常峰華，鐘志明，李 凡，朱新強，王明濤，陳 功，蘭平秀

（1.云南農業(yè)大學植物保護學院, 云南 昆明 650201；2.云南農業(yè)大學動物科學技術學院, 云南 昆明 650201；3.中國科學院地理科學與資源研究所, 北京 100101；4.中國農業(yè)科學院蘭州畜牧與獸藥研究所, 甘肅 蘭州 730050；5.西藏農牧學院, 西藏 林芝 860000）

紫花苜蓿(Medicago sativa)又稱為紫苜?；蜍俎?，是苜蓿屬一年生或多年生豆科牧草，原產于外高加索和中亞西亞[1]，我國于公元前126 年張騫出使西域時引入，至今已有2 000 多年的栽培歷史[2]。紫花苜蓿的莖葉中含有豐富的蛋白質、維生素、礦質元素，以及皂苷和黃酮等生物活性物質，氨基酸含量平衡，適口性好，奶牛等草食動物喜食，也是青貯飼料和干草飼料的主要原料，具有“牧草之王”的美譽[3]。此外，紫花苜蓿的生態(tài)適應性較強，具有耐寒、抗旱、耐貧瘠和生物固氮的能力，對土壤酸堿度要求不高，具有保持水土、培肥地力的作用，是干旱半干旱地區(qū)植被生態(tài)建設和退耕還草的重要草種[4]。目前紫花苜蓿已在我國西北、東北、內蒙古和華北各大牧區(qū)廣泛栽培，在我國的畜牧業(yè)產業(yè)中發(fā)揮著重要作用。然而，隨著苜蓿種植面積的擴大和種植年限的積累，病毒病相繼發(fā)生并日漸嚴重。

目前報道的侵染苜蓿的病毒至少有47 種[5]，其中，我國發(fā)現的有14 種，分別為苜?；ㄈ~病毒(alfalfa mosaic virus，AMV)、白三葉花葉病毒(white clover mosaic virus，WCMV)、菜豆黃花葉病毒(bean yellow mosaic virus，BYMV)、豇豆花葉病毒(cowpea mosaic virus，CPMV)[6]、菜豆卷葉病毒(bean leafroll virus，BLRV)[7]、番茄花葉病毒(tomato mosaic virus，ToMV)[8]、苜蓿矮化病毒(alfalfa dwarf virus，ADV)[9]、紫 花 苜 蓿 alpha 雙 分 病 毒 1 (Medicago sativaalphapartitivirus 1, MsAPV1)、紫花苜蓿alpha 雙分病毒2 (Medicago sativaalphapartitivirus 2, MsAPV2)、紫 花 苜 蓿 delta 雙 分 病 毒 1 (Medicago sativadeltapartitivirus 1, MsDPV1)、苜?；旌喜《? (Medicago sativaamalgavirus 1, MsAV1)[10]、紫花苜蓿暫時性線條病毒(lucerne transient streak virus, LTSV)、豌豆線條 病 毒(pea streak virus, PeSV)和 苜 蓿 曲 葉 病 毒(alfalfa leaf curl virus, ALCV)[5]，對苜蓿產業(yè)的發(fā)展造成危害[11]。

1 材料與方法

1.1 供試材料

E.coliDH5α 菌株為云南農業(yè)大學工程中心1011植物病毒室保存，CTAB 為國產分析純，pMD19-T載 體 和Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-) 購自寶生物工程(大連)有限公司，Geen Taq Mix 試劑購自南京維諾贊公司，DNA 純化回收試劑盒(離心柱型)購自生工生物工程(上海)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 紫花苜蓿病毒病害調查及樣品采集

2020 年8 月，從中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站西藏自治區(qū)達孜縣和扎囊縣的苜蓿試驗基地觀察到花葉(圖1A、B)、小葉、斑駁和皺縮(圖1C、E)、紅化(圖1D)、黃化(圖1E、F)等具典型病毒病癥狀的苜蓿植株，分別采集葉片樣品33 和22 份。每份樣品分成兩份，一份于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆茫环萦? ℃短期保存。

圖1 紫花苜蓿病毒病田間癥狀Figure 1 Symptoms of alfalfa viral disease in the fields

2021 年7 月，繼續(xù)對西藏部分地區(qū)苜蓿病毒病進行調查，采集具有病毒病癥狀的苜蓿葉片樣品156 份，分別為中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站西藏達孜縣苜蓿試驗基地40 份(與2020 年不同地塊)、林芝市多布特大橋兩旁的野生苜蓿20 份、西藏農牧學院苜蓿試驗基地60 份、林芝市朗多村苜蓿種植地36 份。全部樣品于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 苜蓿病樣深度測序及數據分析

