類物質(zhì)以蘆丁計(jì)，花青素類以矢車菊-3-O-半乳糖苷計(jì)；原花青素類以表兒茶素計(jì)。類黃酮化合物含量以鮮果（fresh weight，F(xiàn)W）計(jì)，單位為μg·g1，每次測(cè)定包含3次生物學(xué)重復(fù)，檢測(cè)條件如表1。

表1 山楂果實(shí)中類黃酮物質(zhì)UPLC-MS/MS-ESI檢測(cè)條件Table 1 UPLC-MS/MS-ESI of hawthorn fruit flavonoids compounds

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS v20.0 軟件Duncan's Multiple Range Test（DMRT）法對(duì)測(cè)定的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析。采用SVD（Singular Value Decomposition）法基于MetaboAnalyst v5.0軟件進(jìn)行主成分分析、OPLS 分析及聚類分析，并進(jìn)行可視化作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑色與紅色毛山楂果皮顏色分析

毛山楂果實(shí)成熟時(shí)果皮通常為紅色。黑色毛山楂為毛山楂中選出的實(shí)生后代，其成熟果實(shí)的果皮為黑色。利用色差儀測(cè)定了黑色與紅色毛山楂果實(shí)的L*、a*、b*值，并計(jì)算C*和h°值。結(jié)果顯示（表2），紅色毛山楂果實(shí)亮度L*值顯著高于黑色毛山楂；色相a*值和b*值也顯著高于黑色毛山楂。黑色毛山楂果實(shí)整體呈現(xiàn)為近黑色；紅色毛山楂果實(shí)則為深紅色。

表2 黑色與紅色毛山楂果實(shí)色差值差異Table 2 Difference of chromatism indexes between black and red hawthorn fruit

2.2 黑色與紅色毛山楂果實(shí)類黃酮化合物的差異分析

利用超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀從黑色與紅色毛山楂果實(shí)中共鑒定出21種黃酮/苯丙素類化合物（圖2），包括山楂果實(shí)中常見的蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、原花青素、表兒茶素、綠原酸等化合物。此外，還鑒定出3 種花青素類化合物，包含2 種山楂共有的矢車菊-3-O-半乳糖苷和矢車菊素-阿拉伯糖苷/木糖苷，及黑色毛山楂中特有的矢車菊-3-O-葡萄糖苷，其保留時(shí)間分別為5.01，5.45，5.19 min（圖3）。以上結(jié)果說明，黑色與紅色毛山楂中類黃酮化合物的種類非常豐富，2 種山楂資源所含類黃酮化合物的種類基本相似，黑色毛山楂果實(shí)中特有花青素類化合物矢車菊-3-O-葡萄糖苷。

圖2 黑色與紅色毛山楂果實(shí)280 nm色譜圖（黃酮/苯丙素類）Figure 2 280 nm chromatogram of black and red hawthorn fruits (flavonoids/phenylpropanoids)

圖3 黑色與紅色毛山楂果實(shí)520 nm色譜圖（花青素類）Figure 3 520 nm chromatogram of black and red hawthorn fruits (Anthocyanins)

2.2.1 黑色與紅色毛山楂果實(shí)黃酮類化合物的含量差異 黃酮類化合物是山楂主要的功效成分之一。超高效液相色譜串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用儀分析結(jié)果顯示，2種毛山楂果實(shí)中共包含出6種黃酮類化合物，包括蘆丁、金絲桃苷、牡荊素異構(gòu)體、異槲皮素、芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二?；?-葡萄糖（表3）。黑色毛山楂果實(shí)中蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素、芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二酰基)-葡萄糖的含量均顯著高于紅色毛山楂（表3），其中金絲桃苷含量最高（901.96 μg·g-1），是紅色毛山楂的1.63倍；蘆丁含量是紅色毛山楂的2.17倍；異槲皮素含量是紅色毛山楂的3.16倍；芹菜素-O-葡萄糖苷含量是紅色毛山楂的3.26倍；槲皮素-O-(-O-丙二?；?-葡萄糖含量是紅色毛山楂的2.78倍。

表3 黑色與紅色毛山楂果實(shí)黃酮類化合物含量差異Table 3 Differences in flavonol compounds content between black and red hawthorn fruits

2.2.2 黑色與紅色毛山楂果實(shí)原花青素類化合物的含量差異 山楂果實(shí)中的類黃酮物質(zhì)，主要以原花青素為主。2種毛山楂果實(shí)中共鑒定出7種原花青素類化合物（表4），包括原花青素B1、兒茶素、原花青素B2/B4/B5、表兒茶素、原花青素三聚體、原花青素四聚體和原花青素五聚體。紅色毛山楂果實(shí)中原花青素B1、原花青素B2/B4/B5、表兒茶素、原花青素三聚體、原花青素四聚體和原花青素五聚體的含量均顯著高于黑色毛山楂（表4），其中表兒茶素含量最高（12 844.31 μg·g-1），是黑色毛山楂的1.29倍；原花青素B1含量是黑色毛山楂的3.20倍；原花青素B2/B4/B5含量是黑色毛山楂的1.38倍；原花青素三聚體含量是黑色毛山楂的1.62倍；原花青素四聚體含量是黑色毛山楂的1.55倍；原花青素五聚體含量是黑色毛山楂的1.51倍。黑色毛山楂果實(shí)兒茶素的含量（137.79 μg·g-1）是紅色毛山楂的1.38倍。

