李忠旺，陳光榮，劉新星，楊如萍，朱天地，陳 琛，陳子萱，陳玉梁

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所, 甘肅 蘭州 730020；2.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院旱地農(nóng)業(yè)研究所, 甘肅 蘭州 730070）

大豆(Glycine max)起源于中國，栽培歷史悠久，其籽粒不僅為人類提供糧油，更是動(dòng)物最主要的植物蛋白來源。栽培大豆籽粒收獲后的成熟秸稈由于木質(zhì)化程度高、粗蛋白含量低而不能廣泛用作動(dòng)物飼料[1]。近年來利用野生大豆和栽培大豆雜交培育的飼用大豆是以收獲植株?duì)I養(yǎng)體為主的新型品種，具有生長勢旺盛、適宜性廣、蛋白含量高、抗逆性強(qiáng)等特點(diǎn)，作為優(yōu)質(zhì)的一年生飼草還兼有鮮草產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適口性好、草食畜均喜采食等優(yōu)點(diǎn)，可作為優(yōu)良的草食畜青飼料[2-4]。因此，選育全株高蛋白含量的飼用大豆新品種具有極其重要的現(xiàn)實(shí)意義。然而，由于飼用大豆選育一般都是以栽培大豆和野生大豆為原始雙親，需經(jīng)過多輪回交轉(zhuǎn)育的過程，且全株蛋白含量為受多基因調(diào)控的數(shù)量性狀，性狀鑒定需要在生長晚期，完全破壞植株后才能鑒定，鑒定難度大、費(fèi)用高。這給全株高蛋白含量飼用大豆選育工作帶來了極大的麻煩。鑒于此，探索應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)開展高蛋白含量飼用大豆新品種選育，是解決難題的有效手段。

微衛(wèi)星序列SSRs (simple sequence repeats)作為一種多態(tài)性高、重復(fù)性好且較穩(wěn)定的分子標(biāo)記，常用于遺傳多樣性研究，由于其兼具共顯性、易擴(kuò)增、基因組內(nèi)分布廣泛等優(yōu)點(diǎn)，同時(shí)也是關(guān)聯(lián)分析研究理想的分子標(biāo)記[5]。前期大量研究工作都是利用雙親 構(gòu) 建 的 重 組 自 交 系(recombinant inbred line, RIL)分離群體定位與大豆籽粒蛋白含量相關(guān)的SSR 標(biāo)記，這些SSR 標(biāo)記大部分是在單一分離群體中被定位，缺少在核心種質(zhì)自然群體中的驗(yàn)證，限制了其在育種實(shí)踐中的應(yīng)用價(jià)值。關(guān)聯(lián)分析是利用等位基因間的連鎖不平衡(linkage disequilibrium, LD)關(guān)系進(jìn)行性狀與標(biāo)記間的相關(guān)性分析，可檢測自然群體中與性狀相關(guān)的基因位點(diǎn)，進(jìn)而應(yīng)用于分子標(biāo)記輔助選育工作中[6]。

本研究以甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆育種課題組前期篩選的55 份飼用大豆核心種質(zhì)自然群體為受試材料，利用前人定位篩選的40 個(gè)大豆籽粒蛋白含量表型遺傳解釋率高的SSR 標(biāo)記，采用關(guān)聯(lián)分析的方法，初步篩選在自然育種群體中與大豆全株蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，為進(jìn)一步應(yīng)用分子標(biāo)記輔助選育高蛋白含量飼用大豆新品種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究選取甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院大豆育種課題組前期篩選的適宜于飼用大豆選育的55 份核心種質(zhì)資源作為供試群體材料，其中野生大豆資源7 份，栽培大豆資源34 份，半野生牧草大豆資源3 份，野生大豆與栽培大豆雜交后代高代品系11 份。2020年和2021 年分別將供試大豆品種(系)種植于甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院黃羊試驗(yàn)場，采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，3 次重復(fù)，行長3.0 m，行距0.5 m，株距0.1 m。采樣時(shí)選擇小區(qū)中間株去除邊際效應(yīng)，每個(gè)品種每個(gè)重復(fù)小區(qū)選擇3 株作為3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)測定全株粗蛋白含量。

