張格陽，呂世杰，朱肖亭，翟亞瑩，張志浩，施巧婷，張子敬，屈俊峰，陳付英，王二耀*

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/河南省畜禽繁育與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，河南鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學動物科技學院，河南鄭州 450002；3.河南省科技創(chuàng)新促進中心，河南鄭州 450008）

隨著全球化的深入發(fā)展，畜禽產(chǎn)品需求逐年遞增，中國畜牧業(yè)得到了高速平穩(wěn)的發(fā)展。畜禽種業(yè)是畜牧業(yè)的源頭，是畜牧業(yè)發(fā)展的重要環(huán)節(jié)。我國畜禽種業(yè)在經(jīng)歷了高速平穩(wěn)的發(fā)展后，面臨著一些卡脖子的問題，雖然我國種業(yè)技術發(fā)展已有長足進步，但在種質(zhì)資源創(chuàng)新和基因編輯等核心技術方面，仍相對滯后。這導致了種業(yè)發(fā)展的瓶頸，也限制了中國在全球種業(yè)產(chǎn)業(yè)鏈中的作用。液相芯片技術的開發(fā)與應用，在協(xié)助育種工作者培育高品質(zhì)優(yōu)良畜禽品種中發(fā)揮了極大的作用。

1 概念和原理

液相芯片體系是一種通過聚苯乙烯微球制備的液相芯片系統(tǒng)，其主要基材是粒徑均勻直徑為5.5～5.6μm 的圓形微球[1]。該微球可以懸浮于液相中，構成了一個液相芯片系統(tǒng)。微球上的不同探針分子可以與待測物特異性結合，利用這個系統(tǒng)可以對同一個樣品中的多種不同分子同時進行檢測。液相系統(tǒng)中的微球通常都具有獨特的熒光編碼或稱為色彩編號，可以通過熒光染料或者其他的方法進行標記。其中，熒光編碼是一種常見的方法[2,3]，通過在制造微球時將不同熒光染料混合在一起，使得微球具有不同的熒光信號和顏色。這樣一來，每種顏色的微球可以固定不同的探針分子，完成對多種不同物質(zhì)的同時鑒定和檢測。

在液相芯片技術中，測試樣品和報告分子被添加到96 孔板的培養(yǎng)基中與標記的微球反應。靶分子[3]（如待檢測的抗原或抗體、生物素標記的靶核酸片段和酶等）會與探針和微球上的報告分子特異性結合，使交聯(lián)探針的微球攜帶報告分子生物素和熒光素。通過這種標記，在液相芯片技術中既能快速地對生物分子進行分析，還能進行多幀實時動態(tài)圖像的記錄。

2 液相芯片的特點

2.1 液相芯片技術優(yōu)勢

液相芯片技術相對于傳統(tǒng)的免疫學和核酸檢測方法具有以下幾個優(yōu)點。

2.1.1 高通量

不同于傳統(tǒng)免疫分析方法，液相芯片技術可以同時實現(xiàn)多種分子的檢測及分析，可以在同一樣本中快速、準確地進行不同目分子的定量和定性檢測，且用于檢測的微球種類數(shù)可多達100種。利用液相芯片技術，可以通過將熒光標記在磁性微球表面，利用微流控系統(tǒng)將樣本與微球混合，并通過激光束對熒光強度進行檢測，實現(xiàn)對多種不同目的分子同時進行實時定量、定性分析，具有較好的重復性。

2.1.2 樣本用量少

液相芯片技術可以通過對芯片表面進行不同標記物的打印和生物分子的修飾，實現(xiàn)在同一個反應孔中同時完成多重生物學反應的檢測。這種技術在很大程度上降低了需要的樣本和試劑用量，降低了生物實驗成本，縮短了試驗時間，提高了生物分析效率。

