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齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院附屬第三醫(yī)院兒科，黑龍江齊齊哈爾 161000

急性肺炎是一種主要影響肺部的急性下呼吸道感染。臨床表現(xiàn)癥狀重、并發(fā)癥多，嚴(yán)重者可危及患兒生命[1-3]。許多最常見病原體抗生素耐藥性的日益流行使這一挑戰(zhàn)變得更加困難[4-6]。因此，探索更加安全、有效的治療方法成為臨床上亟待解決的問題。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是最近發(fā)現(xiàn)的一種重要的RNA轉(zhuǎn)錄物，沒有蛋白質(zhì)編碼潛力。但以順式或反式介導(dǎo)基因表達(dá)發(fā)揮多種生物功能[7-8]，但lncRNA作為內(nèi)皮細(xì)胞對急性肺損傷應(yīng)答的潛在參與者的調(diào)控作用尚未得到詳細(xì)研究。RMRP是RNase MRP復(fù)合物的一部分。研究證實RMRP可通過調(diào)控TGFβ/Smand信號，而該信號通路在急性肺損傷纖維化的發(fā)生、發(fā)展中具有重要作用[9-10]，基于此，本實驗采用LPS處理肺上皮細(xì)胞模擬急性肺損傷探究LncRNA RMRP對肺上皮細(xì)胞凋亡和炎癥因子表達(dá)的影響，為探究LncRNA RMRP作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B購自上海ATCC細(xì)胞庫，脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、陽離子脂質(zhì)體2000均購自GIBCO公司，載體均購自金斯瑞公司。CCK-8試劑購自DOJINDO，白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β, IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6,IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α,TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒均購自武漢伊艾博科技有限公司，細(xì)胞周期特異性凋亡試劑盒購自BD公司，Trizol試劑及逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自invitrogen公司，抗體購自Abcam公司。

1.2 方法

使用完全培養(yǎng)基（DMEM+10%FBS）培養(yǎng)BEAS-2B細(xì)胞，以2×105個/mL密度接種24孔板中，37℃，5%CO2，1 h后用50 μg/mL的LPS處理，命名為LPS組，24 h后收集細(xì)胞待用。取對數(shù)生長期的BEAS-2B細(xì)胞，以2×105個/mL密度接種24孔板中，參照Lipofectamine 2000試劑說明書將干擾RMRP的載體sh-RMRP及其對照載體Si-CON分別染至BEAS-2B細(xì)胞，48 h后分別以50 μg/mL LPS處理，分別命名為LPS+Si-RMRP組和LPS+Si-CON組，以空白細(xì)胞作為對照組，每組設(shè)置9個復(fù)孔，24 h后收集待用。

1.3 觀察指標(biāo)

①LncRNA RMRP的表達(dá)：提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄cDNA并作為PCR的模板，以熒光定量PCR試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，計算LncRNA RMRP的相對量。②細(xì)胞增殖率及凋亡率：CCK-8檢測細(xì)胞增殖率，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。③炎癥因子：按照ELISA檢測試劑盒說明書檢測IL-1β、IL-6、TNF-α的表達(dá)水平。④蛋白表達(dá)：Western blot 檢測Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，符合正態(tài)分布的計量資料用（±s）表示，采用t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LPS組與對照組肺泡上皮細(xì)胞中的LncRNA RMRP及炎性因子表達(dá)比較

與對照組相比，LPS組BEAS-2B細(xì)胞中LncRNA RMRP、IL-1β、IL-6、TNF-α及凋亡率的表達(dá)量顯著升高，細(xì)胞存活率顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。Bcl-2蛋白表達(dá)顯著降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白相對表達(dá)量顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

圖1 各組細(xì)胞Bcl-2、Bax、Caspase-3及cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)

表1 LPS組與對照組肺泡上皮細(xì)胞中的LncRNA RMRP及炎性因子表達(dá)比較(±s)

組別對照組（n=9）LPS組（n=9）t值P值RMRP表達(dá)量1.01±0.12 4.05±0.27 30.867＜0.001 IL-1β（ng/L）55.87±4.32 186.38±12.14 30.385＜0.001 IL-6（ng/L）114.45±10.01 334.29±19.56 30.016＜0.001 TNF-α（ng/L）128.89±11.17 358.40±20.76 29.207＜0.001細(xì)胞凋亡率（×10-2）5.13±0.48 11.69±1.59 11.849＜0.001細(xì)胞存活率（×10-2）100.47±3.87 81.06±4.45 9.874＜0.001