1.2 SSR 標(biāo)記篩選及引物設(shè)計(jì)

采用文獻(xiàn)檢索法，收集國內(nèi)外文獻(xiàn)報(bào)道的大豆籽粒蛋白含量關(guān)聯(lián)SSR 分子標(biāo)記，從中篩選出解釋率較高的連鎖SSR 標(biāo)記40 個(gè)作為目標(biāo)對象，并從SoyBase 數(shù)據(jù)庫(https://www.soybase.org/)查找這些標(biāo)記的引物序列，委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物備用。檢索到的SSR 標(biāo)記信息如表1 所列。

表1 大豆蛋白含量相關(guān)SSR 標(biāo)記信息列表Table 1 List of SSR marker information related to soybean protein content

1.3 大豆全株蛋白含量測定

在大豆鼓粒期，各受試材料每個(gè)重復(fù)小區(qū)內(nèi)選擇連續(xù)3 個(gè)單株作為全株蛋白含量測定樣品，記錄并稱其鮮重后帶回實(shí)驗(yàn)室于60 ℃干燥箱中烘干至恒重，將烘干的大豆粉碎后用于測定植株含氮量(采用凱氏定氮法)，測定方法參照《土壤農(nóng)化分析》[18]，植株粗蛋白含量 = 植株氮含量 × 6.25。

1.4 SSR 標(biāo)記檢測

供試材料新鮮葉片經(jīng)液氮研磨后，每個(gè)樣品取約100 mg，使用杭州倍沃醫(yī)學(xué)科技有限公司生產(chǎn)的植物基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行樣品DNA 的提取，提取完成后用超微量分光光度計(jì)測定其濃度和純度，并根據(jù)所測數(shù)據(jù)將DNA 稀釋至100 ng·μL-1，4 ℃保存?zhèn)溆?。PCR 擴(kuò)增體系總反應(yīng)體積20 μL，包括2 × Taq Master Mix 10 μL，DNase-Free Water 7 μL，F(xiàn)orward Primer 1 μL，Reverse Primer 1 μL，模板DNA 1 μL。反應(yīng)程序：95 ℃熱啟動(dòng)3 min，95 ℃變性45 s，48～65 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30 個(gè)循環(huán)后，72 ℃終延伸5 min 后結(jié)束。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用8%的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染顯色后拍照留存用于數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用Structure 2.3.4 軟件進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，估計(jì)最佳群體組群數(shù)K，取值范圍為1～10，每個(gè)K 值重復(fù)運(yùn)行3 次，參照Evanno 等[19]提出的ΔK 值方法確定合適的K 值，并計(jì)算Q 參數(shù)。利用NTSYS 2.10 軟件計(jì)算遺傳相似系數(shù)和遺傳距離，并進(jìn)行聚類分析。運(yùn)用TASSEL2.1 軟件一般混合線性模型(general linear model, GLM)和混合線性模型(mixed linear model, MLM)，結(jié)合蛋白質(zhì)含量與分子標(biāo)記數(shù)據(jù)，進(jìn)行SSR 標(biāo)記和全株蛋白含量的關(guān)聯(lián)分析，利用位點(diǎn)顯著性標(biāo)準(zhǔn)P< 0.05 且貢獻(xiàn)率大于1%對關(guān)聯(lián)位點(diǎn)進(jìn)行判定，篩選與大豆全株蛋白含量相關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記位點(diǎn)。

2 結(jié)果分析

2.1 供試材料全株蛋白含量檢測

將55 份飼用大豆核心種質(zhì)資源2020 年和2021年測得的鼓粒期全株蛋白含量平均值作為表型參數(shù)。從測試結(jié)果來看，55 份資源中蛋白含量最高的為‘汾豆105’(24.8%)，最低的為高代品系‘XZY8’(14.9%)；野生大豆全株蛋白含量相對較高，栽培大豆全株蛋白含量相對較低(表2)。