在2020 年8 月采自達孜縣的樣品中，從4 ℃短期保存的樣品挑選7 份代表不同癥狀類型的樣品，等量混合后于液氮中研磨成粉末，送上海元莘生物醫(yī)藥科技有限公司進行核酸提取和去除核糖體RNA (rRNA)的深度測序。核酸采用Invitrogen 的Trizol 試劑進行提取，核酸質量利用NanoDrop 2000(NanoDrop, Wilmington, DE, USA) 分 光 光 度 計 進 行檢測，將OD260/280介于1.6～1.8 的核酸利用TruSeq RNA Sample Prep Kit 除 去rRNA 后，使 用Illumina HiSeq X-ten 系 統(tǒng) 進 行 測 序。所 得Raw reads 利 用CLC Genomic Workbench 9.5 (QIAGEN)分析以除去接頭序列及由于接頭自連等原因導致沒有插入片段的reads，剩余reads 從頭組裝成200 bp 以上的contigs，再利用NCBI 中的Blastn and Blastx 進行比對分析獲取與病毒相關的contigs。

1.2.3 深度測序結果驗證及田間樣品檢測

為驗證深度測序獲取病毒的真實性及檢測其在田間的發(fā)生狀況，根據深度測序獲取病毒的contigs，設計檢測 AMV、MsAV1 和 LTSV 的特異引物，查閱相關資料獲取CMV 的檢測引物[14]，引物序列(表1)由上海生工生物工程股份有限公司合成。樣品的總核酸參照Li 的方法[15]提取。病毒cDNA 利用表1中列出的3′端引物，使用寶生物工程(大連)有限公司 的 Reverse Transcriptase M-MLV (RNase H-)試 劑盒按照說明進行反轉錄獲得。采用諾唯贊生物科技股份有限公司(南京)的 Geen Taq Mix 對獲取的cDNA 進行PCR 擴增，10 μL 反應體系為：Geen Taq Mix 5 μL，上下游引物(表1)各0.2 μL，ddH2O 3.6 μL，cDNA1 μL，輕彈管壁混勻后進行以下反應：94 ℃預變性2 min，94 ℃變性30 s，55～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1～1.5 min (延伸時間如表1 所列，按1 kb·min-1計)，35 次循環(huán)后72 ℃延伸10 min。反應結束取全部產物于1%瓊脂糖凝膠和0.5 × TBE 緩沖液中，120 V 電壓下進行電泳，35 min 后于凝膠成像系統(tǒng)下觀察擴增結果。

2）基于PLC的給排水控制系統(tǒng)可通過考慮水位及壓力控制原則，使水泵運行中的自動轉換操作得以實現，從而延長給排水控制中水泵的使用壽命；

表1 用于檢測的病毒引物Table 1 Primers used for the detection viruses

紫光燈下切下包含擴增片段的凝膠，利用DNA純化回收試劑盒將目的片段回收后連接到pMDTM19-T Vector (寶生物，大連)，10 h 后轉化至大腸桿菌DH5α，在含Amp、X-Gal 和IPTG 的LB 固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h 后，挑選白色菌落擴大培養(yǎng)，利用PCR進行菌液檢測，挑選陽性克隆送生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所獲序列利用NCBI 網站中的BLAST 程序(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行一致性比對，以確認是否為病毒基因組序列。

2 結果與分析

2.1 深度測序結果分析

利用深度測序，從XZDZ 混合樣獲取55 069 682的Raw reads，去除接頭序列及由于接頭自連等原因導致沒有插入片段的reads，組裝后獲取170 254 條長度大于200 bp 的contigs。Blastn 分析顯示了XZDZ混合樣中出現MsAV1、AMV、LTSV 和黃瓜花葉病毒CMV4 中病毒，average coverage 介于2.26～295 791.92，相 應contig 分 別 顯 示 了 與MsAV1 (contig_13 241，3 414 bp)、LTSV (contig_269，4 251 bp)，AMV 的RNA1(contig_6，2 851 bp)、RNA2 (contig_23，2 332 bp)、RNA3 (contig_55，1 119 bp)，以 及CMV 的RNA1(contig_64 880，628 bp)、RNA2 (contig_80 137，671 bp)、RNA3 (contig_57 582，1 075 bp) 93%～99%的核苷酸序列一致性(表2)。表明來自西藏的紫花苜蓿病樣中可能存在上述4 種病毒。

