崔桂榮，張金華，劉亞寧，李焱

在我國(guó)宮頸癌是一個(gè)威脅婦女健康最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，宮頸鱗癌是宮頸癌的主要病理類型［1-2］。近年來(lái)，由于宮頸癌篩查工作的廣泛開展和以外科手術(shù)、放療、化療和靶向治療等治療技術(shù)提高，宮頸癌的臨床預(yù)后有了很大的改善，但總體生存率仍有待進(jìn)一步提高［3］。

微RNA（microRNA，miRNA）是一類能夠調(diào)節(jié)基因表達(dá)的短單鏈內(nèi)源非編碼RNA（長(zhǎng)約18～25個(gè)核苷酸），廣泛存在于動(dòng)物、植物、病毒等多種有機(jī)體中，miRNA可通過(guò)與互補(bǔ)的mRNA選擇性地結(jié)合降解靶mRNA或抑制mRNA翻譯，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控基因的表達(dá)［4］。miRNA通過(guò)調(diào)控細(xì)胞發(fā)育、增殖、分化、凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、腫瘤發(fā)生和發(fā)展等基因的表達(dá)參與多種重要的生物學(xué)過(guò)程［5］。miRNA在各種惡性腫瘤中異常表達(dá)，其作用涉及原癌基因的激活與抑癌基因的失活，miRNA在宮頸癌的診斷和治療中有重要作用［6］。研究發(fā)現(xiàn)miRNA-194在肺癌、喉癌、胃癌等實(shí)體瘤中異常表達(dá)［7-11］，大量研究證實(shí)miRNA-194與惡性腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移存在必然聯(lián)系［12］，但是miRNA -194在宮頸癌中的作用目前仍未見(jiàn)明確的報(bào)道。

本研究通過(guò)回顧性收集宮頸癌組織以及癌旁組織樣本，采用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)上述樣本中miRNA-194的表達(dá)情況，并分析miRNA-194的表達(dá)與臨床病理因素的相關(guān)性，為研究miRNA-194在宮頸癌中的作用及其機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月至2016年1月于邯鄲市第一醫(yī)院行手術(shù)治療的136例宮頸癌病人為研究對(duì)象。136例病人中采用分層抽樣法選取58例宮頸癌病人的癌組織及相應(yīng)癌旁正常組織，其余78例病人僅選取癌組織。癌旁組織取自手術(shù)切除殘端，距離癌組織大于2 cm，切緣陰性，所取標(biāo)本離體后置于液氮罐內(nèi)迅速冷凍后置-80 ℃保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～80歲；術(shù)前均經(jīng)病理學(xué)檢查確診為宮頸鱗癌；術(shù)前未行化療、放療、激素治療以及其他特殊治療；行宮頸癌根治手術(shù)；術(shù)后病理確診為宮頸鱗癌；病人臨床診療及隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤；合并嚴(yán)重婦科及心、腦、腎等嚴(yán)重內(nèi)科疾?。浑S訪資料不完整；隨訪期間因腫瘤以外因素死亡。136例病人年齡31～69歲，中位年齡為46歲；外生型91例，內(nèi)生型45例；病理分級(jí)低、中和高分化分別為55例、43例和38例；2018國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO）臨床分期［13］：ⅠA期8例，ⅠB期9例，ⅡA期22例，ⅡB期18例，ⅢA期10例，ⅢB期6例，ⅢC期58例，ⅣA期5例；腫瘤長(zhǎng)徑（4.12±1.08）cm，范圍為2.8～8.4 cm；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移63例（ⅢC～ⅣA期），無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移73例（ⅠA～ⅢB期）。本研究經(jīng)邯鄲市第一醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)201706F）。

1.2 主要試劑 Trizol總RNA提取試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒，熒光定量PCR sybrgreen試劑盒，Taqman small RNA Assays，DNA marker等主要試劑購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司和Life Technologies公司。

1.3 qRT-PCR 采用qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)136例宮頸癌組織樣本及58例癌旁組織樣本中的miRNA-194相對(duì)表達(dá)量。參照說(shuō)明中所述詳細(xì)實(shí)驗(yàn)方法步驟，應(yīng)用總RNA抽提試劑對(duì)上述樣本進(jìn)行總RNA的提取。用超微量分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA濃度和純度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將總RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA）。依照試劑盒說(shuō)明書，配制反應(yīng)液10 μL：總RNA 1 ng，根據(jù)總RNA濃度計(jì)算出所需體積、5 U/μL Poly A Polymerase 1 μL、RTase Mix 1 μL、5×PAP/RT Buffer 2.5 μL、雙蒸水（RNase/Dnase free）補(bǔ)齊至總反應(yīng)液為25 μL。控制反應(yīng)條件為37 ℃60 min，85 ℃ 5 min。miRNA-194正向引物5'-CACGCATGTAACAGCAAC-3'，反向引物5'-CCAGTGCAGGGTCCGAGGTA-3'。所有反應(yīng)均設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，反應(yīng)條件為95 ℃ 15 min、95 ℃ 10 s、58 ℃ 15 s、70 ℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法計(jì)算miRNA-194的相對(duì)表達(dá)量。根據(jù)miRNA-194的相對(duì)表達(dá)量的中位值對(duì)136例宮頸癌病人進(jìn)行分組。

