含笑，胡茂能，王國(guó)亮，祁磊，趙毛毛

國(guó)內(nèi)外的多項(xiàng)臨床隨機(jī)對(duì)照研究證實(shí)經(jīng)導(dǎo)管動(dòng)脈化療栓塞術(shù)（transcatheter arterial chemoemboli-zation，TACE）在原發(fā)性肝癌治療中的顯著有效性，TACE已成為無(wú)法切除的原發(fā)性肝細(xì)胞肝癌（hepatocelluar carcinoma，HCC）的首選治療方式［1-2］。HCC是一種典型的富血供腫瘤，不論是腫瘤的早期還是晚期，血管的生成都是腫瘤進(jìn)展或轉(zhuǎn)移的重要原因［3-4］?，F(xiàn)有研究同樣認(rèn)為T(mén)ACE術(shù)后病人復(fù)發(fā)的原因和HCC新生血管有關(guān)［5］。貝伐單抗（Bevacizumab， Bev）是當(dāng)前公認(rèn)具有顯著療效的抗血管生成藥物［6-7］。目前文獻(xiàn)報(bào)道貝伐珠單抗主要與阿替利珠單抗、索拉非尼等聯(lián)合應(yīng)用可顯著改善HCC病人生存［8］。VX2肝癌是Shop病毒在兔皮膚上誘發(fā)的一種鱗癌，經(jīng)過(guò)傳代后可作為兔移植性腫瘤，并且在肝臟的移植成功率較高［9-10］。但目前關(guān)于VX2兔肝癌在數(shù)字減影血管造影（DSA）設(shè)備引導(dǎo)下實(shí)施介入治療，尤其是以Bev為代表的靶向藥物介入治療研究尚不多見(jiàn)。因此，采用VX2兔建立一種穩(wěn)定的肝癌靶向藥物治療模型具有重要的實(shí)踐意義。2019年11月至2022年6月，本研究通過(guò)總結(jié)建立基于DSA的VX2兔肝癌靶向藥物治療模型的相關(guān)經(jīng)驗(yàn)，同時(shí)分析影響實(shí)驗(yàn)兔死亡的危險(xiǎn)因素，為VX2肝癌實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行介入診療提供經(jīng)驗(yàn)借鑒。

1 資料與方法

1.1 一般資料 荷瘤兔1只和新西蘭大白兔（實(shí)驗(yàn)兔）44只由南京云橋璞瑞生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物合格證號(hào)：202254638，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（蘇）2021-0016。荷瘤兔，雄性，體質(zhì)量2.05 kg。實(shí)驗(yàn)兔，雌、雄各22只，體質(zhì)量（2.35±0.40）kg，范圍為1.80～2.85 kg。使用隨機(jī)數(shù)字表法將實(shí)驗(yàn)兔隨機(jī)等分為兩組，各22只，分別行常規(guī)TACE治療和Bev聯(lián)合TACE治療。本研究獲合肥市第三人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2019LLW020）。

1.2 腫瘤移植與傳代 使用10%水合氯醛以3 mL/kg劑量腹腔內(nèi)注射進(jìn)行麻醉。以外科手術(shù)剝離荷瘤兔背部瘤體，切取魚(yú)肉狀瘤組織，置于20 000 U慶大霉素注射液+50 mL生理鹽水的混懸液中，然后使用眼科剪將瘤塊剪成直徑1～2 mm的碎塊以備腫瘤移植和傳代使用。將實(shí)驗(yàn)兔使用上述同樣方法麻醉后進(jìn)行開(kāi)腹直接穿刺接種法腫瘤移植：常規(guī)備皮、消毒后，于實(shí)驗(yàn)兔劍突下正中偏左作一縱向切口，長(zhǎng)度約2 cm，逐層打開(kāi)腹腔直至暴露肝臟左內(nèi)葉，以4F規(guī)格的空心穿刺針直視下斜行輕柔刺破肝包膜，插入深度約為肝包膜下5 mm，用其內(nèi)芯推入3～5個(gè)瘤塊，隨后以相應(yīng)規(guī)格的明膠海綿顆粒4～5粒沿穿刺針推送，封堵穿刺通道后拔出穿刺針，分層縫合腹部切口。最后，用注射器抽取1 mL（含上述組織塊8～10塊）經(jīng)21 G穿刺針注入健康新西蘭兔雙側(cè)后肢皮下以保種傳代。術(shù)后連續(xù)3 d予以實(shí)驗(yàn)兔后肢肌肉注射青霉素鈉注射液800 000 U/d進(jìn)行常規(guī)抗感染。

