楊立平，曹亞微，王亞莉，劉一棟

糖尿病是一種以高血糖為特征的慢性代謝紊亂，其病因是糖穩(wěn)態(tài)受損、胰島素活性降低和胰島素抵抗。高血糖的長期并發(fā)癥包括血脂異常、高血壓和氧化應(yīng)激。這些反過來又導(dǎo)致嚴(yán)重的多系統(tǒng)并發(fā)癥，導(dǎo)致微血管和神經(jīng)功能障礙，包括腎病、神經(jīng)病變、大血管相關(guān)中風(fēng)、缺血性心臟病和視網(wǎng)膜病變。糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）是其嚴(yán)重的多系統(tǒng)并發(fā)癥之一，其發(fā)展緩慢且往往是隱匿的。這種疾病是工作年齡成年人視力喪失的最常見原因，其特征是視網(wǎng)膜的功能和形態(tài)變化。它是由血管改變引起的缺血和炎癥狀況惡化引起的，例如白細(xì)胞淤滯的發(fā)展、基底膜的增厚、視網(wǎng)膜新生血管和玻璃體視網(wǎng)膜界面處的纖維血管組織形成。而目前所有的療法都針對DR的后期階段，因此，及早發(fā)現(xiàn)早期預(yù)警標(biāo)志物并探明其調(diào)節(jié)機(jī)制對DR防控具有重要意義。

微RNA（miRNA）是一種單鏈非編碼小RNA（19～22個(gè)核苷酸），它們也屬于高度保守的內(nèi)源性RNA序列。到目前為止，已經(jīng)在整個(gè)人類基因組中鑒定出約2 000個(gè)miRNA，并在生理學(xué)和病理生理學(xué)中發(fā)揮重要作用，參與主要的生物過程，包括細(xì)胞生長，分化和凋亡。miRNA作為參與糖尿病微血管并發(fā)癥的潛在參與者而受到廣泛關(guān)注，影響腎臟，視網(wǎng)膜和外周神經(jīng)元［1-4］。研究表明，異常表達(dá)的miRNA在微血管并發(fā)癥的關(guān)鍵致病過程中具有關(guān)鍵作用［5］，例如氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡、炎癥和血管生成。DR是一種進(jìn)行性疾病，其持續(xù)時(shí)間依賴性，在嚴(yán)重程度逐漸增加的階段發(fā)展，伴有氧化應(yīng)激、炎癥和血管生成等，導(dǎo)致微血管改變［6］。高血糖是DR中已知的誘因，可能引起氧化應(yīng)激［7］，研究表明miRNA表達(dá)水平的變化可能與DR 的發(fā)生和進(jìn)展有關(guān)［8］。并且高血糖還會刺激炎癥并促進(jìn)視網(wǎng)膜血管功能障礙，導(dǎo)致毛細(xì)血管通透性和血管滲漏增加［9-10］。因此，炎癥信號通路在DR進(jìn)展中可能扮演著不可或缺的角色。miRNA可以與mRNA靶標(biāo)的非翻譯區(qū)（UTR）中發(fā)現(xiàn)的miRNA反應(yīng)元件上的mRNA相互作用［11-13］。總之，miRNA以各種方式參與DR的發(fā)病機(jī)制，包括炎癥、氧化應(yīng)激和血管生成。研究它們在DR中的作用可以導(dǎo)致對疾病的發(fā)展及其有效治療的更詳細(xì)的了解。隨著更多miRNA的發(fā)現(xiàn)，miRNA作為DR中的生物標(biāo)志物已成為研究熱點(diǎn)［14］。

加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）是一種用于描述微陣列樣本中基因之間的相關(guān)性的模式系統(tǒng)生物學(xué)方法，廣泛用于識別候選生物標(biāo)志物或治療靶標(biāo)［15］。例如，使用WGCNA方法構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)以探索糖尿病相關(guān)易感模塊和心血管疾病基因的研究［16］。在本研究中，我們使用WGCNA方法篩選出DR進(jìn)展的核心miRNA和核心基因，通過雙螢光素酶實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了兩者的靶向結(jié)合關(guān)系，可為DR的診斷和治療提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 本研究所有數(shù)據(jù)來源基因表達(dá)綜合數(shù)據(jù)庫（Gene Expression Omnibus，GEO）數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），從GEO數(shù)據(jù)庫GSE160306、GSE160308數(shù)據(jù)集中獲得43例正常對照和80例糖尿病視網(wǎng)膜病變病人的miRNA表達(dá)譜數(shù)據(jù)。

