張 琪，劉 爽，胡艷娟，王曉雪

（沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)水稻研究所，沈陽 110161）

在自然環(huán)境中，植物始終面臨著很多與它們生存相關(guān)的生物與非生物脅迫。為了應(yīng)對逆境，植物進化出不同的機制來調(diào)節(jié)自身的生長發(fā)育[1-6]。泛素(ubiquitin)是小分子量的蛋白質(zhì)，含有76個氨基酸。蛋白質(zhì)的泛素化(ubiquitination)是指在一系列酶的催化下，將泛素分子連接到靶標(biāo)蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上的過程，是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的重要形式，被多泛素化的蛋白質(zhì)通過26S蛋白酶體降解[7]。這一過程在調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中扮演重要角色，同時也是調(diào)控植物對生物、非生物脅迫響應(yīng)的重要機制之一[5,7-8]。水稻中的RMD Interacting Proteins(OsRIP)基因家族含有Really Interesting New Gene(RING)-HC 結(jié)構(gòu)域和SEVEN IN ABSENTIA(SINA)結(jié)構(gòu)域，是典型的E3泛素連接酶[9-10]。鑒定和分析水稻中RIP基因家族成員和編碼蛋白質(zhì)的理化特性、結(jié)構(gòu)域和進化關(guān)系，分析其在激素和非生物脅迫處理后的表達模式，對深入研究水稻RIP基因家族在激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及非生物脅迫響應(yīng)中的作用具有重要的理論和實踐意義。

蛋白質(zhì)的泛素化(ubiquitination)是指在E1泛素激活酶(E1 ubiquitin-activating enzyme)、E2泛素結(jié)合酶(E2 ubiquitin-conjugating enzyme)、E3泛素連接酶(E3 ubiquitin ligase)的催化下，將泛素分子連接到蛋白質(zhì)的賴氨酸殘基上，對蛋白質(zhì)進行翻譯后修飾的過程。被多泛素化的蛋白質(zhì)通過26S 蛋白酶體(26S proteasome system)降解，被稱為泛素化介導(dǎo)的26S蛋白酶體降解途徑[7]。E3泛素連接酶是決定底物特異性的關(guān)鍵酶，它能夠?qū)⒎核胤肿优c靶蛋白的賴氨酸殘基結(jié)合，從而降解、調(diào)控靶蛋白[11-13]。目前在植物中已發(fā)現(xiàn)數(shù)百種E3泛素連接酶，共分為四種類型，分別為RING 泛素連接酶、homologous to E6-AP carboxy terminus (HECT)泛素連接酶、U-box 泛素連接酶以及Cullin-RING ligases (CRLs)泛素連接酶[7,14-15]。其中RING 型E3 泛素連接酶數(shù)量最多，在調(diào)節(jié)種子萌發(fā)、開花期、激素響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[16-18]，研究發(fā)現(xiàn)，Delayed Seed Germination 1 (OsDSG1) 是一種C3HC4 型RING 泛素連接酶，通過與Rice ABA Insensitive 3(OsABI3)相互作用，調(diào)節(jié)水稻生長發(fā)育。osdsg1 基因功能缺失突變體的種子萌發(fā)延遲，耐鹽和耐旱能力顯著增強[19]。水稻中的SINA 型E3泛素連接酶Flowering-Related RING Protein 1(FRRP1)與Rice Histine 2B(OsH2B)互作，通過影響Heading date 3a(Hd3a)的表達來調(diào)控水稻開花期[20]。近年來，RING型E3泛素連接酶在各種非生物脅迫響應(yīng)中發(fā)揮的作用被廣泛研究[21-25]。研究發(fā)現(xiàn)，含有RING 結(jié)構(gòu)域的E3 泛素連接酶Salt-induced RING finger protein 4 (OsSIRP4) ，可以使Peroxisomal membrane protein 11-1(OsPEX11-1)蛋白多泛素化降解，對鹽脅迫起負向調(diào)節(jié)作用，過表達OsSIRP4 的轉(zhuǎn)基因植株表現(xiàn)出對鹽敏感的表型[26]。C3HC4 型RING 泛素連接酶RING finger protein v6(OsRFPv6)通過調(diào)控Na+離子吸收影響水稻的耐鹽性，是鹽脅迫的正向調(diào)節(jié)因子[12,26]。