2.2 沉默表達(dá)LncRNA RMRP對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的影響

與LPS+Si-CON組相比，LPS+Si-RMRP組肺上皮細(xì)胞中RMRP表達(dá)、炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達(dá)水平及細(xì)胞凋亡率顯著降低，細(xì)胞存活率顯著上升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低，Bax、cleaved Caspase-3蛋白表達(dá)水平顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

表2 沉默表達(dá)LncRNA RMRP對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的影響(±s)

表2 沉默表達(dá)LncRNA RMRP對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞的影響(±s)

組別LPS+Si-RMRP（n=9）LPS+Si-CON（n=9）t值P值RMRP表達(dá)量0.89±0.06 4.02±0.19 47.127＜0.001 IL-1β（ng/L）69.63±4.81 189.45±11.59 30.385＜0.001 IL-6（ng/L）121.14±10.85 328.22±18.76 30.016＜0.001 TNF-α（ng/L）142.56±11.39 362.31±21.04 29.207＜0.001細(xì)胞凋亡率（×10-2）7.21±0.65 12.14±1.48 11.849＜0.001細(xì)胞存活率（×10-2）92.58±3.47 80.55±4.51 9.874＜0.001

3 討論

急性肺炎是指由肺源性各種致病因子引起的單肺或雙肺組織發(fā)炎，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，進(jìn)而導(dǎo)致的急性呼吸功能不全[11-13]。RMRP是第一個被發(fā)現(xiàn)由細(xì)胞核合成再定向轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體的RNA分子，已有研究發(fā)現(xiàn)LncRNA RMRP可以減輕LPS誘導(dǎo)的急性腎損傷[14-16]，研究中發(fā)現(xiàn)LPS刺激增加了HK-2細(xì)胞中RMRP的表達(dá)。轉(zhuǎn)染干擾RMRP表達(dá)的載體顯著降低LPS誘導(dǎo)的HK-2細(xì)胞中的RMRP水平。在功能上，流式細(xì)胞術(shù)分析表明，LPS 處理后細(xì)胞凋亡率增加，并且RMRP的敲低逆轉(zhuǎn)了LPS對細(xì)胞凋亡的影響。Western印跡結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的Bax表達(dá)增加和Bcl-2表達(dá)減少被HK-2細(xì)胞中RMRP的敲低抵消了。最后，ELISA表明LPS刺激增加了TNF-α、IL-6和IL-1β的水平，并且通過敲低RMRP恢復(fù)了這些結(jié)果。這些發(fā)現(xiàn)表明，RMRP的敲低可抑制膿毒癥誘導(dǎo)的急性腎損傷體外模型中的細(xì)胞凋亡和炎癥因子的產(chǎn)生。但尚未有文獻(xiàn)報道LncRNA RMRP是否參與急性肺炎的發(fā)生和發(fā)展過程[17-18]，因此，本研究以LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B模擬急性肺炎，探討LncRNA RMRP對LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B凋亡、炎性反應(yīng)的作用，結(jié)果顯示，與對照組相比，LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞RMRP、BEAS-2B的IL-1β、IL-6、TNF-α凋亡率、Bax、cleaved Caspase-3蛋白顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞存活率、Bcl-2蛋白顯著降低（P＜0.05），可見LPS誘導(dǎo)肺泡上皮細(xì)胞損傷模型建立成功，采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將干擾RMRP表達(dá)載體轉(zhuǎn)染至LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細(xì)胞BEAS-2B，結(jié)果顯示，LncRNA RMRP沉默表達(dá)RMRP的表達(dá)量（0.89±0.06），顯著低于LPS+Si-CON組的（4.02±0.19）（P＜0.05），RMRP低表達(dá)可以顯著抑制肺泡上皮細(xì)胞凋亡，降低炎性因子水平，促進(jìn)細(xì)胞增殖。

綜上所述，LncRNA RMRP在急性肺炎的發(fā)生和發(fā)展過程發(fā)揮重要作用，有望成為急性肺炎新的治療靶點(diǎn)。