陳剛，汪生，宮鵬

中風是一種常見的老年性疾病，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率等特點［1-2］。復方中藥制劑在中醫(yī)整體觀和辨證論的指導下，多成分協同、多向調節(jié)，具有不良反應小、治療費用低、安全性能好等優(yōu)點，在疾病治療領域發(fā)揮越來越重要的作用［3-5］。十二味參芍益腦合劑由當歸、生地黃、炒白芍、川芎、黃芩、梔子、玄參、菊花、牡丹皮、車前子、龍骨和甘草12味中藥材組成，是太和縣中醫(yī)院多年應用經驗方。該藥適合于肝陽上亢型的中風及各類型的偏頭痛，臨床療效確切。

前期十二味參芍益腦合劑主要化學成分分析研究工作中，共鑒定出綠原酸、梔子苷、黃芩苷、甘草苷、芍藥苷和芍藥內酯苷等27個化學成分。在現有的質量標準中，含量測定僅考察黃芩苷含量，而制劑中其他主要化學成分的含量及相關質量控制指標不夠全面。近代藥理學研究表明：黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善血腦屏障通透性和神經保護作用［6-9］；芍藥苷和芍藥內酯苷，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化的作用［10-12］；梔子苷也可通過抗炎、抑制細胞凋亡等過程協同治療腦缺血等疾?。?3-15］。2021年3月至2022年5月，本研究依據前期十二味參芍益腦合劑成分解析及主要化學成分的藥理作用確定12種主要化學成分檢測指標，建立超高效液相色譜-靜電場軌道阱質譜（ultra-performance liquid chromatography tandem hybrid orbitrap mass spectrometry， UPLC-Q-Orbitrap-MS）測定法，為后期的十二味參芍益腦合劑質量控制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Thermo Q-Exactive plus四極桿-靜電場軌道阱質譜儀（配有在線真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和Xcalibur工作站，美國Thermo Fisher公司）；Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Waters UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm，美國Waters公司）；XPE205型電子分析天平（德國Sartorius）；5424R臺式高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；Milli-Q Integral 5超純水系統（美國Millipore公司）。

1.1.2 試藥與試劑 十二味參芍益腦合劑（批號21063001、21071301、21081001、21083101、21092301、21101401、21110801、21110901、21111001、21121301、22012101、22022301、22030901、22042301、22042401、22042501）共16批，由太和縣中醫(yī)院提供。對照品：芹菜素（批號C10690542）、黃芩素（批號C12773748）、甘草素（批號C10828731）、千層紙素A（批號C12223962）、綠原酸（批號C11860894）、梔子苷（批號C12714185）、黃芩苷（批號C12378847）、甘草苷（批號C13546456）、芍藥苷（批號C11860848）和柚皮苷（批號C10609484）均購自上海麥克林生物技術有限公司；芍藥內酯苷（批號G26N11L132310）、漢黃芩苷（批號A09GB144759）和漢黃芩素（批號J15GB154492）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（LC-MS級別，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取12種對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度（芹菜素、黃芩苷和漢黃芩苷加入2 mL二甲基亞砜助溶），制成500 mg/L對照品儲備液。取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋為混合對照品工作液5（其中梔子苷和黃芩苷均為50 mg/L；綠原酸、芍藥苷和漢黃芩苷均為5 mg/L；芍藥內酯苷和黃芩素均為2 mg/L；芹菜素、甘草素、甘草苷、漢黃芩素和千層紙素A均為0.5 mg/L），再將該混合對照品工作液5分別稀釋4/3倍（工作液4）、2倍（工作液3）、4倍（工作液2）、10倍（工作液1），得到5種濃度的混合對照品工作液。配制柚皮苷對照品溶液5 mg/L作為內標工作液。

1.3 供試品溶液的制備 取十二味參芍益腦合劑原液適量，經50%甲醇溶液稀釋500倍，精密吸取450 μL，加入內標工作液（5 mg/L）50 μL，混勻，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min，上清液經0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 液相色譜條件 采用Waters UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm），以乙腈為流動相A、以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液為流動相B，線性梯度洗脫：0 min 10% A→2 min 10% A→4 min 20% A →8 min 24% A→10 min 35% A→16 min 65% A→18 min 65% A→18.01 min 10% A→20 min 10% A，流速：0.25 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣盤溫度：4 ℃，進樣量：5 μL。

1.5 質譜條件 可加熱的電噴霧離子源（HESI），負離子檢測模式，噴霧電壓：-3.5 kV，毛細管溫度：350 ℃，輔助氣加熱溫度：300 ℃，霧化氮氣壓力：350 kPa，輔助氣壓力：70 kPa，離子掃尾氣壓力：3.5 kPa，掃描方式：平行反應監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）掃描模式。12種分析物和內標的化合物信息、保留時間和質譜關鍵參數等具體情況如表1所示。