2.1.3 操作簡單、快速

液相芯片技術建立在液相反應動力學基礎上，因此可以通過微流控調(diào)控反應條件來控制反應速度，以實現(xiàn)目標分子的快速檢測。相比傳統(tǒng)的固相檢測方法，該技術的檢測步驟更簡單、更快速。免疫學分析時，選擇高親和力抗體，只需2～3h 即可完成檢測，同樣的，核酸雜交分析也只需要在PCR 擴增后不到1h 就能得到精準結果[4]。液相芯片技術除了反應速度更快之外，還具有樣品孵育時間更短的優(yōu)點。因為液相芯片技術所采用的液相反應動力學模型自身具備快捷的反應過程，從而使其在樣品檢測方面具有更高的時效性和敏感性。液相芯片技術通過微型化和自動化的實驗平臺，可以大幅度減少實驗工作量和人力成本，數(shù)據(jù)分析過程也相對簡單快捷。

2.1.4 數(shù)據(jù)質(zhì)量高

液相芯片技術可以同時檢測多種待測分子，可以減少樣本的消耗，并且可以避免數(shù)據(jù)偏差和誤差，保證數(shù)據(jù)質(zhì)量。

2.1.5 特異性強

液相芯片技術可以通過熒光檢測技術實現(xiàn)高效、無需洗滌的自動化檢測。同時，液相芯片微球與待測分子之間的結合通常是高度特異性的，這意味著只有目標分子與微球結合后才會形成復合物，并通過共振能量轉(zhuǎn)移產(chǎn)生熒光信號，未結合的分子不會產(chǎn)生干擾。

通過對兩類傳感器接收信號的分析與比較，發(fā)現(xiàn)R6α傳感器與Nano30傳感器均能得到較為準確的實驗數(shù)據(jù)。但是相比較而言，R6α頻帶窄，但響應快，能盡可能多地接收到信號，保證巖石破裂過程的聲發(fā)射表征更為準確。此外，還可以隔絕一些其他頻段的噪聲信號干擾，保證時序能量表征的準確性，因此適合分析聲發(fā)射時域規(guī)律。而Nano30頻帶較寬，對于一些頻率成分較豐富的突發(fā)性信號，在頻率上能夠盡可能保證聲發(fā)射信號的完整性，保證巖石破裂過程聲發(fā)射信號頻率分析更為全面，故更適合分析巖石聲發(fā)射信號波形特征。此外，由于頻段較寬，一些非破裂信號也會采集到，在分析時應進行去噪處理。

2.1.6 準確性高

根據(jù)熒光信號強度與待測分子的濃度成正比，可以通過對熒光信號的測量來間接檢測待測物質(zhì)的存在及濃度大小，不需要像ELISA 檢測中那樣將樣本多倍稀釋，這可以減少誤差來源，提高檢測的準確性。

2.1.7 靈活性強

液相芯片技術還可以對多種不同類型的樣品進行檢測，如生物組織、體液等，同時，液相芯片技術在檢測樣品時通常無需做進一步處理，比如無需進行濃縮或稀釋。不僅可以用于核酸檢測，還可以應用于蛋白質(zhì)研究。使用商品化試劑盒進行分析時，可以根據(jù)具體的檢測項目，選擇合適的交聯(lián)微球和標記分子的探針，并對其進行靈活調(diào)整。

2.1.8 檢測范圍廣

液相芯片檢測范圍廣，主要包括細胞因子檢測、免疫分析、感染性疾病檢測、自身抗體檢測、疫苗效果評價、單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide polymorphism，SNP）檢測、免疫球蛋白分型等。液相芯片技術在分析速度、靈敏度、通量等方面有著極大的優(yōu)勢，廣泛應用于分子診斷、藥物篩選、生物學研究以及臨床實踐等領域。

2.2 液相芯片技術劣勢

2.2.1 實驗操作要求高

對于一些復雜的樣本（如血液、唾液等），還需要進行一些樣本前處理，操作難度相對較大。液相芯片技術需要進行多步驟操作，操作方法綜合要求比較高，不易上手，需要培訓和專業(yè)知識。

2.2.2 初始設備和引物的制備成本高，原材料采購價格高昂

對于新的檢測目標，首先需要開發(fā)適當?shù)臏y量信號，同時應選用不同種類的微小顆粒，這需要前期高昂的投資。熒光編碼微球是目前制備液相芯片技術的核心設備，國內(nèi)技術發(fā)展的滯后給液相芯片相關產(chǎn)業(yè)的發(fā)展帶來了諸多困難與挑戰(zhàn)。國外壟斷了制備液相芯片的高性能、高附加值的熒光微球材料，國內(nèi)所使用的材料幾乎都從國外高價進口，因此國內(nèi)液相芯片的發(fā)展也受到了極大的阻礙。

