張子杭，成元華

胃癌起源于胃表層黏膜［1-2］，侵襲和轉(zhuǎn)移是病人死亡的主要原因［3］。胃癌的發(fā)病率逐年升高［4］，在全球癌癥死亡率中排第二，但其確切發(fā)病機制仍未完全闡明。研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）信號通路參與了胃癌的發(fā)生發(fā)展［5］，胃癌病人TGF-β1（TGF-β通路激活劑）的高表達(dá)可能與病人預(yù)后差相關(guān)［6-7］。當(dāng)給予外源性TGF-β1時，腫瘤細(xì)胞的生長速度、侵襲能力和轉(zhuǎn)移能力均增加［8］。TGF-β1通過促進(jìn)腫瘤間質(zhì)中血管的生長從而增強胃癌細(xì)胞侵襲能力，SB431542可抑制激活素受體樣激酶（activin receptor-like kinase，ALKs）活力，是ALK家族中ALK-5（TGF-β1型受體）的有效抑制劑，SB431542使胞內(nèi)信號蛋白Sma和Mad相關(guān)蛋白（Smad）2和Smad3不能被激活，進(jìn)一步抑制其磷酸化過程，TGF-β信號通路因此被阻斷。TGF-β信號通路已被證實參與體內(nèi)上皮間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）的激活［9］。TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路通過Smads的中間傳導(dǎo)，使信號得以從細(xì)胞外部傳入到細(xì)胞內(nèi)部，是TGF-β信號通路傳導(dǎo)的關(guān)鍵。相關(guān)研究提示，EMT誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄因子slug在高分化胃癌中低表達(dá)，在低分化胃癌中高表達(dá)，而上皮鈣黏素（E-cad）的表達(dá)則與之相反，不難推測胃癌惡性程度與slug蛋白的表達(dá)程度成正比，而與E-cad表達(dá)程度成反比。本研究旨在探討TGF-β信號通路對胃癌HGC-27細(xì)胞增殖侵襲能力及裸鼠胃癌異種移植模型中slug和E-cad基因mRNA和蛋白表達(dá)的影響，以期進(jìn)一步為闡明胃癌的發(fā)病機制，充實實驗依據(jù)。本研究起止時間為2021年4月至2022年3月。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞系及細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑 胃癌HGC-27細(xì)胞系購自上海傳秋生物公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自KATAWA。

1.1.2 實驗動物及飼養(yǎng)環(huán)境 35只BALB/c雄性裸鼠購自思貝福（北京）生物科技公司［動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（北京）2019-0010］，體質(zhì)量（18±2）g，3～4周齡，飼養(yǎng)于貴州醫(yī)科大學(xué)無特定病原體（SPF）動物房。本研究經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會（IACUC）批準(zhǔn)（批號2101147），接受國際實驗動物評價與認(rèn)證管理委員會的監(jiān)督和管理。裸鼠飼料和飲用水購自北京華富康生物公司。

1.1.3 實驗主要試劑 TGF-β1購自美國Enzo，TGF-β通路阻滯劑SB-431542購自MedChemExpress，二甲基亞砜（DMSO）購自Solarbio Technology公司，細(xì)胞計數(shù)試劑盒（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑盒購自大連美倫生物科技公司，Thermo ScriptTM RT-PCR System試劑盒購自美國Invitrogen公司，酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自上?？道噬锟萍脊?，slug兔抗人單克隆抗體（1∶1 000）、E-cad兔抗人單克隆抗體（1∶1 000）購自美國CST公司，GAPDH鼠抗人單克隆抗體（1∶4 000）購自Abcam公司，HRP標(biāo)記山羊抗兔二抗（1∶5 000）、HRP標(biāo)記山羊抗鼠二抗（1∶5 000）購自ASPEN公司，蛋白質(zhì)印跡法相關(guān)耗材購自索萊寶科技公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 配置88%RPMI 1640+11%胎牛血清+1%雙抗體成分的完整細(xì)胞培養(yǎng)基（KATAWA有限公司），在37 ℃、5%二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型 當(dāng)細(xì)胞數(shù)大于1×108/mL時，將細(xì)胞重懸于磷酸緩沖鹽溶液（PBS）中。裸鼠皮膚消毒后，向裸鼠背部皮膚注射0.2 mL HGC-27細(xì)胞（1×108/mL）。每天同一時間觀察裸鼠活動，記錄裸鼠腫瘤體積和質(zhì)量的變化。待實性包塊長出，瘤體長徑達(dá)5 mm后，視為造模成功。