SINA型E3泛素連接酶是RING型泛素連接酶的成員，它的特點是N端含有一個RING結(jié)構(gòu)域，負責(zé)結(jié)合E2蛋白分子，對SINA 型E3 泛素連接酶活性具有決定性作用；C 端含有一個SINA 結(jié)構(gòu)域，在動物和植物中高度保守[27]。SINA型E3泛素連接酶在調(diào)控植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用[21,28-29]。香蕉(Musa acuminata)中的SINA 型E3 泛素連接酶MaSINA1 通過調(diào)節(jié)INDUCER of CBF Expression 1(MaICE1)的穩(wěn)定性而對冷脅迫起著負向調(diào)節(jié)作用[30]。在玉米和水稻中，Salt-and Drought-Induced RING finger 1(SDIR1)超表達轉(zhuǎn)基因株系耐旱性增強，進一步研究發(fā)現(xiàn)SDIR1 通過調(diào)節(jié)其靶蛋白SDIR1-Interacting Protein 1(SDIRIP1)的穩(wěn)定性來調(diào)控對鹽和干旱的反應(yīng)[13]。E3 泛素連接酶在調(diào)控植物的生長發(fā)育、逆境響應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用，但對水稻中具有E3 泛素連接酶活性的OsRIP基因家族的系統(tǒng)鑒定及在逆境響應(yīng)過程中的作用未見詳細報道。本研究鑒定了水稻RIP基因家族的所有成員，分析OsRIP 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)、蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、保守基序、進化關(guān)系、分析OsRIP基因的染色體定位，共線性，啟動子順式作用元件、表達模式以及在非生物脅迫響應(yīng)中的表達模式，為深入研究OsRIP在水稻生長發(fā)育和逆境響應(yīng)過程中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 水稻材料與處理

用75%的酒精處理沈農(nóng)9816(SN9816)種子1 min，在30 ℃的條件下浸種、催芽；將發(fā)芽的種子在14 h光照、10 h黑暗的條件下培養(yǎng)2周。然后，將培養(yǎng)2周的幼苗分別用20%聚乙二醇(polyethylene glycol,PEG)、150 mmol·L-1NaCl、100 mmol·L-1甘露醇(mannitol)、用100 μM 脫落酸(abscisic acid, ABA) 和100 μM 茉莉酸(jasmonic acid,JA)處理幼苗，在處理后0，6，12 h后分別采樣，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方法

1.2.1 水稻OsRIP家族成員的全基因組鑒定 在Ensembl Plants數(shù)據(jù)庫(http://plants.ensembl.org/index.html)下載各物種全基因組數(shù)據(jù)。利用保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測網(wǎng)站Pfam(http://pfam.xfam.org/)和SMART(http://smart.embl.de/)進行結(jié)構(gòu)域分析，下載基因的隱馬爾可夫模型，在不同物種的全基因組蛋白序列數(shù)據(jù)中檢索，運用BLAST對數(shù)據(jù)庫進行比對，將所得到的序列合并去掉重復(fù)，獲取RIPs基因家族的備選成員，閾值設(shè)定為E＜1e-5。將所有鑒定得到的候選基因序列提交到InterPro數(shù)據(jù)庫(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)、SMART數(shù)據(jù)庫以及NCBI CDDsearch數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)驗證蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.2.2OsRIP基因家族的特征分析 利用ExPASy Proteomics Server網(wǎng)站(http://web.expasy.org/protparam/)在線分析6個基因的氨基酸數(shù)、相對分子量、理論等電點、不穩(wěn)定系數(shù)[31]。利用亞細胞定位預(yù)測網(wǎng)站PSORT Prediction(http://psort1.hgc.jp/form.html/)進行蛋白定位分析。利用GSDS 2.0(http://gsds.gao-lab.org/)繪制基因結(jié)構(gòu)圖。利用Mapchart軟件工具進行OsRIP基因染色體位置可視化分析。