3 液相芯片在動物遺傳育種領域的應用

3.1 液相芯片在全基因組關聯(lián)分析和全基因組選擇育種中的應用

隨著高通量基因測序技術的發(fā)展，科學家們根據(jù)研究需求設計了不同類型的液相芯片用于畜禽遺傳特性解析、品種鑒定、資源保護和新品種開發(fā)等工作，例如 “神農(nóng)1 號” 地方雞基因組系列液相芯片、“吉牛1 號” 肉牛20K 液相育種芯片、湘豬64K cGPS 液相芯片、綿羊40K 液相基因芯片等。郭應威[5]基于靶向捕獲測序技術的40K 綿羊液相芯片，其中包含了40156 個標記位點。該芯片利用高通量技術，對323 只湖羊和東佛里生綿羊雜交F2代（即東湖羊）進行基因分型，篩選后檢測到209625 個高質(zhì)量SNPs，其目標位點平均捕獲效率達99.7%，平均測序深度為70X。邱奧等[6]開發(fā)的豬50K SNP 液相芯片是一種用于品種鑒定、系譜校正、基因定位和基因選擇等多種用途的芯片。它提供了高通量的檢測能力，包括50000 個位點，可以高效地檢測多個位點，從而加速了品種鑒定和遺傳研究。陳宇[7]等研究表明，將豬液相芯片從10K 基因位點擴充到50K 是可行的。這一擴充方案可以在大規(guī)模的基因組選擇中應用，并降低相關育種成本。實驗中，研究團隊增加了代謝和育種相關基因組位點的數(shù)量，從而實現(xiàn)了豬基因組育種信息資源的擴展。

3.2 液相芯片在疾病抗性選擇育種中的應用

現(xiàn)代動物育種的目標之一是提高動物的疾病抗性。傳統(tǒng)的家系育種方法受到諸多限制，如多性狀選擇的難度大、易造成血緣增強（Inbreeding）等。相比之下，利用分子標記技術進行選擇，尤其是針對涉及多個基因的特殊疾病，可以更為準確地選擇具有高抗性的個體。相應地，針對不同物種疾病的抗性液相芯片的研究將有助于提高動物的抗性選擇準確性，加速育種進程。