表4 黑色與紅色毛山楂果實(shí)原花青素類化合物含量差異Table 4 Differences in proanthocyanidin compounds content between black and red hawthorn fruits

2.2.3 黑色與紅色毛山楂果實(shí)酚酸和花青素類化合物的含量差異 2種毛山楂果實(shí)中共鑒定出2種酚酸，3種花青素類化合物（表5），包括新綠原酸、綠原酸、矢車菊-3-O-半乳糖苷、矢車菊-3-O-葡萄糖苷和矢車菊-阿拉伯糖苷/木糖苷。黑色毛山楂果實(shí)新綠原酸的含量（256.38 μg·g-1）為紅色毛山楂的50.54倍，綠原酸的含量（245.98 μg·g-1）則為紅色毛山楂的0.59倍?；ㄇ嗨仡惢衔锓矫?，黑色毛山楂中3種花青苷含量均顯著高于紅色毛山楂，其中矢車菊-3-O-半乳糖苷含量（1 323.66 μg·g-1）是紅色毛山楂的1.59倍，矢車菊-阿拉伯糖苷/木糖苷含量（731.43 μg·g-1）是紅色毛山楂的7.97倍。特別是呈現(xiàn)紅色的矢車菊-3-O-葡萄糖苷，在黑色毛山楂果實(shí)中大量積累（3149.17 μg·g-1），而在紅色毛山楂果實(shí)中并未檢測(cè)到。這3種花青苷物質(zhì)的含量差異可能是黑色與紅色毛山楂果實(shí)顏色差異的主要原因。

表5 黑色與紅色毛山楂果實(shí)酚酸及花青素類化合物含量差異Table 5 Differences in phenolic acid and anthocyanin compounds between black and red hawthorn fruits

2.3 黑色與紅色毛山楂果實(shí)類黃酮化合物含量的主成分分析

為解析黑色與紅色毛山楂成熟果實(shí)中類黃酮物質(zhì)成分及含量的差異，對(duì)這兩組樣品進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）分析。圖4A 為PCA 散點(diǎn)圖，數(shù)據(jù)經(jīng)降維處理后，獲得PC1=97.7%，PC2=1.5%，累積達(dá)99.2%，說明變量的第一和第二主成分在山楂果實(shí)類黃酮化合物含量具有極高代表性。圖4B為PCA 結(jié)果載荷圖，結(jié)果顯示黑色毛山楂與矢車菊-3-O-半乳糖苷、矢車菊素-阿拉伯糖苷/木糖苷、兒茶素、蘆丁、金絲桃苷、異槲皮素和芹菜素-O-葡萄糖苷在PC1上呈正相關(guān)關(guān)系；紅色毛山楂與表兒茶素、原花青素三聚體、原花青素四聚體、原花青素五聚體、原花青素B2/B4/B5和牡荊素異構(gòu)體在PC2上呈正相關(guān)關(guān)系?；谳d荷圖（Loading plot，圖4B）可以篩選出分類貢獻(xiàn)較大的變量，橫坐標(biāo)方向上遠(yuǎn)離原點(diǎn)的變量對(duì)兩組樣本的區(qū)分貢獻(xiàn)更大（矢車菊-3-O-葡萄糖苷、新綠原酸）。

圖4 黑色與紅色毛山楂類黃酮化合物PCA散點(diǎn)圖（A）和載荷圖（B）Figure 4 PCA scatter plot (A) and load plot (B) of flavonoid compounds in black and red hawthorn

OPLS-DA 分析是以變量的重要性為主要依據(jù)，從而對(duì)代謝物質(zhì)進(jìn)行選擇和甄別，更能把握多維數(shù)據(jù)整體的特征以及變異規(guī)律。模型驗(yàn)證Permutations Test圖顯示（圖5B），R2Y=0.994，Q2=0.983。這些模型參數(shù)指數(shù)均大于0.5且接近于1，符合試驗(yàn)數(shù)據(jù)模型的預(yù)期，說明建立的OPLS-DA 模型可以有效地揭示黑色與紅色毛山楂果實(shí)中類黃酮化合物的差異。

圖5 黑色與紅色毛山楂類黃酮物質(zhì)OPLS-DA圖（A）和模型檢驗(yàn)圖（B）Figure 5 OPLS-DA plots (A) and permutations test (B) of flavonoid compounds in black and red hawthorn