1.2.3 保守基序分析 為了鑒定RIP蛋白家族中的保守基序，使用在線分析網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/)分析了OsRIP基因家族基序，基序數(shù)量設(shè)置為8個，其余參數(shù)默認。

1.2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析 將基因家族成員用MEGA軟件進行序列比對，以最大釋然法(Maximum Likelihood)構(gòu)建進化樹。用進化樹美化軟件EvolView(https://www.evolgenius.info/evolview-v2/#login)生成進化樹。

1.2.5 順式作用元件分析 基于水稻基因組數(shù)據(jù)，使用TBtools軟件提取OsRIP基因家族上游2000 bp(起始密碼子ATG之前)序列作為順式作用元件分析序列。使用在線分析網(wǎng)站PlantCARE(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)進行順式作用元件的分析[32]。

1.2.6 表達模式分析 用在光照14 h和黑暗10 h條件下生長2周齡的沈農(nóng)9816(SN9816)的幼苗，在脅迫和激素處理前后采樣。提取樣品的總RNA，最后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行quantitative RT-PCR (qRT-PCR)。qRT-PCR所用引物如表1。微陣列數(shù)據(jù)來自水稻表達譜數(shù)據(jù)庫RiceXPro(https://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)。用50 μM ABA 和100 μM JA處理水稻四葉老苗0，1，3，6，12 h；進行3次生物重復(fù)，用處理后的幼苗進行微陣列分析。用TBtools繪制熱圖[33]。

表1 引物列表Table 1 The list of primer sequences

2 結(jié)果與分析

2.1 水稻中OsRIP基因家族的鑒定及蛋白的理化性質(zhì)分析

OsRIP1 是E3 泛素連接酶，具有SINA 保守的結(jié)構(gòu)域[9]。為了鑒定水稻中OsRIP基因家族的成員，本研究利用有保守的SINA 結(jié)構(gòu)域的OsRIP1，檢索水稻全基因組，共有6 個編碼SINA 結(jié)構(gòu)域的基因，進一步利用Inter-Pro、SMART 和NCBI數(shù)據(jù)庫對水稻中OsRIP 蛋白家族進行了鑒定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在水稻中共存在6個OsRIP 蛋白，分別命名為OsRIP1～6(圖2A)。

本研究利用ExPASy Proteomics Server 網(wǎng)站分析了OsRIP家族蛋白質(zhì)的氨基酸數(shù)、相對分子量、理論等電點(isoelectronic point,PI)、不穩(wěn)定系數(shù)，并通過PSORT Prediction 網(wǎng)站預(yù)測了該蛋白家族的亞細胞定位。結(jié)果表明，OsRIP 理論等電點在6.26～7.51，其中只有OsRIP5 的PI 值大于7，為堿性蛋白質(zhì)，其余5 個成員的PI 值小于7，為酸性蛋白質(zhì)(表2)。不穩(wěn)定系數(shù)除OsRIP6 外均大于40，表明該基因家族編碼的蛋白大多為不穩(wěn)定蛋白。OsRIP家族CDS 編碼區(qū)的長度在906～1086 bp，氨基酸(amino acid,aa)數(shù)量在301～361 aa，相對分子量在34.1～39.2 kDa。亞細胞定位預(yù)測的結(jié)果為OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3、OsRIP4、OsRIP6 定位在細胞質(zhì)中，而OsRIP5 在細胞核、細胞質(zhì)和質(zhì)膜上均有分布(表2)。

表2 水稻OsRIP基因家族成員及其編碼蛋白的理化性質(zhì)Table 2 OsRIP gene family members and physicochemical properties of the encoded proteins in rice