劉錦宇等[8]開發(fā)了液相芯片40K SNP “黃海芯1 號”，利用該芯片對AHPND 抗性測試個體進行基因分型，并通過ssGBLUP 與ssBR 等方法復合系譜和基因型信息，評估AHPND 抗性，極大提高了AHPND 抗性的選擇準確性。丁向東等[9]研究利用實例確證了液相芯片在基因組選擇育種中的高效性。與傳統(tǒng)的基因組選擇策略相比，液相芯片技術能夠同時檢測多個位點，從而大幅縮短了育種周期，并且檢測成本也大幅降低。這一技術的優(yōu)越性表現(xiàn)在成本更低、育種效率更高、易于實現(xiàn)等方面。在丁向東等[9]的實驗中，液相芯片技術成功地篩選出具有理想性狀的優(yōu)異品種，為育種工作帶來了加速效果。郭喜玲等[10]研發(fā)了一種能識別甲型流感病毒的NP 基因、乙型流感病毒的HA 基因以及H5N1 亞型AI 病毒的H5 和N1 基因的液相芯片技術，其對病毒核酸的檢測靈敏度可達1pg。Lamaire 等[11]人建立了一種多重液相芯片方法，用于區(qū)分單一和混合感染中的禽呼吸道病毒。這個液相芯片方法可以同時檢測AIV、NDV、IBV 和ILTV，而且用時更短，樣本需求更少。采用液相芯片技術對70 個臨床樣本進行了準確的檢測，并證實該技術的檢測結果與單一實時熒光定量PCR 一致。王慧煜等研究人員設計了一種基于微球偶聯(lián)的探針，針對禽流感病毒M 基因進行液相芯片檢測。試驗結果顯示，該方法具有特異性，可以特異性地檢測出禽流感病毒；同時，該方法的最低檢出量也非常低，僅為10-4ng/μL 的病毒核酸。劉春梅[12]利用液相芯片技術建立了同時檢測小鼠三種病毒的方法。王瑩[13]通過液相芯片技術建立多種豬源性外來病液相芯片檢測的方法。楊顯超[14]利用液相芯片技術建立了同時檢測豬繁殖障礙病毒的方法。張曉娜等[15,16]建立的AIV 多重液相芯片技術具有高度的特異性和靈敏度。該技術對禽流感病毒的H5、H7 和H9 亞型識別特異性很高，并且經(jīng)過優(yōu)化，可以同時識別多個流感病毒亞型，包括NDV、IBV、ILTV 等至少6 種病毒。該技術敏感性明顯提高，最低檢測限可達到10-4ng/μL 的病毒核酸，相對于傳統(tǒng)的RT-PCR/PCR 檢測方法，具有更高的檢測能力。Wu 等[17,18]開發(fā)了一種液相芯片分析方法來監(jiān)測兔出血性疾病病毒（RHDV）、兔輪狀病毒（RRV）和仙臺病毒（SeV）三種兔病原體的核酸。該方法的三種病毒的檢出限為102 拷貝/μL。經(jīng)過檢測，使用這種方法得到的結果與常規(guī)的RT-PCR 檢測結果一致。劉志玲等[19]人基于原核表達技術，構建了一種牛白血病病毒(gp51)的重組蛋白抗原。利用該抗原，他們建立了一種液相芯片檢測技術，用于檢測牛白血病病毒抗體。實驗結果顯示，該技術具有極高的敏感性，達到119.7ng/μL。樣本量為169 份的臨床牛血清中，該技術檢測出陽性率為57.4%。此外，與ELISA 試劑盒檢測結果對比，液相芯片技術的檢測結果符合率高達94.67%。該項研究成果為日后多重液相芯片檢測牛病的研究奠定了基石，為動物疫病的相應研究提供了有益的啟示。

3.3 液相芯片在檢測動物致病基因研究中的應用

篩選動物的致病基因，能夠幫助人們更好的了解和研究致病基因與疾病之間的關系，為動物的遺傳育種提供參考。

有研究使用液相芯片技術檢測了斑馬魚體內(nèi)基因的表達水平，發(fā)現(xiàn)MYH6 和MYH7 等關鍵基因的表達顯著上調(diào)，這些基因與人類肝癌、肝炎等疾病的發(fā)病機制密切相關。這一結果為基于斑馬魚模型進行腫瘤等多種疾病的研究提供了有力的支撐[20]。根據(jù)研究，Aβ 和Tau 基因表達的變化是導致阿爾茲海默癥發(fā)生的重要原因。研究人員使用液相芯片技術對帕金森病和阿爾茲海默病模型的海馬體組織中的miRNA 進行檢測，并發(fā)現(xiàn)了兩種疾病模型中表達顯著的兩種miRNA：miR-27a-5p 和miR-148a-5p[21]。研究者使用液相芯片技術篩查了脂肪肝大鼠模型的肝臟組織，發(fā)現(xiàn)TLR2、TLR4 和CCR2 等基因的表達水平顯著上調(diào)。這些基因的表達受到脂肪肝的刺激，并且能夠調(diào)控細胞因子的分泌[22]。

4 展望

目前，液相芯片技術在動物遺傳育種中已經(jīng)取得了顯著成效。通過該技術，育種單位或公司可以建立育種聯(lián)盟或聯(lián)合體，在育種過程中實現(xiàn)信息和資源共享，從而提高育種的效率和質(zhì)量。在這樣的背景下，液相芯片技術被廣泛應用于動物育種研究中，大大推動了我國農(nóng)業(yè)育種的發(fā)展和升級。

可以預見，在數(shù)字化技術、生物信息學和育種技術的不斷發(fā)展下，液相芯片技術將會在農(nóng)業(yè)育種領域發(fā)揮越來越重要的作用，為農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展提供堅實的技術支撐。同時，它也將有助于加強不同育種單位之間的合作和交流，推動育種研究的集約化和區(qū)域化發(fā)展。