1.2.3 體內(nèi)實驗分組 使用隨機數(shù)字表法將造模成功的裸鼠分為五組，（1）空白對照組：注射等量生理鹽水；（2）激動劑組：皮下注射TGF-β1（1微克/只）；（3）阻斷劑組：腹腔注射SB431542（0.7 mg/kg）；（4）激動劑+低濃度阻斷劑組：TGF-β1（1微克/只）+SB431542（0.7 mg/kg）；（5）激動劑+高濃度阻斷劑組：TGF-β1（1微克/只）+SB431542（1.0 mg/kg）。常規(guī)碘伏消毒裸鼠皮膚后，按照體內(nèi)實驗分組進(jìn)行注射，每3天注射1次，并每3天記錄1次裸鼠腫瘤大小，用游標(biāo)卡尺測量腫瘤長徑（a）及與長徑垂直的短徑（b），由此計算出腫瘤體積V=（a×b2）/ 2并繪制腫瘤生長曲線。密切觀察荷瘤鼠的一般情況，如活動、飲食、死亡等情況。飼養(yǎng)24 d后，腫瘤體積≥1 cm3，備好消毒后的手術(shù)相關(guān)器械，于停藥第2天后每組腹腔注射1%戊巴比妥鈉0.1 mL麻醉后處死裸鼠，脫頸椎處死裸鼠進(jìn)行取材并觀察腫瘤大體形態(tài)，使用游標(biāo)卡尺記錄其體積，濾紙拭干瘤塊表面血液后使用電子天平測量其質(zhì)量（為保證精確，每塊腫瘤測量5次，最終取其平均數(shù)作為最終數(shù)據(jù)）取出后的瘤塊分為3份，兩份放入-80 ℃超低溫冰箱用于后期使用逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）檢測slug和E-cad蛋白表達(dá)情況，另一份放入10%中性緩沖福爾馬林中，固定8～18 h后包埋成石蠟塊，制作常規(guī)蘇木精-伊紅（HE）染色切片。

1.2.4 常規(guī)病理學(xué)檢查 將腫瘤塊按照取材、固定、脫水、透明、浸蠟及包埋的順序制作成病理切片，通過常規(guī)HE染色觀察腫瘤的病變及形態(tài)特征。

1.2.5 RT-PCR檢測slug和E-cad基因mRNA表達(dá)按照RevertAid?第一鏈互補DNA（cDNA）合成試劑盒（美國Invitrogen公司）說明書從腫瘤組織中提取總RNA，然后進(jìn)行RNA逆轉(zhuǎn)錄得到第一鏈cDNA；人類slug、E-cad基因和GAPDH基因序列由上海盛工公司合成。引物序列如下，slug：正向5'-GAGCATTTGCAGACAGGTCA-3'，反向5'-GCTTCGGAGTGAAGAAATGC-3'；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）：正向5'-GGGAGCCAAAAGGGTCATCATCTC-3'，反向5'-CCAGTCCAGTGAGCTTCCCGTTC-3'；E-cad：正向5'-AAGGAGGCGGAGAAAGAGGAC-3'，反向5'-CGTCGTTACGAGTCACTTCAGG-3'。單獨配置Realtime PCR反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行熒光定量PCR擴增，采用相對定量比較法，即RNA的相對量=2-ΔΔCt計算。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測腫瘤細(xì)胞和組織中slug和E-cad蛋白的表達(dá) 提取總蛋白并使用BCA進(jìn)行蛋白定量后進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）實驗（索萊寶科技公司），雜交顯色后用Image-ProPlus圖像分析軟件對蛋白條帶進(jìn)行灰度分析。以各蛋白條帶的灰度值代表蛋白的表達(dá)量。計算每個蛋白條帶的灰度值與對應(yīng)的內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值，再進(jìn)行統(tǒng)計分析。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 16.0、Graph pad 8.0.2和Image-ProPlus圖像分析軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布以表示，多組定量數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 裸鼠移植瘤模型的建立與常規(guī)病理學(xué)檢查