表2 參試品種名稱及全株粗蛋白含量測定結(jié)果Table 2 Name of tested varieties and determination results of whole-plant protein content

2.2 基于SSR 標(biāo)記的遺傳多樣性分析

從40 個(gè)SSR 標(biāo)記中最終篩選出擴(kuò)增條帶清晰、重復(fù)性高的SSR 標(biāo)記21 個(gè)，21 個(gè)標(biāo)記在55 份大豆材料中共檢測出118 個(gè)等位變異，每個(gè)標(biāo)記的等位基因數(shù)變幅為3～10 個(gè)，平均為5.6 個(gè)。其中，多態(tài)性位點(diǎn)最豐富的是Sat_100 標(biāo)記，Sat_168、Satt233 和Satt077 標(biāo)記檢測到的等位變異較少，分別為3、4 和4 個(gè)。有效等位基因數(shù)(Ne)變幅為1.662 5～6.768 7，平均為3.049 4；Shannon’s 信息指數(shù)變幅為0.810 0 (Satt384)～2.038 4 (Sat_100)，平均為1.279 2；多態(tài)信息含量(PIC)變幅為0.243 6 (Satt126)～0.970 4 (Satt494)，平均為0.635 8 (表3)。PIC 值大于平均數(shù)占比為52.38%，表明本研究篩選出的標(biāo)記基因多樣性較高。圖1 為引物Satt020 在55 份大豆核心種質(zhì)供試材料中的擴(kuò)增圖譜。

圖1 55 個(gè)大豆品種的Satt020 引物PCR 擴(kuò)增圖譜Figure 1 PCR products fingerprints of soybean varieties using primer Satt020

表3 基于21 個(gè)SSR 標(biāo)記的55 份大豆種質(zhì)的遺傳多樣性參數(shù)Table 3 Genetic diversity indicators of 55 soybean based on 21 pairs of SSR primers

2.3 聚類分析

根據(jù)NTSYS 2.10 軟件計(jì)算，55 份供試大豆種質(zhì)材料間的遺傳相似度變化范圍為0.621 8～0.958 0，平均為0.768 1。利用NTSYS 軟件的SHAN 程序進(jìn)行UPGMA 聚類分析，在遺傳距離等于0.74 處，供試的55 份大豆種質(zhì)可以分為3 組。第Ⅰ組包括6 份大豆材料，第Ⅱ組包括48 份大豆材料，第Ⅲ組包括1 份大豆種質(zhì)，聚類分組結(jié)果并沒有體現(xiàn)出大豆的品種類型區(qū)分(圖2)。

圖2 供試大豆種質(zhì)的UPGMA 聚類圖Figure 2 UPGMA dengrogram of 55 soybean materials

2.4 群體遺傳結(jié)構(gòu)分析

利用Structure2.3.4 軟件對55 份供試大豆材料進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，計(jì)算每份材料的Q 值。隨著K 值增大，對數(shù)似然函數(shù)值lnP (D)持續(xù)增大，無明顯拐點(diǎn)，所以不能判斷亞群數(shù)，需要通過ΔK 來進(jìn)一步確定(圖3A)。當(dāng)K = 4 時(shí)，ΔK 值最大，因此可將55 份材料分成4 個(gè)亞群(圖3B、圖3C)。根據(jù)個(gè)體在亞群中的概率，如果概率大于0.6 則劃分到相應(yīng)的亞群，如果概率小于0.6 則劃分到混合類群。結(jié)果表明，供試大豆材料中，53 份材料的Q 值不低于0.6，推斷這些材料的遺傳組成相對單一，占比為96.36%。其中，亞群POP1 包含18 份材料，亞群POP3包含14 份材料，亞群POP4 包含16 份材料，這3 個(gè)亞群共包含48 份材料，與聚類分析中的第Ⅱ組材料相似；亞群POP2 包含5 份材料，與聚類分析中第Ⅰ組材料基本一致，剩余的2 份材料在4 個(gè)亞群內(nèi)的Q 值均低于0.6，因此劃分為一個(gè)混合類群，占比為3.63%，表明這兩份材料遺傳背景復(fù)雜。群體結(jié)構(gòu)分析與聚類分析的結(jié)果相比較，二者有較高的相似度，但并不完全一致。