表1 十二味參芍益腦合劑中12種分析物和內標的平行反應監(jiān)測（PRM）參數

1.6 統計學方法 物質濃度和峰面積比值之間的線性回歸采用加權最小二乘法計算。應用SPSS 23.0軟件對本研究數據進行統計學分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 專屬性實驗 在所建立的測定條件下，綠原酸、梔子苷、芍藥苷、芍藥內酯苷、甘草苷、柚皮苷、黃芩苷、芹菜素、甘草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、漢黃芩苷和漢黃芩素的保留時間分別為4.71、6.03、6.52、6.90、7.89、9.31、11.67、11.77、12.06、12.99、14.08、15.60、15.95 min，各待測物和內標完全分離，峰形良好，典型色譜圖見圖1，方法的專屬性良好。

圖1 十二味參芍益腦合劑中12種混合對照品溶液、供試品溶液的平行反應監(jiān)測（PRM）色譜圖：A1為綠原酸對照品；A2為綠原酸供試品；B1為梔子苷對照品；B2為梔子苷供試品；C1為芍藥苷和芍藥內酯苷對照品；C2為芍藥苷和芍藥內酯苷供試品；D1為甘草苷對照品；D2為甘草苷供試品；E1為黃芩苷對照品；E2為黃芩苷供試品；F1為芹菜素和黃芩素對照品；F2為芹菜素和黃芩素供試品；G1為甘草素對照品；G2為甘草素供試品；H1為漢黃芩苷對照品；H2為漢黃芩苷供試品；I1為漢黃芩素和千層紙素A對照品；I2為漢黃芩素和千層紙素A供試品；J1為柚皮苷對照品；J2為供試品添加柚皮苷

2.2 標準曲線 精密量取“1.2”項下對照品線性工作液適量，50%甲醇稀釋10倍后，制成梔子苷和黃芩苷的質量濃度均分別約為0.50、1.25、2.50、3.75和5.00 mg/L，芍藥苷、漢黃芩苷和綠原酸的質量濃度均分別約為50、125、250、375和500 μg/L，芍藥內酯苷和黃芩素的質量濃度均分別約為20、50、100、150和200 μg/L，芹菜素、甘草苷、甘草素、漢黃芩素和千層紙素A的質量濃度均分別約為5、12.5、25、37.5和50 μg/L，內標柚皮苷均為500 μg/L的5種濃度的標準曲線測試溶液，分別測定。以待測物峰面積（Ax）和內標峰面積（Ai）比值R（Ax/Ai）對濃度（C）進行線性回歸（不加權）。12種主要化學成分在設定的線性濃度范圍內，峰面積比值和進樣濃度呈現良好的線性關系，標準曲線的相關系數（r）均大于0.99。

2.3 基質效應和加樣回收率試驗 取21063001、21083101、21101401、21121301、22022301和22042401共計6個批次十二味參芍益腦合劑適量，等體積混勻后，經50%甲醇稀釋500倍。取稀釋500倍的混合樣本450 μL，分別加入混合對照品線性工作液（2，3，4）和內標工作液各50 μL，制得樣本添加低（low，L）、中（medium，M）、高（high，H）濃度的加樣回收率試驗溶液，每個濃度樣品平行制備3份；取“1.2”項對照品工作液2、3、4，經50%甲醇稀釋10倍，作為對照品溶液；照“1.3”項制備混合樣本供試品溶液，測定其12種主要化學成分本底值。參照內標法以峰面積比計算12種主要化學成分的測得質量濃度，并分別計算回收率和基質效應，結果見表2。12種主要化學成分在L、M和H濃度的回收率范圍為80.58%～112.90%［相對標準差（RSD）均低于10%］，表明本法準確度良好；基質效應范圍為76.58%～110.80%（RSD均低于10%），說明本法無明顯的基質增強或抑制效應，方法可準確定量。

表2 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學成分含量測定加樣回收率試驗結果

2.4 精密度試驗 取“2.3”項下方法制備“中濃度”的加樣供試液，連續(xù)進樣6次，計算12種主要化學成分峰面積和內標峰面積比值的RSD（n=6）范圍為0.72%～4.34%，表明儀器進樣精密度良好。

2.5 重復性試驗 按照“2.3”項下方法制備“中濃度”的加樣供試液6份，分別測定，12種主要化學成分峰面積和內標峰面積比值的RSD（n=6）范圍為0.69%～4.71%，方法符合重復性要求。