3 討論與結(jié)論

山楂重要的功效成分為類黃酮化合物，其主要成分為牡荊素鼠李糖苷、單乙酰牡荊素鼠李糖苷以及金絲桃苷等物質(zhì)[19]。前期相關(guān)研究通過測(cè)定東北三省不同來源地的野生山楂資源果實(shí)發(fā)現(xiàn)，其黃酮類物質(zhì)蘆丁、金絲桃苷和槲皮素的含量分別為6.8～217.5，159.6～1312.9，6.2～132.6 μg·g-1[20]。白婧[21]研究結(jié)果顯示，磨盤等10份遼寧山楂主栽品種果實(shí)中，蘆丁含量為3.32 μg·g-1（蒙陰大金星）至51.76 μg·g-1（大黃）；牡荊素含量為17.55 μg·g-1（蒙陰大金星）至364.79 μg·g-1（大黃）；金絲桃苷含量為209.0 μg·g-1（蒙陰大金星）至684.24 μg·g-1（大黃）；槲皮素含量為1.14 μg·g-1（遼紅）至3.56 μg·g-1（秋金星）。本研究中，黑色毛山楂果實(shí)富含蘆?。?7.11 μg·g-1）、金絲桃苷（901.96 μg·g-1）和異槲皮素（55.25 μg·g-1）；紅色毛山楂果實(shí)牡荊素異構(gòu)體含量相對(duì)較高（72.47 μg·g-1）（表3）。黑色與紅色毛山楂果實(shí)金絲桃苷的含量均顯著高于部分山楂栽培品種，但低于部分野生山楂資源。此外，本研究在黑色和紅色毛山楂果實(shí)中，還測(cè)定出了芹菜素-O-葡萄糖苷和槲皮素-O-(-O-丙二?；?-葡萄糖這兩種黃酮類化合物。

原花青素，特別是低聚原花青素（oligomeric proanthocyanidins）是山楂果實(shí)的主要酚類物質(zhì)[22]。羽裂山楂大果變種干燥果實(shí)中，以表兒茶素和原花青素B2為主，其含量分別為1 930 μg·g-1（大金星）至11 700 μg·g-1（山東大金星），20 600 μg·g-1（大金星）至123 600 μg·g-1（山東大金星）[23]。本研究中，黑色毛山楂鮮果表兒茶素含量為9 990.65 μg·g-1，紅色毛山楂鮮果中含量達(dá)12 844.31 μg·g-1（表4），兩份毛山楂均屬于原花青素含量較高的山楂資源。

花色苷是影響園藝植物果實(shí)顏色的主要類黃酮物質(zhì)之一。國(guó)內(nèi)的栽培山楂果實(shí)主要以紅色、橙色或黃色為主。蒙陰大金星等10個(gè)遼寧主栽品種果實(shí)中主要含矢車菊-3-O-半乳糖苷和矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷，其中矢車菊-3-O-半乳糖苷含量在110.51 μg·g-1（費(fèi)縣大綿球）至1 101.97 μg·g-1（興隆紫肉）；矢車菊-3-O-阿拉伯糖苷含量在3.52 μg·g-1（磨盤山楂）至22.43 μg·g-1（興隆紫肉）[21]。本研究中，黑色毛山楂果實(shí)的矢車菊-3-O-半乳糖苷（1 323.66 μg·g-1）含量是紅色毛山楂的1.59 倍（表5），亦是山楂栽培品種興隆紫肉的1.21 倍，屬于花青素含量較高的山楂資源。

此外，矢車菊-3-O-葡萄糖苷是接骨木莓果、黑莓、桑椹、楊梅等園藝植物果實(shí)花青苷的主要成分，其中臺(tái)灣46C 桑葚鮮果含量達(dá)1 337 μg·g-1；黑莓鮮果含量達(dá)1 387.2 μg·g-1；接骨木莓果鮮果中的含量可達(dá)7 941.3 μg·g-1[24-26]。本研究中，紅色毛山楂未檢測(cè)到矢車菊-3-O-葡萄糖，黑色毛山楂果實(shí)矢車菊-3-O-葡萄糖苷含量高達(dá)3 149.17 μg·g-1。因此，富含矢車菊-3-O-半乳糖苷和矢車菊-3-O-葡萄糖苷的黑色毛山楂可為提升山楂果實(shí)品質(zhì)奠定資源基礎(chǔ)。

本研究通過測(cè)定黑色與紅色毛山楂果實(shí)色差值，并結(jié)合超高效液相色譜質(zhì)譜技術(shù)檢測(cè)兩種山楂資源果實(shí)類黃酮化合物的含量差異，結(jié)果顯示黑色毛山楂中蘆丁、金絲桃苷等黃酮類化合物，矢車菊-3-O-半乳糖苷等花青素類化合物含量較高，且僅在黑色毛山楂果實(shí)中鑒定出大量的矢車菊-3-O-葡萄糖苷。研究結(jié)果將為山楂果實(shí)顏色及品質(zhì)的改良提供參考依據(jù)。