2.2 OsRIP基因家族的染色體定位

利用Mapchart 軟件分析了OsRIP基因在染色體上的位置，結(jié)果顯示，在水稻的12條染色體上只有1，2，3，5，7 染色體上分布著OsRIP基因，在2 號染色體上有Os-RIP1和OsRIP4兩個基因，他們之間的間隔為9.6 Mb，并不是串聯(lián)重復(fù)基因。在1，3，5，7號染色體分別只含有1個OsRIP基因(圖1)。

圖1 OsRIP基因在染色體中的定位Figure 1 Location and distribution of OsRIP genes in chromosomes

2.3 基因結(jié)構(gòu)分析

基因結(jié)構(gòu)的多樣性是研究基因家族功能和進化的重要依據(jù)。本研究利用MEGA-X 軟件繪制水稻中Os-RIP基因家族的系統(tǒng)發(fā)育進化樹，并將這6 個蛋白分為了3 個亞家族，其中OsRIP1，OsRIP2，OsRIP3 為第Ⅰ亞家族，OsRIP5、OsRIP6為第Ⅱ亞家族，OsRIP4為第Ⅲ亞家族(圖2A)。本研究利用GSDS網(wǎng)站分析了基因結(jié)構(gòu)進行，發(fā)現(xiàn)基因家族成員含有3～4 個外顯子和2～3 個內(nèi)含子(圖2B)。與系統(tǒng)發(fā)育進化樹相結(jié)合分析發(fā)現(xiàn)其內(nèi)含子與外顯子的分布可能與進化關(guān)系有關(guān)，第Ⅰ亞家族均含有2 個內(nèi)含子，3 個外顯子；而第Ⅱ、Ⅲ亞家族含有3個內(nèi)含子和3個外顯子(圖2A,圖2B)。

圖2 OsRIP家族基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析Figure 2 Analysis of gene structure and conserved domains of OsRIP family

不同的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域通常具有不同的功能。本研究利用Pfam 數(shù)據(jù)庫分析了OsRIP 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，所有OsRIP 蛋白質(zhì)C 端含有SINA 結(jié)構(gòu)域，N 端為RING-HC 結(jié)構(gòu)域(圖2C)。OsRIP 蛋白序列比對的結(jié)果表明，SINA和RING-HC結(jié)構(gòu)域在水稻中是保守的(圖2D)。

2.4 水稻OsRIP蛋白保守基序分析

本研究利用MEME 網(wǎng)站分析了OsRIP基因家族保守基序(motif),分析發(fā)現(xiàn)，OsRIP 蛋白質(zhì)共有8個基序，含有15～50 aa 的氨基酸序列(表3)。

表3 OsRIP蛋白的基序信息Table 3 The motifs information of OsRIP proteins

為進一步揭示OsRIP蛋白進化與保守基序的關(guān)系，本研究利用TBtools繪制了OsRIP系統(tǒng)進化、保守基序分析圖。結(jié)果表明，親緣關(guān)系越近的蛋白，motif的數(shù)量和位置越相似。OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3蛋白親緣關(guān)系更近，它們均含有8 個motif，且分布位置、順序相對一致，N 端均為Motif 8，C 端均為Motif 7(圖3)。Motif 7、Motif 8為第Ⅰ亞家族OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3 特有的。OsRIP4、OsRIP5、OsRIP6 只有6 個Motif，OsRIP5、OsRIP6 在同一亞家族，motif 的種類、數(shù)量和位置完全一致。Motif 1、Motif 2、Motif 3、Motif 4、Motif 5 及Motif 6 在OsRIP 家族所有成員中均存在。以上結(jié)果表明OsRIP基因家族Motif高度保守。