1.3 腫瘤的介入治療

1.3.1 設(shè)備與造影方法 機(jī)器型號(hào)為美國(guó)GE品牌3100IQ數(shù)字減影血管造影機(jī)，所有實(shí)驗(yàn)兔在介入治療前均行經(jīng)微導(dǎo)管股動(dòng)脈-肝動(dòng)脈造影，所有手術(shù)均由同一名實(shí)驗(yàn)員完成。實(shí)驗(yàn)兔右側(cè)腹股溝區(qū)備皮、常規(guī)消毒鋪巾，輕觸股動(dòng)脈搏動(dòng)區(qū)，于該區(qū)作一縱行切口，鈍性分離至完全暴露股動(dòng)脈，于股動(dòng)脈下穿4號(hào)縫合線置于近心端，隨后提緊縫線用以暫時(shí)阻斷血流，使用眼科剪將股動(dòng)脈遠(yuǎn)心端剪一小斜行切口，將3F微導(dǎo)管經(jīng)小切口直接插入股動(dòng)脈，透視下將微導(dǎo)管置于腹腔干開(kāi)口處進(jìn)行造影，采用路圖技術(shù)超選擇插管進(jìn)入肝總動(dòng)脈，連接高壓注射器行DSA檢查［11］。造影劑（碘佛醇，規(guī)格為320 mgI/mL，江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）流速為2～3 mL/s，總量為6 mL。術(shù)畢拔管，結(jié)扎右側(cè)股動(dòng)脈，逐層縫合切口，包扎傷口。

1.3.2 介入治療 常規(guī)TACE組：將罌粟乙碘油（江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司）0.3 mL/kg+阿霉素（瀚暉制藥有限公司）2 mg/kg充分乳化制成混懸液，經(jīng)3F微導(dǎo)管將混懸液緩慢注入靶血管內(nèi)。Bev聯(lián)合TACE組：超選擇插管至腫瘤血管供血?jiǎng)用}后，首先經(jīng)微導(dǎo)管緩慢注入Bev（安維汀，羅氏制藥有限公司）10 mg/kg，然后行TACE治療（方案同常規(guī)TACE組）。

1.4 觀察指標(biāo) 手術(shù)后第14天對(duì)實(shí)驗(yàn)兔進(jìn)行CT平掃+增強(qiáng)檢查評(píng)估腫瘤情況，同時(shí)抽取靜脈血了解實(shí)驗(yàn)兔肝腎功能，對(duì)于術(shù)后14 d內(nèi)死亡的實(shí)驗(yàn)兔認(rèn)為建模失敗。觀察可能影響手術(shù)效果的相關(guān)指標(biāo)，包括性別、體質(zhì)量、術(shù)中出血量、手術(shù)前后靜脈血血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）及總膽紅素水平、尿素氮、血肌酐水平。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 26.0軟件進(jìn)行分析。正態(tài)分布計(jì)量數(shù)據(jù)用表示；計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)使用率或構(gòu)成比進(jìn)行描述。連續(xù)性變量的差異采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，分類(lèi)資料的單因素分析采用χ2檢驗(yàn)。多因素分析采用非條件二分類(lèi)logistic回歸分析。受試者操作特征曲線（ROC曲線）分析相關(guān)因素的診斷價(jià)值，使用Delong法比較曲線下面積（AUC）之間的差異。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基線資料 A、B兩組實(shí)驗(yàn)兔介入治療前靜脈血肝腎功能、體質(zhì)量、性別等基線資料差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組實(shí)驗(yàn)兔肝癌介入治療前基線資料比較

2.2 影響術(shù)后死亡的單因素分析 兩組實(shí)驗(yàn)兔均移植成功，未出現(xiàn)廣泛性腹腔轉(zhuǎn)移及腹腔積液，造影顯示40只（占比90.91%）腫瘤呈典型富血供病灶。介入手術(shù)后第7天，所有實(shí)驗(yàn)兔均采集靜脈血檢查肝腎功能。根據(jù)實(shí)驗(yàn)兔手術(shù)后生存時(shí)間分為死亡組（存活時(shí)間＜14 d）和存活組（存活時(shí)間≥14 d），其中死亡組為10只，存活組為34只。分別比較相關(guān)因素在組間的差異。見(jiàn)表2。

表2 影響實(shí)驗(yàn)兔肝癌介入治療術(shù)后死亡的單因素分析

2.3 影響術(shù)后死亡的多因素分析 將上述單因素分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的變量（體質(zhì)量、GPT、GOT、總膽紅素）作為自變量，再以是否出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后短期內(nèi)死亡（出現(xiàn)為1，未出現(xiàn)為0）作為因變量，進(jìn)行非條件二分類(lèi)logistic回歸分析，采用逐步向后法擬合優(yōu)化模型進(jìn)行分析，結(jié)果顯示：體質(zhì)量低、術(shù)后總膽紅素高是實(shí)驗(yàn)兔介入術(shù)后短期內(nèi)死亡的獨(dú)立影響因素（均P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 影響實(shí)驗(yàn)兔肝癌術(shù)后死亡的多因素logistic回歸分析