1.2 加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 GSE160306、GSE160308數(shù)據(jù)集包括80例糖尿病視網(wǎng)膜病變病人的性別、年齡和病理評分，適合構(gòu)建加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)。使用R包“WGCNA”構(gòu)建GSE160306、GSE160308基因表達(dá)數(shù)據(jù)矩陣，選擇樣本中方差最大的前25%的基因作為后續(xù)WGCNA的輸入數(shù)據(jù)集。為了選擇標(biāo)準(zhǔn)的無標(biāo)度網(wǎng)絡(luò)，在選擇合適的軟閾值函數(shù)之前，采用樣本層次聚類方法檢測并去除異常樣本。下一階段，構(gòu)建鄰接矩陣和拓?fù)渲丿B矩陣（TOM），計(jì)算對應(yīng)的相異度（1-TOM），并采用動態(tài)樹切割完成基因樹和模塊識別。最小模塊大小為30。然后通過聚類融合模塊特征基因，將高度相似的模塊合并。

1.3 核心網(wǎng)識別 將所需模塊中的基因輸入到相互作用基因/蛋白質(zhì)檢索工具（STRING，https：//cn.string-db.org/）網(wǎng)站進(jìn)行蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（protein-protein interaction ，PPI）分析，并獲得PPI分?jǐn)?shù)。然后，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape并使用MCODE插件進(jìn)行分析。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng) 人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞（human retinal endothelial cells，HREC）用含1 g/L葡萄糖的DMEM培養(yǎng)基與10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素培養(yǎng)。融合細(xì)胞在無血清的DMEM培養(yǎng)基中饑餓過夜，以減少血清的影響，然后以高濃度葡萄糖（25 mmol/L）刺激24 h。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRTPCR） 使用Trizol試劑（Invitrogen， Carlsbad， CA）按照制造商的指導(dǎo)原則從各組細(xì)胞中提取總RNA。用Primescript RT試劑盒（Takara，中國大連） 將RNA合成互補(bǔ)DNA（cDNA）。利用SYBR Green mix （Takara）在Applied Biosystems 7500儀器中進(jìn)行cDNA擴(kuò)增和定量。本研究使用的引物序列在表1。采用2-ΔΔCt法測定基因相對表達(dá)量。內(nèi)對照分別為Ⅱ型穿膜蛋白CD74和let-7c-5p的甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）和U6。

表1 引物序列

1.6 雙螢光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 將含有l(wèi)et-7c-5p結(jié)合位點(diǎn)的野生型（WT）或突變型（MUT）CD74片段引入pGL3-basic載體（Promega， Madison， WI， USA）。為了進(jìn)行螢光素酶檢測，Hep-2細(xì)胞同時(shí)加入let-7c-5p模擬物或相應(yīng)的陰性對照（NC）。48 h后，應(yīng)用螢光素酶報(bào)告系統(tǒng)（Promega）來檢查螢光素酶的活性。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 24.0和GraphPad Prism 8.0.1軟件處理數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)性分析檢驗(yàn)兩變量的相關(guān)性。以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 WGCNA鑒定與DR進(jìn)展相關(guān)的核心miRNA 為了鑒定與DR進(jìn)展相關(guān)的miRNA，我們通過WGCNA在GSE160308中構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，使用80個(gè)樣本構(gòu)建鄰接矩陣（圖1A）。在本研究中，我們選擇β=5作為閾值構(gòu)建無縮放網(wǎng)絡(luò)（圖1B、1C），在使用合并的動態(tài)樹切割后共鑒定出4個(gè)miRNA表達(dá)模塊，通過構(gòu)建隨機(jī)基因網(wǎng)絡(luò)圖譜，分析其與DR進(jìn)展的相互作用關(guān)系，通過計(jì)算模塊特征基因與臨床特征之間的相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn)turquoise模塊與DR的發(fā)展相關(guān)性最強(qiáng)（圖1D），隨后我們以severity score≥0.2與相關(guān)系數(shù)≥0.8共獲得let-7c-5p和miR-26a-5p兩個(gè)核心miRNA（圖1E）。