圖3 OsRIP基因家族保守基序Figure 3 Conserved motif of OsRIP gene family

2.5 進化分析

本研究在Ensembl Plants 數(shù)據(jù)庫下載了水稻、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、擬南芥(Arabidopsis thaliana)、大麥(Hordeum vulgare) 和小麥(Triticum aestivum) 的全基因組數(shù)據(jù)。利用保守結(jié)構(gòu)域預(yù)測網(wǎng)站Pfam 和SMART 分析OsRIP1 結(jié)構(gòu)域，下載基因的隱馬爾可夫模型，在不同物種的全基因組蛋白序列數(shù)據(jù)中檢索，運用BLAST對數(shù)據(jù)庫進行比對，閾值設(shè)定為E＜1e-5。將所有鑒定得到的RIP 候選基因序列提交到InterPro 數(shù)據(jù)庫、SMART數(shù)據(jù)庫以及NCBI數(shù)據(jù)庫驗證蛋白保守結(jié)構(gòu)域，每個蛋白都包含SINA 這一保守的結(jié)構(gòu)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIP 蛋白在不同物種中的數(shù)量分別為：玉米中10 個，大豆中40 個，大麥中27 個，小麥中72 個，擬南芥中17 個。為了分析RIP 家族各成員之間的進化關(guān)系，利用MEGA軟件構(gòu)建了一個系統(tǒng)發(fā)育進化樹。水稻中的OsRIP5、OsRIP6 分布在第Ⅱ組，OsRIP4、OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3在第Ⅲ組，但OsRIP4與OsRIP1、OsRIP2、OsRIP3距離較遠(圖4)。通過統(tǒng)計與水稻中OsRIP基因在同一組中的其他物種中的同源基因的數(shù)量發(fā)現(xiàn)，小麥、玉米中同源基因的數(shù)量最多，分別為15個和8個。大麥中的同源基因有4個，而擬南芥中有2個，且距離較遠。這些結(jié)果表明，水稻中OsRIP基因和玉米、小麥中的同源基因進化關(guān)系較近，而與擬南芥中的同源基因進化關(guān)系較遠。

圖4 RIP基因家族系統(tǒng)發(fā)育樹Figure 4 Phylogenetic trees of RIP gene family

2.6 共線性分析

為了進一步研究RIP蛋白在水稻中系統(tǒng)進化機制，分析水稻和其他物種中RIP的線性關(guān)系，本研究分析了水稻中OsRIP 與玉米、小麥、大麥、大豆、擬南芥的基因共線性。結(jié)果顯示，水稻中的OsRIP 蛋白與玉米之間存在最多的同源基因共線對，一共為9 個；與大麥之間存在5 個共線對，與大豆和小麥之間分別存在3 個共線對(圖5)。說明玉米、大麥、小麥、大豆的RIP蛋白和水稻中的OsRIP進化關(guān)系更近。與擬南芥之間不存在共線對，也就是說RIP 蛋白在水稻和擬南芥這兩個物種間進化關(guān)系較遠。進一步分析發(fā)現(xiàn)，1 號染色體上的OsRIP3 與其他物種間都存在共線對(圖5)，這表明在進化過程中，RIP3在RIP家族中有重要作用。

圖5 水稻、玉米、大麥、小麥、大豆、擬南芥中RIP家族基因的共線性關(guān)系Figure 5 Syntenic relationships of RIP gene family in rice, maize, barley, wheat, soybean,Arabidopsis.

2.7 順式作用元件分析

在調(diào)控基因功能的過程中，啟動子活性起著至關(guān)重要的作用，為了解RIP 的調(diào)控機制，本研究分析了Os-RIP基因家族啟動子區(qū)域的順式作用元件。選取OsRIP上游2000 bp 的序列，用PlantCARE 網(wǎng)站分析其順式作用元件，結(jié)果表明，在所有OsRIP基因的啟動子區(qū)都發(fā)現(xiàn)了逆境相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合元件，如厭氧誘導(dǎo)元件、低溫響應(yīng)元件(圖6A)，這表明RIP家族可能受非生物脅迫誘導(dǎo)表達。此外，在OsRIP基因的啟動子區(qū)還發(fā)現(xiàn)了光響應(yīng)元件、脫落酸(ABA)響應(yīng)的順式元件ABA response element (ABRE)和CGTCA-motif 和TGACG-motif 茉莉酸甲酯(MeJA)響應(yīng)的順式元件(圖6A)。