2.6 進樣盤（4 ℃）穩(wěn)定性 按照“2.3”項下方法制備L、H濃度的加樣供試液，分別在0和12 h進樣測定，記錄色譜圖。計算12種主要化學成分濃度，樣本放置12 h，各物質的準確度范圍為89.7%～107.0%（RSD均低于10%），表明該處理條件下的12 h內穩(wěn)定性良好。

2.7 樣本測定結果 按照“1.3”項下方法分別配制供試品溶液，每批次取3瓶，每瓶平行配制3份，分別測定，記錄色譜圖。共檢測了16批十二味參芍益腦合劑，生產日期分別為2021年7月（21063001、21071301）、2021年8月（21081001）、2021年9月（21083101、21092301）、2021年10月（21101401）、2021年11月（21110801、21110901、21111001）、2021年12月（21121301）、2022年1月（22012101）、2022年2月（22022301）、2022年3月（22030901）、2022年4月（22042301、22042401、22042501），12種主要化學成分的測定結果見表3，黃芩苷含量均＞1 g/L，為含量最高的主要化學成分（約占總物質含量的50%），符合制劑標準的規(guī)定。

2.8 不同批次間含量差異分析 根據測定的16批次中12種主要化學成分濃度，結合多元變量統計分析，建立模型，考察各批次之間的物質差異。采用Metaboanalyst軟件進行數據的歸一化、對數轉化和中心化，建立主成分分析（principal component analysis，PCA）模型，結果見圖2A，同一批次樣本聚在一起，表明同一批次樣本之間差異小；在分析批次之間差異時，除批次1、2和4外，余下各批次幾乎聚集在一起，表明制劑工藝整體相對穩(wěn)定。將批次1、2和4定義為一組（第1組），余下各批次為另一組（第2組），建立偏最小二乘法判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）模型，見圖2B，得到變量投影重要性值（variable importance in theprojection，VIP值）。結合t檢驗計算得到P值，篩選出評價質量差異的標志物［16-17］，差異有統計學意義的物質見表4。結合P值和變異倍數（fold change，FC）值分析發(fā)現梔子苷和芍藥內酯苷是導致批次1、2、4樣本差異大的主要成分。其中梔子苷的VIP值最大（1.565）、P=0.005、FC=1.172，其含量僅次于黃芩苷（約占總物質含量的20%），梔子苷的含量測定，可作為進一步控制制劑質量的指標。

圖2 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學成分含量的多元變量統計分析圖：A為16批次樣本的主成分分析（PCA）得分圖；B為PLS-DA分析得分圖

表4 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學成分差異物質分析

3 討論

本研究定量的3對同分異構體（芹菜素-黃芩素、漢黃芩素-千層紙素A和芍藥苷-芍藥內酯苷），各自質譜檢測參數相同，良好的色譜分離是保證3對同分異構體準確定量的必要前提；還需要兼顧單個樣本的分析時間，以增加檢測的通量。Waters HSS T3色譜柱是極性改良柱，可增大極性物質的色譜保留，研究采用Waters HSS T3色譜柱（100 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），優(yōu)化色譜梯度，保證測定的3對同分異構體達到基本色譜分離的前提下，在20 min內即可完成十二味參芍益腦合劑中12種主要化學成分的同步定量。研究優(yōu)化了各測定物的碰撞能，選擇特征的二級碎片進行定量，保證定量的準確度和專屬性［18-19］。

待測物在十二味參芍益腦合劑中濃度差別大，黃芩苷濃度最高，達1 g/L，甘草素和黃芩素濃度較低，在1～10 mg/L范圍。因此合適的樣本前處理方法，不僅可以避免高濃度測定物污染儀器和待測物響應飽和，還能將濃度低的物質準確檢測。研究比較了樣本經稀釋50、100、500和1 000倍，發(fā)現稀釋500倍最佳。研究還對稀釋的溶劑組成進行優(yōu)化，對比了20%甲醇、50%甲醇和70%甲醇3種體系。樣本經20%甲醇稀釋后，12 h內黃芩苷不穩(wěn)定，50%甲醇和70%甲醇各待測物12 h內穩(wěn)定性良好。結合流動相和溶液匹配的原則，最終選擇稀釋液為50%甲醇。定量方法采用內標法，可有效校正樣本前處理和儀器的進樣誤差。取樣前應將制劑充分搖勻，同時還要保證取樣量，確保取樣具有代表性。

綜上所述，本研究建立了十二味參芍益腦合劑中綠原酸、梔子苷、芍藥苷、芍藥內酯苷、甘草苷、黃芩苷、芹菜素、甘草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A的LC-MS測定法，測定16批次制劑中12種主要化學成分的含量，方法的分析效率高、專屬性好、重復性好，同時發(fā)現梔子苷可以作為進一步評價制劑質量標準的成分，該研究為十二味參芍益腦合劑的質量控制提供科學的實驗依據。