圖1 鑒定與糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）進(jìn)展相關(guān)的核心微RNA（miRNA）：A為樣本樹狀圖；B、C分別為分析無尺度擬合指數(shù)和各種軟閾值函數(shù)的平均連通性，評估β=5時(shí)的無縮放拓?fù)?；D為模塊特征基因與DR臨床性狀相關(guān)性的熱圖；E為miRNA severity score與相關(guān)系數(shù)散點(diǎn)分布圖（每個(gè)點(diǎn)代表一個(gè)miRNA）

2.2 WGCNA鑒定與DR進(jìn)展相關(guān)的核心基因隨后，我們進(jìn)一步鑒定與DR進(jìn)展相關(guān)的基因，通過WGCNA在GSE160308構(gòu)建共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)，在本研究中，我們選擇β=3作為閾值構(gòu)建無縮放網(wǎng)絡(luò)，動態(tài)樹切割后共鑒定11個(gè)基因模塊。為了獲得中心基因，我們分析了與DR相關(guān)性最高模塊中基因的PPI網(wǎng)絡(luò)，將結(jié)果導(dǎo)入Cytoscape軟件，用MCODE插件進(jìn)行處理，并在度截止值=2的條件下得到11個(gè)核心基因，包括CD74（圖2）。

圖2 與糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）相關(guān)性最強(qiáng)的模塊中的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）核心網(wǎng)絡(luò)

2.3 高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞let-7c-5p與CD74表達(dá)及相關(guān)性 為了進(jìn)一步驗(yàn)證DR進(jìn)展的調(diào)節(jié)機(jī)制，探尋核心miRNA和核心基因的相互關(guān)系。我們通過ENCORI數(shù)據(jù)庫對核心miRNA和核心基因進(jìn)行匹配，發(fā)現(xiàn)let-7c-5p與CD74存在靶向結(jié)合的可能性，因此我們在高糖誘導(dǎo)的人類視網(wǎng)膜細(xì)胞中檢測let-7c-5p和CD74的表達(dá)水平，結(jié)果表明與正常培養(yǎng)的人類視網(wǎng)膜細(xì)胞（1.01±0.02，1.00±0.01）相比，高糖處理的會顯著下調(diào)let-7c-5p的水平（0.46±0.08，t=20.01，P＜0.001）和顯著上調(diào)CD74的水平（3.62±0.13，t=60.28，P＜0.001）。隨后，我們對let-7c-5p 和CD74兩者之間的相關(guān)性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)兩者呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.99，P=0.012）。

2.4 let-7c-5p靶向抑制CD74表達(dá) 為了確定在人類視網(wǎng)膜細(xì)胞中l(wèi)et-7c-5p靶向結(jié)合CD74，我們在ENCORI數(shù)據(jù)庫中預(yù)測let-7c-5p與CD74的結(jié)合位點(diǎn)（圖3）。此外，let-7c-5p模擬物降低了CD74-WT的相對螢光素酶活性（1.00±0.01比0.43±0.06；t=28.11，P＜0.001）。我們沒有發(fā)現(xiàn)CD74-MUT組之間的差異（1.01±0.03比0.99±0.02；t=1.66，P=0.116）。

圖3 生物信息學(xué)網(wǎng)站預(yù)測let-7c-5p與CD74的結(jié)合位點(diǎn)

3 討論

DR是糖尿病最常見的并發(fā)癥之一，并且仍然是全球視力喪失和失明的主要原因［17］。糖尿病會影響眼睛的許多組成部分，但威脅視力的主要病理發(fā)生在視網(wǎng)膜中。盡管在 DR 的預(yù)防和治療方面取得了重大進(jìn)展，但是DR的失明率并未見下降，這表明 DR 的預(yù)防和抑制仍然面臨多重挑戰(zhàn)，需要進(jìn)一步研究。與傳統(tǒng)檢測和治療手段相比，miRNA的在其中扮演的角色可能非常重要。因此，通過生物信息學(xué)方法篩選關(guān)于DR進(jìn)展相關(guān)的核心miRNA和核心基因，探明核心miRNA與核心基因之間的相互調(diào)節(jié)關(guān)系可能為DR進(jìn)展的調(diào)控作用機(jī)制提供新的見解，可為治療DR提供新的方法。