圖6 OsRIP啟動子順式作用元件分析(A)及ABA、JA處理下的表達模式(B～C)Figure 6 The cis-acting elements in the promoters of OsRIP(A) and expression of OsRIP under ABAJA treatment(B～C)

為了研究OsRIP是否被ABA、MeJA 激素誘導(dǎo)表達，本研究以用100 μM ABA 和100 μM JA 處理水稻幼苗，進行qRT-PCR。結(jié)合RiceXPro 數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)和qRT-PCR 數(shù)據(jù)，結(jié)果表明，OsRIP1-5在ABA、JA 處理6 h 和12 h 被誘導(dǎo)表達，OsRIP6在ABA 處理時表達水平上調(diào)，而JA 處理時表達水平下調(diào)，這表明OsRIP6被ABA 誘導(dǎo)表達，被JA抑制表達(圖6)。

2.8 OsRIP基因表達模式分析

基因表達的特異性通常與其功能相關(guān)，為了研究OsRIP基因家族在水稻生長發(fā)育過程中的作用，本研究利用RiceXPro 數(shù)據(jù)庫中的微陣列數(shù)據(jù)檢測了OsRIP基因的表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsRIP基因在所有器官和組織中都有表達，未見明顯的組織特異性表達(圖7)。但是，OsRIP家族不同的基因表達水平差異較大，其中Os-RIP1、OsRIP2與OsRIP3在根中表達水平較高；OsRIP1與OsRIP4和OsRIP6在莖中表達水平較高；OsRIP3、Os-RIP4和OsRIP6在花器官中有較高水平的表達。對不同時期OsRIP基因的表達水平分析發(fā)現(xiàn)，OsRIP1、Os-RIP2、OsRIP3、OsRIP4在播種后的48～69 d，表達水平均處于整個生育期相對高的水平，OsRIP6在播種后83 d達到表達水平最高值。由于OsRIP基因的順式作用元件中含有光響應(yīng)元件，對其晝夜的表達模式進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在給光后10 hOsRIP基因表達水平最高，這一結(jié)果表明OsRIP基因能夠被光誘導(dǎo)表達(圖7C)。

圖7 OsRIP在各個器官(A)、各個生育時期(B)及晝夜節(jié)律的表達模式(C)Figure 7 Expression of OsRIP in different organs(A), developmental stages(B) and natural photoperiod(C)

參與調(diào)控非生物脅迫的基因往往被非生物脅迫誘導(dǎo)表達，因此，本研究進一步檢測了OsRIP基因家族在150 mmol·L-1NaCl、20%PEG、100 mmol·L-1甘露醇等脅迫下的表達模式。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，OsRIP1-5均能夠被鹽、PEG、甘露醇不同程度的誘導(dǎo)表達。其中，在鹽處理下，OsRIP5被誘導(dǎo)表達水平最高，在PEG 和甘露醇模擬干旱處理下，OsRIP4被誘導(dǎo)表達水平最高。而OsRIP6與其他成員的表達模式不同，只有在PEG 處理6 h 被誘導(dǎo)表達，在12 h時表達水平降低，而鹽、甘露醇脅迫處理后均使OsRIP6的表達被抑制(圖8)。

圖8 OsRIP在鹽、PEG、甘露醇處理下的表達模式Figure 8 The expression of OsRIP under NaCl,PEG,mannitol treatment