圖3 55 份供試大豆材料的群體結(jié)構(gòu)Figure 3 Population structure of 55 soybean materials

2.5 供試大豆蛋白含量與SSR 標(biāo)記關(guān)聯(lián)分析

以55 份供試大豆材料對應(yīng)的Q 值作為協(xié)變量，利用Tassel 2.1 軟件的GLM 和MLM 模型，分析大豆蛋白含量相關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，并確定其解釋率。GLM 檢測結(jié)果顯示，共檢測到6 個(gè)標(biāo)記與大豆蛋白含量顯著相關(guān)(P< 0.05)，表型變異的解釋率范圍為10.36%～16.65%，MLM 分析檢測到的相關(guān)標(biāo)記與GLM 分析結(jié)果一樣，變異解釋率的范圍為9.38%～16.18%。其中標(biāo)記Satt_168 與蛋白質(zhì)含量顯示極顯著相關(guān)(P< 0.01)，位于連鎖群Chr18 上(表4)。

表4 與大豆全株蛋白含量顯著關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記Table 4 SSR markers significantly associated with soybean whole plant protein content

3 討論與結(jié)論

大豆因其具有生物固氮功能，所以全株具有較高的蛋白含量，作為飼草可為草食畜提供蛋白質(zhì)來源，因而早在19 世紀(jì)初就被美國作為飼草引進(jìn)栽培，且很長時(shí)間內(nèi)被作為優(yōu)質(zhì)飼草利用[20]。大豆植株蛋白質(zhì)含量隨成熟度的增加而逐漸增加，在鼓粒期收獲，其產(chǎn)草量和飼用價(jià)值最高[21-22]，因此本研究選擇在鼓粒期檢測飼用大豆選育核心種質(zhì)資源全株蛋白含量。從檢測結(jié)果來看，野生型大豆全株蛋白含量相對較高，飼用大豆次之，栽培大豆最低，但兼顧到產(chǎn)草量及適口性則是飼用大豆最優(yōu)。因此，選擇優(yōu)良的野生大豆和栽培大豆為親本，選育全株蛋白含量高、產(chǎn)草量高、抗逆性好、綜合性狀優(yōu)良的飼用大豆作為一年生飼草應(yīng)用，具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

普遍認(rèn)為大豆蛋白含量是受多基因控制的數(shù)量性狀，利用分子標(biāo)記技術(shù)可有效加速數(shù)量性狀育種進(jìn)程。已報(bào)道的大豆蛋白含量相關(guān)分子標(biāo)記有很多，但是真正可用于育種實(shí)踐的還比較少。采用關(guān)聯(lián)分析的方法篩選可用的分子標(biāo)記是一種較好的方法，具有檢測等位變異位點(diǎn)多，效率高的特點(diǎn)[23]。本研究以前期篩選的適宜于飼用大豆選育的55 份核心種質(zhì)資源作為供試群體材料，采用關(guān)聯(lián)分析的方法篩選可應(yīng)用于育種實(shí)踐的標(biāo)記位點(diǎn)。結(jié)果顯示，40 個(gè)SSR 標(biāo)記中多態(tài)性高、重復(fù)性好的標(biāo)記位點(diǎn)有21 個(gè)，等位基因數(shù)變幅在3～10 個(gè)，利用GLM_Q 值 模 型 和MLM_Q + K 值 模 型[24]的 關(guān) 聯(lián) 分析結(jié)果一致，共篩選出了6 個(gè)與全株蛋白含量相關(guān)聯(lián)的SSR 標(biāo)記，分布在染色體Chr7、Chr18、Chr6、Chr8、Chr1 和Chr6 上，其中標(biāo)記Satt_168與大豆蛋白含量在P< 0.01 水平上極顯著相關(guān)。因此，利用關(guān)聯(lián)分析的方法在已報(bào)道的分子標(biāo)記中篩選可用于育種實(shí)踐的輔助選擇標(biāo)記。