表2 深度測序獲取的病毒數據統(tǒng)計Table 2 Statistic the virus data from deep sequencing

2.2 RT-PCR 對深測結果的驗證

為了驗證深度測序結果的可靠性，利用獲取的AMV、MsAV1 和LTSV 相關contigs 設計的特異引物，以及劉勇等設計的CMV 檢測引物[14]，對2020年8 月和2021 年7 月采自西藏達孜縣、扎囊縣和林芝市的211 個苜蓿葉片樣品進行RT-PCR 檢測，結果分別擴增到MsAV1、AMV、LTSV 和CMV 約849、1 555、1 496 和776 bp 與預期結果相符的片段(圖2)。挑選部分擴增產物克隆、測序，Blastn 分析顯示與GenBank 中的MsAV1 (OL521710)、AMV (OL706249)、LTSV (JQ782213)和CMV (MT786689)分 別100%、96%、95%和 99% 的核苷酸序列一致性，以及與深測所獲相應contigs 99.5%、99%、99%和99%的核苷酸序列一致性，證明西藏紫花苜蓿存在MsAV1、AMV、LTSV 和CMV 4 種病毒的侵染。

圖2 部分樣品MsAV1、AMV、LTSV 和CMV 的RT-PCR 檢測Figure 2 RT-PCR detection of MsAV1, AMV, LTSV and CMV in partial samples

2.3 4 種病毒在西藏達孜、扎囊和林芝部分地區(qū)的發(fā)生情況

對來自西藏達孜縣、扎囊縣和林芝市211 份苜蓿樣品的病毒檢出情況進行分析，發(fā)現共有67 個樣品檢測到AMV、MsAV1、LTSV 和CMV 中一種或兩種病毒的侵染，病毒總檢出率為31.8%，其中，AMV 17.1%、MsAV1 10.4%、LTSV 3.3%、CMV 5.7%。復合侵染檢出率為4.7%，分別為AMV + MsAV1 1.4%、AMV + LSTV 2.4%、CMV + MsAV1 和AMV + CMV 均為0.5% (表3)。

表3 西藏部分地區(qū)紫花苜蓿的 AMV、MsAV1、LTSV 和 CMV 檢測統(tǒng)計Table 3 Detection statistic of AMV、MsAV1、LTSV and CMV in alfalfa plants from partial regions of Tibet

病毒檢出率最高的地區(qū)為林芝市，采集的116 個樣品有41 個樣品檢測到MsAV1、AMV、LTSV和CMV 中一種或兩種病毒的侵染，檢出率為35.3%，分別為AMV 25.0%、MsAV1 9.5%、LTSV 4.3%、CMV 2.6%、AMV + LSTV 3.5%，AMV + MsAV1、AMV +CMV 和CMV + MsAV1 均為0.9% (表3)。其中，西藏農牧學院苜蓿試驗基地的病毒檢數和病毒檢出率均為最高，60 個樣品中共有26 個樣品檢測到AMV、MsAV1、LTSV 和CMV 中的一種或兩種病毒侵染，病毒檢出率為43.3%；林芝市多布特大橋兩旁的野生苜蓿檢出率最低，20 個樣品中僅有4 個樣品檢測到MsAV1，病毒檢出率為20.0%；林芝市朗多村苜蓿種植地的病毒檢出率居于以上兩地之間，36 個樣品中共有11 個樣品檢測到AMV、LTSV 的侵染，檢出率分別為30.6% 和 11.1%，檢測到LTSV的樣品中均存在與AMV 的復合侵染(表3)。

中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站扎囊縣苜蓿試驗基地的22 個樣品中共有7 個樣品檢測到MsAV1、AMV、LTSV 3 種病毒，病毒檢出率為31.8%，分別為AMV 27.2%、MsAV1 9.1%和LTSV 4.6%。存 在AMV +MsAV1 以及AMV + LTSV 兩種復合侵染類型，檢出率均為4.6%。未見CMV 的侵染(表3)。

中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站西藏達孜縣苜蓿試驗基地的樣品來自2020 年8 月和2021 年7 月采集的兩處不同地塊，兩地的病毒檢出情況差異較大。2020 年8 月采集的33 個樣品中共有10 個樣品檢測到AMV、MsAV1、LTSV 3 種 病 毒，存 在AMV +MsAV1 的侵染，病毒檢出率為30.3%，MsAV1 的檢出率最高，為27.3%，AMV、LTSV 以及AMV + MsAV1的檢出率均為3.0%。2021 年7 月采集的40 個樣品中有9 個樣品中檢測到CMV，檢出率為22.5%，未見MsAV1、AMV、LTSV 的侵染(表3)。

3 討論與結論

紫花苜蓿是西藏海拔4 000 m 以下地區(qū)的當家牧草之一，近年來隨著西藏農業(yè)產業(yè)結構的調整，紫花苜蓿種植面積不斷擴大，加上種植品種多為多年生苜蓿等原因，為病毒病的發(fā)生、病毒在植株中的積累和田間的傳播創(chuàng)造了便利。本研究通過深度測序結合RT-PCR，對來自西藏達孜縣、林芝市和扎囊縣的211 個紫花苜蓿樣品進行檢測，發(fā)現存在AMV、MsAV1、LTSV 和CMV 的侵染，這是MsAV1、AMV、LTSV 和CMV 在西藏地區(qū)紫花苜蓿上的首次報道。