2.1.1 構(gòu)建裸鼠移植瘤模型 使用1×108/mL細(xì)胞進(jìn)行裸鼠背部皮下造模后，觀察到裸鼠一般情況無異常，活動能力佳，接種部位未見紅腫、破潰等現(xiàn)象?？瞻讓φ战M于接種細(xì)胞后（15±3）d長出長徑5 mm以上瘤塊視為造模成功。35只裸鼠共造模成功30只，每組6只，成瘤率為90%，造模耗時約1個月，造模成功后，再按照分組進(jìn)行不同處理。

2.1.2 人胃癌HGC-27裸鼠移植瘤觀察 肉眼觀察：不同組別裸鼠在接種部位皮下均長出腫塊，表面皮膚無破潰，腫塊邊界不清，腫塊與周圍肌肉、骨組織粘連，無包膜，灰白色，質(zhì)中，見多灶性壞死。

鏡下觀察：腫瘤浸入周圍骨骼肌纖維間，無包膜，可見多灶性壞死。腫瘤細(xì)胞呈上皮樣、圓形或卵圓形，排列成巢團(tuán)狀，細(xì)胞核呈泡狀。

2.2 TGF-β通路對HGC-27細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤生長的影響 不同組別HGC-27細(xì)胞移植瘤的腫瘤體積不同：經(jīng)過3 d的生長停滯期后，自第9天起，激動劑組腫瘤生長速度快于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；阻斷劑組腫瘤生長速度慢于空白對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；激動劑+高濃度阻斷劑組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；激動劑+低濃度阻斷劑組與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）通路對HGC-27胃癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤體積的影響/（mm3，）

表1 轉(zhuǎn)化生長因子-β（TGF-β）通路對HGC-27胃癌細(xì)胞裸鼠皮下移植瘤體積的影響/（mm3，）

注：①與空白對照組比較，P＜0.05。②與激動劑組比較，P＜0.05。③與阻斷劑組比較，P＜0.05。

組別空白對照組激動劑組阻斷劑組激動劑+低濃度阻斷劑組激動劑+高濃度阻斷劑組F值P值第24天544.00±60.00 854.00±193.00①215.00±73.90①②412.00±36.00②③457.00±169.00②③230.46＜0.001鼠數(shù)6 6 6 6 6第9天15.00±4.50 62.00±3.40①5.00±3.00①②13.00±5.20②③13.00±6.30②③32.34＜0.001第12天40.00±10.00 143.00±102.00①13.00±4.50①②32.00±13.00②③35.00±7.20②③36.19＜0.001第15天62.00±4.50 162.00±99.20①23.00±8.10①②58.00±4.00②③58.00±16.70②③200.64＜0.001第18天158.00±31.90 329.00±196.70①62.00±13.50①②148.00±9.50②③138.00±51.30②③88.16＜0.001第21天288.00±61.40 562.00±163.00①153.00±31.50①②249.00±36.80②③254.00±10.00②③87.95＜0.001

空白對照組、激動劑組、阻斷劑組、激動劑+高濃度阻斷劑組、激動劑+低濃度阻斷劑組腫瘤質(zhì)量分別為（1.52±0.41）g、（2.74±0.52）g、（0.61±0.32）g、（1.63±0.19）g、（1.92±0.49）g（F=94.56，P=0.019），激動劑組的腫瘤質(zhì)量高于空白對照組（P＜0.05），阻斷劑組腫瘤質(zhì)量小于空白對照組（P＜0.05）。