在本研究中，我們通過WGCNA篩選出關(guān)于DR進(jìn)展的兩個(gè)核心miRNA（let-7c-5p和miR-26a-5p），其中l(wèi)et-7c-5p在DR中顯著下調(diào)。在Grieco等［18］的研究中，DR病人血液循環(huán)中l(wèi)et-7c-5p不僅比正常的病人低，還比2型糖尿病的病人低。此外還有研究表明，在1型糖尿病（T1D）中， let-7c-5p與病人快速進(jìn)展為終末期腎病的風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)［19］。同時(shí)還有研究表明，let-7c-5p與2型糖尿病腎病的進(jìn)展有關(guān)，可以作為2型糖尿病腎病的診斷標(biāo)志物［20］。在我們的研究中l(wèi)et-7c-5p與DR進(jìn)展相關(guān)，并且let-7c-5p呈現(xiàn)顯著下降趨勢。在周小平、歐鄺［21］的研究中，過表達(dá)let-7c-5p可以阻止大鼠DR模型的發(fā)展。以上數(shù)據(jù)表明，通過WGCNA篩選的let-7c-5p可以作為鑒定DR進(jìn)展的標(biāo)志物，通過監(jiān)測let-7c-5p可以有效鑒定DR進(jìn)展情況，但是本研究并未針對臨床資料進(jìn)行研究，缺乏數(shù)據(jù)體現(xiàn)，后續(xù)研究將主要分析let-7c-5p對DR臨床意義，這也是我們后續(xù)的研究目標(biāo)。

本研究通過WGCNA篩選出DR進(jìn)展的核心miRNA和核心基因，并在細(xì)胞中進(jìn)行l(wèi)et-7c-5p與CD74的表達(dá)水平和相關(guān)性，結(jié)果表明let-7c-5p靶向抑制CD74的表達(dá)。CD74是一種跨膜糖蛋白，作為伴侶調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)運(yùn)輸，是細(xì)胞因子巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）和D-多巴色素互變異構(gòu)酶 （DDT/MIF-2） 的同源細(xì)胞表面受體。在一項(xiàng)關(guān)于人類1型糖尿病病人基因表達(dá)譜進(jìn)行的最大規(guī)模的研究發(fā)現(xiàn)，CD74是其中上調(diào)的基因之一，這些基因主要富集在炎癥響應(yīng)通路中，參與高糖引起的免疫調(diào)控［22］。MIF/CD74軸在許多疾病中起到了至關(guān)重要的作用，在糖尿病足細(xì)胞損傷中，CD74在足細(xì)胞中充當(dāng)MIF的受體，在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮作用［23］。在一些研究中，MIF作為T1D疾病發(fā)病機(jī)制的一個(gè)促成因素，在糖尿病小鼠模型中，MIF基因表達(dá)和CD74+白細(xì)胞頻率增加，表明MIF/CD74 信號通路在促進(jìn)T1D中巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥中的可能作用［24］。最近有研究表明，二甲雙胍作為糖尿病的有效治療藥物，可在2型糖尿病病人中表現(xiàn)出其足細(xì)胞保護(hù)能力，其潛在機(jī)制可能部分歸因于其抑制MIF-CD74軸介導(dǎo)的炎癥級聯(lián)反應(yīng)的作用［25］。而在DR中MIF/CD74信號傳導(dǎo)參與增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變［26］。此外，血管功能障礙和血管退化是各種炎癥性中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病和炎癥相關(guān)視網(wǎng)膜疾病（如糖尿病視網(wǎng)膜病變）的標(biāo)志。小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和體液先天免疫系統(tǒng)是促成因素。已經(jīng)提出抗炎方法作為神經(jīng)血管疾病的療法，包括調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細(xì)胞活化。小膠質(zhì)細(xì)胞活化與炎癥性視網(wǎng)膜血管侵犯相關(guān)［27］，而MIF/CD74信號傳導(dǎo)阻礙小膠質(zhì)細(xì)胞M1極化［28］。

總之，本研究通過WGCNA方法篩選出DR進(jìn)展核心miRNA let-7c-5p和核心基因CD74，且兩者存在靶向抑制關(guān)系，通過探明let-7c-5p通過靶向抑制CD74 在 DR進(jìn)展中的作用，可為DR的治療開發(fā)新的遺傳治療策略的靶標(biāo)。