1.4 隨訪 本研究中所有病人的隨訪資料均保存完整，包括家庭地址和聯(lián)系方式，隨訪方式為門診、入院復(fù)查和電話隨訪，隨訪截止日期為2019年6月。觀察終點(diǎn)為宮頸癌病人死亡，生存時(shí)間定義為術(shù)后病理確診至因?qū)m頸癌死亡的時(shí)間段。全組136例病人中，獲得隨訪132例，失訪4例。所有病人隨訪時(shí)間為2～72個(gè)月，中位隨訪時(shí)間為48個(gè)月，死亡49例。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以表示，采用t檢驗(yàn)比較宮頸癌組織和癌旁組織間miRNA-194的表達(dá)差異；計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，采用log-rank檢驗(yàn)比較miRNA-194高低表達(dá)組間的生存差異。采用Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸對(duì)miRNA-194表達(dá)以及臨床病理特征和病人總體生存率之間的關(guān)系進(jìn)行分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miRNA-194在宮頸鱗癌組織中低表達(dá) qRTPCR檢測(cè)結(jié)果表明136例宮頸鱗癌病人癌組織miRNA-194的相對(duì)表達(dá)量（1.140±0.655）明顯低于癌旁組織（4.502±1.168）（兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)t=25.49，P＜0.001），其中58例宮頸鱗癌病人癌組織及其配對(duì)的癌旁組織miRNA-194的相對(duì)表達(dá)量分別為1.471±0.561和4.502±1.168（配對(duì)樣本t檢驗(yàn)t=17.82，P＜0.001）。

2.2 miRNA-194表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系 本研究根據(jù)miRNA-194在宮頸癌組織中的相對(duì)表達(dá)中位數(shù)1.015將136例病人分為miRNA-194高、低表達(dá)組各68例。如表1所示，結(jié)果表明宮頸癌中miRNA-194相對(duì)表達(dá)水平與病人的年齡、大體類型、病理分級(jí)、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無(wú)關(guān)，與宮頸癌病人的FIGO分期和腫瘤長(zhǎng)徑相關(guān)，miRNA-194在宮頸癌高FIGO分期（P=0.001）和腫瘤長(zhǎng)徑大（P=0.033）的癌組織中相對(duì)表達(dá)水平較低。

表1 miRNA-194表達(dá)水平與宮頸癌病人臨床病理特征的關(guān)系/例

2.3 miRNA-194低表達(dá)的宮頸癌病人生存期較短 Kaplan-Meier生存分析結(jié)果顯示，miRNA-194高表達(dá)組病人3年和5年總生存率分別為87.8%和73.2%，低表達(dá)組宮頸癌病人的3年和5年總生存率分別為70.2%和51.6%，miRNA-194低表達(dá)組病人的生存期明顯低于高表達(dá)組［HR95%CI=2.17（1.21，3.90），log-rankP=0.012］。Cox回歸分析結(jié)果如表2所示，單因素分析表明FIGO臨床分期、腫瘤長(zhǎng)徑、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況和miRNA-194表達(dá)是影響136例宮頸癌病人生存預(yù)后的因素，進(jìn)一步的多因素分析表明FIGO臨床分期和miRNA-194表達(dá)是影響宮頸癌病人預(yù)后的獨(dú)立因素。