2.3 體內(nèi)實驗中slug和E-cad基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況

2.3.1 使用RT-PCR檢測腫瘤組織中slug和E-cad基因的mRNA表達(dá)水平 對取出的腫瘤組織塊使用RT-PCR檢測slug和E-cad基因的mRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示：空白對照組、激動劑組、阻斷劑組、激動劑+低濃度阻斷劑組、激動劑+高濃度阻斷劑組slug表達(dá)水平分別為1.00±0.00、2.13±0.07、0.57±0.05、0.87±0.02、0.74±0.05（F=82.67，P=0.004），激動劑組slug mRNA表達(dá)水平高于空白對照組（P＜0.001），阻斷劑組slug mRNA表達(dá)水平低于空白對照組（P＜0.001）；空白對照組、激動劑組、阻斷劑組、激動劑+低濃度阻斷劑組、激動劑+高濃度阻斷劑組E-cad表達(dá)水平分別為1.00±0.00、0.44±0.04、2.46±0.08、0.77±0.06、0.68±0.03（F=43.19，P=0.022），激動劑組E-cad mRNA表達(dá)水平低于空白對照組（P＜0.05），阻斷劑組E-cad mRNA表達(dá)水平高于空白對照組（P＜0.05）。

2.3.2 使用蛋白質(zhì)印跡法檢測腫瘤組織中slug與E-cad的蛋白表達(dá)情況 腫瘤組織勻漿后，進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡法，結(jié)果顯示：激動劑組E-cad蛋白濃度低于其他組（P＜0.05）；阻斷劑組高于其他組（P＜0.05）；在激動劑+低濃度阻斷劑和激動劑+高濃度阻斷劑組兩組中，slug與E-cad的蛋白表達(dá)情況與空白對照組相比，均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖1，表2。

圖1 蛋白質(zhì)印跡法檢測裸鼠胃癌異種移植模型體內(nèi)slug蛋白和E-cad蛋白表達(dá)

表2 各組裸鼠胃癌異種移植模型slug與上皮鈣黏素（E-cad）的蛋白表達(dá)水平比較/

表2 各組裸鼠胃癌異種移植模型slug與上皮鈣黏素（E-cad）的蛋白表達(dá)水平比較/

注：①與空白對照組比較，P＜0.05。②與激動劑組比較，P＜0.05。

E-cad 0.19±0.02 0.04±0.08①0.42±0.09①②0.16±0.02 ②0.15±0.02 ②210.24＜0.001組別空白對照組激動劑組阻斷劑組激動劑+低濃度阻斷劑組激動劑+高濃度阻斷劑組F值P值鼠數(shù)6 6 6 6 6 slug 0.25±0.02 0.53±0.05①0.04±0.06①②0.15±0.04 ②0.12±0.03 ②84.88＜0.001

3 討論

TGF-β信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在不同腫瘤中都通過EMT促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展［10］，相關(guān)研究表明，TGF-β信號通路對腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移有較大影響［11］。激活該信號通路后，上皮細(xì)胞獲得侵襲特性，其生長速度和轉(zhuǎn)移能力得到提高［12］。腫瘤細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變導(dǎo)致黏附力下降，使腫瘤細(xì)胞更容易脫落，進(jìn)而分泌基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）破壞鄰近的細(xì)胞外基質(zhì)（extra cellular matrix，ECM）和基底膜［13］。在TGF-β信號通路中，SMADs蛋白家族介導(dǎo)了TGF-β信號從細(xì)胞外進(jìn)入細(xì)胞核的過程，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞EMT的進(jìn)展，調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖、分化、凋亡、衰老、遷移等［14］。