2.4 影響因素對(duì)死亡事件的預(yù)測(cè)效能 采用ROC曲線進(jìn)行診斷效能分析，顯示術(shù)前體質(zhì)量、總膽紅素以及兩者聯(lián)合預(yù)測(cè)的AUC分別為0.90（0.81，0.99）、0.89（0.80，0.99）和0.96（0.90，1.00），靈敏度分別為90.0%、91.0%和90.0%，特異度則分別為76.5%、73.5%和91.2%。此時(shí)體質(zhì)量和總膽紅素的最佳臨界值分別為2.44 kg和4.84 μmol/L。進(jìn)一步比較AUC之間的差異，顯示AUC體質(zhì)量比AUC總膽紅素（Z=0.15，P=0.877）；AUC聯(lián)合比AUC體質(zhì)量（Z=1.83，P=0.067）；AUC聯(lián)合比AUC總膽紅素（Z=0.07，P=1.833）。

3 討論

HCC的腫瘤組織具有豐富的血供以及較多的新生血管，前者對(duì)TACE的良好療效提供了理論基礎(chǔ)，而后者則對(duì)腫瘤的快速生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移起到了重要作用［12-13］。2017年，歐洲一項(xiàng)研究認(rèn)為，對(duì)于原發(fā)性肝癌病人而言，傳統(tǒng)的TACE仍然是二期肝切除以及降期治療后肝移植的一線治療策略及可能的標(biāo)準(zhǔn)治療方法，并且可以顯著提高病人生存質(zhì)量［14］。國(guó)內(nèi)一項(xiàng)大樣本回顧性分析研究顯示經(jīng)TACE治療的原發(fā)性HCC病人的1、2、3年累積生存率分別為73.90%、40.20%和22.20%［15］。而梁彥玲等［16］研究報(bào)道TACE治療原發(fā)性肝癌的并發(fā)癥情況，顯示TACE治療的安全可行性。目前，鑒于肝癌發(fā)生時(shí)常出現(xiàn)的富血供、多發(fā)病灶甚至病灶較大等情況，TACE在HCC介入治療中仍然有著重要的地位［17-18］。

本研究中44只實(shí)驗(yàn)兔均成功實(shí)施了開(kāi)腹移植腫瘤，并在DSA設(shè)備引導(dǎo)下完成了不同的介入治療，顯示了基于DSA對(duì)VX2兔肝癌靶向藥物治療的模型建立較為穩(wěn)定和可靠。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)，在完成介入手術(shù)治療后14 d內(nèi)還發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)兔具有一定死亡率，進(jìn)一步行非條件二分類(lèi)logistic回歸分析顯示術(shù)前較低的體質(zhì)量和介入治療后較高的總膽紅素是實(shí)驗(yàn)兔介入治療后死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。ROC曲線分線顯示兩個(gè)危險(xiǎn)因素均具有較高的診斷效能，在截?cái)嘀捣謩e為2.44 kg和4.84 μmol/L時(shí)，均有著較高的靈敏度和特異度。將術(shù)前體質(zhì)量和術(shù)后總膽紅素進(jìn)行聯(lián)合預(yù)測(cè)時(shí)，比較顯示3種診斷曲線的AUC之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能和樣本量相對(duì)較小有關(guān)，雖然聯(lián)合診斷靈敏度無(wú)明顯變化，但特異度較單獨(dú)預(yù)測(cè)時(shí)均明顯提高，顯示聯(lián)合預(yù)測(cè)可能有著更好的診斷效能。

目前，DSA已成為介入治療尤其是肝癌介入治療最重要的引導(dǎo)設(shè)備之一［19-21］。雖然DSA引導(dǎo)下的VX2兔肝癌靶向治療建模成功率較為穩(wěn)定，但本研究顯示實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量≤2.44 kg時(shí)，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后死亡的預(yù)測(cè)效能最高。既往一項(xiàng)關(guān)于肝動(dòng)脈、門(mén)靜脈雙介入的VX2兔肝癌模型研究中發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)兔體質(zhì)量＜2.5 kg時(shí)容易在建模后死亡［11］，本研究與其基本一致。究其原因，可能是較小體質(zhì)量的實(shí)驗(yàn)兔血容量較少、耐受性較差。此外，體質(zhì)量較小的實(shí)驗(yàn)兔其血管較細(xì)，很多時(shí)候需要反復(fù)穿刺，增加了創(chuàng)傷性。

本研究還顯示，實(shí)驗(yàn)兔術(shù)后肝功能狀態(tài)同樣能影響建模的成功率。單因素分析顯示GPT、GOT以及總膽紅素在存活組和死亡組之間均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，顯示無(wú)論行TACE還是TACE聯(lián)合Bev治療，術(shù)后實(shí)驗(yàn)兔肝功能均有一定程度受損。而多因素分析則顯示總膽紅素為實(shí)驗(yàn)兔死亡的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，也進(jìn)一步提示實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)適當(dāng)減少栓塞劑的用量，嘗試保護(hù)肝功能藥物的應(yīng)用，以減輕肝功能受損程度。

本研究尚有一定的局限性，一方面，樣本量相對(duì)較少，有一定的選擇性偏倚；另一方面，實(shí)驗(yàn)人員的熟練程度也在一定程度上影響著建模的成功率。

綜上所述，在DSA設(shè)備引導(dǎo)下行VX2兔肝癌介入治療模型建立具有較高的可靠性，可以為肝癌的微創(chuàng)治療提供更好的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，值得推廣應(yīng)用。