3 討論與結(jié)論

3.1 水稻中的OsRIP的功能具有多樣性

泛素蛋白酶系統(tǒng)積極參與調(diào)節(jié)植物對非生物脅迫的響應(yīng)，RING型E3泛素連接酶調(diào)控植物對干旱脅迫、鹽脅迫等非生物脅迫的抗性。本研究是在水稻基因組中，鑒定到6個具有SINA結(jié)構(gòu)域的OsRIP基因，對其基因結(jié)構(gòu)和結(jié)構(gòu)域分析結(jié)果顯示，該基因家族的內(nèi)含子數(shù)量在2～3 個。有研究表明內(nèi)含子的數(shù)量與在發(fā)育過程中環(huán)境的適應(yīng)能力相關(guān)，沒有內(nèi)含子或內(nèi)含子較少是植物進化的結(jié)果[34-35]，OsRIP基因家族的內(nèi)含子數(shù)量不同，表明RIP 在進化上的進程和生物學(xué)功能可能不同。其染色體定位結(jié)果表明，6 個基因分布在5 條染色體上，沒有串聯(lián)重復(fù)基因，這一結(jié)果表明OsRIP可能起源于不同的祖先，具有進化的多樣性。有研究表明OsRIP5（OsIDS1）調(diào)控水稻的抗旱性[10]，而另一個研究則證實了OsRIP1-6的六重突變體表現(xiàn)出嚴(yán)重的生長發(fā)育缺陷的表型[9]。這些結(jié)果均說明了OsRIP家族在水稻中的功能具有多樣性。

3.2 光、ABA、JA及非生物脅迫誘導(dǎo)OsRIP的表達

基因的時空表達通常與基因功能相關(guān)[36]，OsRIP家族的基因在水稻的各個時期以及各個器官均有表達，表明其基因家族可能參與調(diào)控水稻發(fā)育的多個進程。啟動子順式作用元件的分布和類型決定了基因的表達與功能[37]，為了更多的了解調(diào)控OsRIP表達的機制，對啟動子順式作用元件進行了分析，結(jié)果顯示ABRE、G-Box、ARE、CGTCA-motif 等響應(yīng)光、激素和非生物脅迫的順式作用元件，在OsRIP的啟動子區(qū)中大多都有存在，因此猜測OsRIP可能與光響應(yīng)、激素響應(yīng)及脅迫的耐受性相關(guān)。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及定量RT-PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsRIP家族中ABA、JA 激素處理能夠誘導(dǎo)OsRIP1～5基因的表達；同時OsRIP1～5也能夠被鹽、甘露醇、PEG 誘導(dǎo)表達，這一結(jié)果表明OsRIP1-5可能參與調(diào)節(jié)植物對干旱和鹽脅迫的耐受性。而晝夜表達節(jié)律的結(jié)果表明該家族所有成員都能被光誘導(dǎo)表達，在10 h出現(xiàn)了表達高峰。

3.3 RIP在進化上具有保守性

水稻是重要的糧食作物，同時也是單子葉植物的主要模式植物。共線性分析的結(jié)果表明，水稻與玉米、大麥等單子葉植物之間存在更多的共線性，而與擬南芥之間沒有共線性，這一結(jié)果說明RIP蛋白在單子葉植物中的進化是相對保守的。在多物種的系統(tǒng)發(fā)育樹中，一個亞群中的基因具有相似的功能。在本研究中，利用水稻和其他物種的氨基酸序列對RIP家族進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明，單子葉和雙子葉的同源基因在同一組上，MEME 分析結(jié)果顯示，RIP 蛋白有8個保守的motif，在系統(tǒng)發(fā)育樹同一個亞家族的蛋白，motif越相似。以上結(jié)果表明，RIP蛋白比單子葉和雙子葉植物的差異更原始。

在水稻的全基因組中鑒定到6個RIP基因，分布在5條染色體上。編碼區(qū)長度在906～1086 bp之間，在水稻中，OsRIP基因家族所有成員結(jié)構(gòu)域非常保守，均含有SINA 和RING 結(jié)構(gòu)域。通過分析水稻與其他物種的共線性發(fā)現(xiàn)，與玉米存在最多的共線對，進化關(guān)系更近，與擬南芥不存在共線對，進化關(guān)系較遠。水稻RIP家族基因在不同組織器官、不同時期的表達模式略有差異但均有表達；OsRIP6在JA、鹽處理、甘露醇處理的條件下呈現(xiàn)出明顯的下調(diào)表達，而OsRIP1～5在ABA、JA、鹽處理、PEG處理、甘露醇處理后均呈現(xiàn)明顯的上調(diào)表達，表明Os-RIP1～5能夠積極參與調(diào)控激素和逆境脅迫的響應(yīng)。