苜?；ㄈ~病毒是雀麥花葉病毒科苜?；ㄈ~病毒屬(Alfamovirus)的唯一成員，也是苜蓿上發(fā)現最早，分布最廣的病毒[16]，侵染苜蓿引起花葉、斑駁、皺縮，枝莖矮化等癥狀[17]。AMV 在世界各地均有發(fā)生，我國于1980 年在北京中國醫(yī)學科學院藥用植物試驗場的苜蓿上發(fā)現[18]，隨后在內蒙古[19]、陜西[20]、浙江[21]、甘肅[8]等地區(qū)的馬鈴薯(Solanum tuberosum)、白車軸草(Trifolium repens)、苜蓿等植物上報道發(fā)生。本研究發(fā)現AMV 在達孜、扎囊和林芝三地均有發(fā)生，但檢出率差異較大。西藏農牧學院苜蓿試驗基地和林芝市朗多村的檢出率較高，分別達30.0% 和30.6%，林芝市多布特大橋兩旁的野生苜蓿未見AMV 的檢出。中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站達孜縣苜蓿試驗基地2020 年采集的樣品中含AMV的侵染病株，檢出率3.0%，2021 年采集的樣品未見AMV 的侵染；中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站西藏扎囊縣苜蓿試驗基地僅2020 年進行過調查，檢出率為27.2%。這是AMV 在西藏地區(qū)的首次報道。

黃瓜花葉病毒是侵染苜蓿的另一種雀麥花葉病毒科成員[22]，但至今未見CMV 在我國苜蓿上的報道。CMV 是我國蔬菜上的優(yōu)勢病毒，在內地31 個省(市、自治區(qū))均有發(fā)生[14]。2019 年，劉勇等[14]從來自西藏的茄子(Solanum melongena)葉片樣品中檢測到CMV 的侵染，之后未見該病毒在西藏地區(qū)的報道。本研究利用深度測序技術，從2020 年來自中國科學院農業(yè)生態(tài)試驗站西藏達孜縣苜蓿試驗基地的7 個苜?；旌蠘悠分蝎@取10 余個347～1 075 bp的contigs，Blastn 分析顯示了與NCBI 中的CMV最高93%～96%的序列同源性。利用CMVcp的特異引物，對來自西藏的211 個苜蓿樣品進行檢測，結果從12 份樣品中檢測到CMV 的侵染，其中9 份來自達孜縣(2021 年采集)，3 份采自林芝市(西藏農牧學院)，2020 年采自達孜縣的樣品中未檢測到CMV，可能是病毒在植株中的滴度低。CMV 可以通過80 多種蚜蟲進行傳播，也可以通過帶毒種子和汁液摩擦進行傳播[23]，CMV 在西藏苜蓿上的檢出為該病毒在苜蓿生產中的防控提出預警，本文也是CMV 侵染中國苜蓿的首次報道。

苜?；旌喜《? 是混合病毒科混合病毒屬(Amalgavirus)的成員，該病毒的全基因組序列最早于2015 年由Zhang 等[24]通過深度測序技術從來自河南的樣品中獲取(GenBank 登錄號為GAFF01077243)，隨后Nibert 等[25]對該序列進行分析并將其命名為Medicago sativaamalgavirus 1，目前在美國和澳大利亞的苜蓿上均有報道[26]。MsAV1在達孜、扎囊和林芝三地均有發(fā)生，總檢出率為10.4%，僅次于AMV 的17.1%，但由于MsAV1 不引起明顯癥狀，該病毒對苜蓿的影響有待進一步研究。

紫花苜蓿暫時性線條病毒是伴生豇豆病毒科南方菜豆花葉病毒屬(Sobemovirus)的成員，該病毒于1978 年在澳大利亞苜蓿上首次報道[27]，是苜蓿上發(fā)生最早的病毒之一，目前在澳大利亞、新西蘭、澳大利亞、沙特阿拉伯[28]、中國[5]等地均有發(fā)生。苜蓿被LTSV 侵染后具有隱癥現象，即沿側脈出現黃色斑點、條紋，嚴重時出現葉片變形，但一旦環(huán)境改變，癥狀可能消失，比如將顯示癥狀的植株移入溫室，往往出現癥狀消失的現象[29]。在檢測的4 種病毒中，LTSV 的檢出率最低，211 個樣品中有7 個檢測到LTSV 的侵染，檢出率為3.3%，但由于LTSV 不僅能侵染苜蓿，還能侵染車軸草(Trifolium)、鷹嘴豆(Cicer arietinum)、蠶豆(Vicia faba)等多種豆科作物[29]，以及 矮 牽 牛(Petunia hybrida)[29]、苦 苣 菜(Sonchus oleraceus)[30]植物，因此目的地周圍應該清除雜草，盡量避免與其他豆科作物的混種、套種和輪作。