表2 影響宮頸癌136例預(yù)后的Cox單因素和多因素分析

3 討論

目前國(guó)內(nèi)外大量研究證實(shí)miRNA-194充當(dāng)抑癌基因作用于多種惡性腫瘤，在腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲和遷移等生物過(guò)程中起關(guān)鍵作用［14-15］。然而，miRNA-194在宮頸癌中的作用尚不清楚。研究miRNA-194在宮頸癌中的表達(dá)、臨床意義及與預(yù)后的相關(guān)性，對(duì)宮頸癌的診斷、判斷預(yù)后及個(gè)體化靶向治療具有重要意義。研究表明miRNA-194在非小細(xì)胞肺癌組織中低表達(dá)與病人生存期短顯著相關(guān)，miRNA-194可通過(guò)靶向調(diào)節(jié)hNUDC基因抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞增殖，參與肺癌的發(fā)生發(fā)展［10，16］。近期，國(guó)內(nèi)學(xué)者王純斌等［17］的研究進(jìn)一步證實(shí)了miRNA-194在非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞中低表達(dá)，miRNA-194可抑制A549細(xì)胞的增殖和克隆形成能力，促進(jìn)凋亡，其機(jī)制與調(diào)控JAK2/STAT3信號(hào)通路并促進(jìn)活化的Caspase-3 蛋白表達(dá)有關(guān)。馬一棟等［18］研究表明miRNA-194在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)明顯低于肝臟正常細(xì)胞，過(guò)表達(dá)miRNA-194可減慢肝癌細(xì)胞周期進(jìn)程，抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)，其機(jī)制可能與miRNA-194靶向調(diào)節(jié)甲基化轉(zhuǎn)移酶DNMT3A相關(guān)。另外有學(xué)者研究表明胃癌病人血液中miRNA-194的表達(dá)水平明顯低于健康人群，miRNA-194的表達(dá)水平與腫瘤分化程度、TNM分期、淋巴轉(zhuǎn)移呈負(fù)相關(guān)，該研究提示miRNA-194可作為診斷胃癌的潛在生物標(biāo)志物［19］。

本研究結(jié)果顯示：miRNA-194在宮頸癌組織中的表達(dá)明顯低于癌旁正常組織，提示miRNA-194在宮頸癌組織中呈明顯低表達(dá)，推測(cè)miRNA-194表達(dá)水平的下降與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)，隨后探討miRNA-194的表達(dá)與宮頸癌病人臨床病理特征的關(guān)系，結(jié)果顯示miRNA-194的表達(dá)與宮頸癌病人的FIGO分期和腫瘤長(zhǎng)徑具有密切關(guān)系，miRNA-194的表達(dá)與宮頸癌病人FIGO分期和腫瘤長(zhǎng)徑呈反比，提示 miRNA-194的表達(dá)與宮頸癌的進(jìn)展密切相關(guān)；miRNA-194低表達(dá)者5年總生存率明顯低于miRNA-194高表達(dá)者，且miRNA-194表達(dá)是宮頸癌病人獨(dú)立預(yù)后因素，提示miRNA-194表達(dá)與宮頸癌預(yù)后密切相關(guān)，因此我們推測(cè)miRNA-194表達(dá)可作為一種新型宮頸癌預(yù)后和治療靶點(diǎn)應(yīng)用于臨床。

Zhao等［11］通過(guò)收集165例經(jīng)病理檢查確診的胃癌病人腫瘤組織及鄰近健康組織，應(yīng)用qRT-PCR檢測(cè)胃癌組織中miRNA-194的表達(dá)水平顯著低于鄰近組織，miRNA-194在胃癌中的表達(dá)與TNM分期、癌細(xì)胞分化程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，體外實(shí)驗(yàn)表明過(guò)表達(dá)miRNA-194可顯著抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移。miRNA-194在喉部鱗狀細(xì)胞癌中呈明顯低表達(dá)，miRNA-194低表達(dá)喉癌病人的總生存時(shí)間和無(wú)進(jìn)展生存時(shí)間明顯低于miRNA-194高表達(dá)病人，miRNA-194表達(dá)與臨床分期成反比關(guān)系［8］。此外，miRNA-194在膀胱癌、鼻咽癌、腎透明細(xì)胞癌、黑色素瘤等腫瘤中均有低表達(dá)，其表達(dá)水平的降低與預(yù)后不良密切相關(guān)，miRNA-194可通過(guò)一系列信號(hào)通路參與腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移［7，20-22］。

miRNA-194在惡性腫瘤的化療敏感性中也起到重要作用。miRNA-194可通過(guò)靶向Wee1在喉鱗狀細(xì)胞癌中發(fā)揮抑癌作用，過(guò)表達(dá)miRNA-194可以抑制喉鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和耐藥性［8］。過(guò)表達(dá)miRNA-194通過(guò)調(diào)節(jié)HMGA2抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的存活和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)增加結(jié)直腸癌細(xì)胞對(duì)鉑類和伊立替康治療的敏感性［9］。miRNA-194通過(guò)抑制FOXA1調(diào)節(jié)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對(duì)鉑類化療敏感性，miRNA-194在順鉑耐藥的非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，過(guò)表達(dá)miRNA-194可增加順鉑治療的敏感性［12］。上述研究結(jié)果提示，miRNA-194抑制腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并可逆轉(zhuǎn)腫瘤細(xì)胞對(duì)多種化療藥物的耐藥。

綜上所述，miRNA-194在宮頸癌中呈明顯低表達(dá)，且與宮頸癌臨床分期、腫瘤長(zhǎng)徑及預(yù)后密切相關(guān)，檢測(cè)miRNA-194的表達(dá)可為宮頸癌的診斷和預(yù)后提供依據(jù)，其在宮頸癌進(jìn)展中的具體作用機(jī)制值得進(jìn)一步深入研究。