EMT主要特征是上皮細(xì)胞喪失極性而獲得間質(zhì)特性［15］，典型標(biāo)志是上皮細(xì)胞標(biāo)志物E-cad表達(dá)降低而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cad表達(dá)增加［16］。正常生理條件下，E-cad表達(dá)于各類正常上皮細(xì)胞，介導(dǎo)上皮細(xì)胞與上皮細(xì)胞之間的緊密連接，在維持細(xì)胞的極性和組織結(jié)構(gòu)的完整性中起重要作用［17］。E-cad表達(dá)降低或缺失是EMT最顯著的特征，同時也是多種腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移及病人出現(xiàn)不良預(yù)后的臨床評估指標(biāo)［18］。slug是誘導(dǎo)EMT發(fā)生的一種轉(zhuǎn)錄因子，同時也是E-cad的上游轉(zhuǎn)錄因子，相關(guān)研究中發(fā)現(xiàn)，slug轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況往往與E-cad表達(dá)情況相反。

目前，關(guān)于胃癌中EMT和TGF-β信號通路的研究大多集中于細(xì)胞層面而未進(jìn)行動物體內(nèi)實驗。眾所周知，體內(nèi)實驗對于基礎(chǔ)研究向臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化具有不可替代的作用［19］。因此，本實驗使用研究較少的人胃癌HGC-27細(xì)胞系，豐富了TGF-β通路研究的實驗基礎(chǔ)，旨在通過外源性藥物激活和阻斷TGF-β信號通路，觀察胃癌細(xì)胞在體內(nèi)增殖和侵襲能力的變化、瘤體大小與質(zhì)量以及EMT過程中相關(guān)基因slug與E-cad的mRNA與蛋白表達(dá)水平的變化。

slug在EMT誘導(dǎo)中具有公認(rèn)的作用［20］，因此本研究探索了slug蛋白表達(dá)情況與E-cad蛋白的表達(dá)關(guān)系，并加以實驗驗證。本研究發(fā)現(xiàn)：使用TGF-β通路激活劑TGF-β1激活該通路后，腫瘤組織中的slug基因mRNA與蛋白表達(dá)水平均升高，而E-cad基因的mRNA與蛋白表達(dá)水平均下降；使用TGF-β通路阻斷劑SB431542阻斷該通路后，腫瘤組織中的slug基因mRNA與蛋白表達(dá)均下降，而E-cad基因的mRNA與蛋白表達(dá)水平均上升。

蛋白表達(dá)水平的改變往往導(dǎo)致生物學(xué)行為的改變。激活TGF-β通路所導(dǎo)致的slug與E-cad蛋白表達(dá)情況的改變，在裸鼠身上表現(xiàn)為胃癌移植瘤體積和質(zhì)量增加、腫瘤細(xì)胞惡性程度增加，我們觀察到當(dāng)TGF-β通路激活后腫瘤生長速度大幅度上升，相關(guān)文獻(xiàn)報道：TGF-β通路的激活可誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）生成增加［21-22］。TGF-β1可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞中VEGF的表達(dá)，而VEGF可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞周圍的血管形成，從而增加腫瘤細(xì)胞增殖速度。因此可推測本研究在激活TGF-β通路后，VEGF表達(dá)增加，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖速度從而增加腫瘤體積。

綜上所述，當(dāng)TGF-β通路被激活后，活化的TGF-β受體1將SMAD2和SMAD3磷酸化，磷酸化的SMAD2和SMAD3與SMAD4組裝成異二聚體和三聚體復(fù)合物，然后進(jìn)入細(xì)胞核［23］，直接與slug的啟動子結(jié)合以誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄，促使slug結(jié)合CDH1的啟動子，抑制E-cad蛋白的編碼而促進(jìn)EMT的進(jìn)展，導(dǎo)致N-cad的表達(dá)上升、E-cad的表達(dá)下降，TGF-β信號通路可通過改變slug和E-cad基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況，從而調(diào)節(jié)胃癌細(xì)胞增殖和侵襲能力。