陳剛，汪生，宮鵬

中風(fēng)是一種常見的老年性疾病，具有高發(fā)病率、高致死率、高致殘率等特點［1-2］。復(fù)方中藥制劑在中醫(yī)整體觀和辨證論的指導(dǎo)下，多成分協(xié)同、多向調(diào)節(jié)，具有不良反應(yīng)小、治療費用低、安全性能好等優(yōu)點，在疾病治療領(lǐng)域發(fā)揮越來越重要的作用［3-5］。十二味參芍益腦合劑由當(dāng)歸、生地黃、炒白芍、川芎、黃芩、梔子、玄參、菊花、牡丹皮、車前子、龍骨和甘草12味中藥材組成，是太和縣中醫(yī)院多年應(yīng)用經(jīng)驗方。該藥適合于肝陽上亢型的中風(fēng)及各類型的偏頭痛，臨床療效確切。

前期十二味參芍益腦合劑主要化學(xué)成分分析研究工作中，共鑒定出綠原酸、梔子苷、黃芩苷、甘草苷、芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷等27個化學(xué)成分。在現(xiàn)有的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，含量測定僅考察黃芩苷含量，而制劑中其他主要化學(xué)成分的含量及相關(guān)質(zhì)量控制指標(biāo)不夠全面。近代藥理學(xué)研究表明：黃酮類化合物具有抗氧化、抗炎、抗凋亡、改善血腦屏障通透性和神經(jīng)保護作用［6-9］；芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷，具有抗炎、鎮(zhèn)痛和抗氧化的作用［10-12］；梔子苷也可通過抗炎、抑制細(xì)胞凋亡等過程協(xié)同治療腦缺血等疾?。?3-15］。2021年3月至2022年5月，本研究依據(jù)前期十二味參芍益腦合劑成分解析及主要化學(xué)成分的藥理作用確定12種主要化學(xué)成分檢測指標(biāo)，建立超高效液相色譜-靜電場軌道阱質(zhì)譜（ultra-performance liquid chromatography tandem hybrid orbitrap mass spectrometry， UPLC-Q-Orbitrap-MS）測定法，為后期的十二味參芍益腦合劑質(zhì)量控制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 儀器 Thermo Q-Exactive plus四極桿-靜電場軌道阱質(zhì)譜儀（配有在線真空脫氣機、四元泵、自動進樣器、柱溫箱和Xcalibur工作站，美國Thermo Fisher公司）；Dionex Ultimate 3000超高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；Waters UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm，美國Waters公司）；XPE205型電子分析天平（德國Sartorius）；5424R臺式高速冷凍離心機（美國Eppendorf公司）；Milli-Q Integral 5超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）。

1.1.2 試藥與試劑 十二味參芍益腦合劑（批號21063001、21071301、21081001、21083101、21092301、21101401、21110801、21110901、21111001、21121301、22012101、22022301、22030901、22042301、22042401、22042501）共16批，由太和縣中醫(yī)院提供。對照品：芹菜素（批號C10690542）、黃芩素（批號C12773748）、甘草素（批號C10828731）、千層紙素A（批號C12223962）、綠原酸（批號C11860894）、梔子苷（批號C12714185）、黃芩苷（批號C12378847）、甘草苷（批號C13546456）、芍藥苷（批號C11860848）和柚皮苷（批號C10609484）均購自上海麥克林生物技術(shù)有限公司；芍藥內(nèi)酯苷（批號G26N11L132310）、漢黃芩苷（批號A09GB144759）和漢黃芩素（批號J15GB154492）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙腈、甲醇（LC-MS級別，美國Thermo Fisher公司）。

1.2 對照品溶液的制備 分別精密稱取12種對照品適量，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度（芹菜素、黃芩苷和漢黃芩苷加入2 mL二甲基亞砜助溶），制成500 mg/L對照品儲備液。取對照品儲備液適量，用甲醇稀釋為混合對照品工作液5（其中梔子苷和黃芩苷均為50 mg/L；綠原酸、芍藥苷和漢黃芩苷均為5 mg/L；芍藥內(nèi)酯苷和黃芩素均為2 mg/L；芹菜素、甘草素、甘草苷、漢黃芩素和千層紙素A均為0.5 mg/L），再將該混合對照品工作液5分別稀釋4/3倍（工作液4）、2倍（工作液3）、4倍（工作液2）、10倍（工作液1），得到5種濃度的混合對照品工作液。配制柚皮苷對照品溶液5 mg/L作為內(nèi)標(biāo)工作液。

1.3 供試品溶液的制備 取十二味參芍益腦合劑原液適量，經(jīng)50%甲醇溶液稀釋500倍，精密吸取450 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作液（5 mg/L）50 μL，混勻，4 ℃條件下14 000 r/min離心20 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

1.4 液相色譜條件 采用Waters UPLC HSS T3色譜柱（100 mm × 2.1 mm， 1.8 μm），以乙腈為流動相A、以含0.1%甲酸的10 mmol/L甲酸銨溶液為流動相B，線性梯度洗脫：0 min 10% A→2 min 10% A→4 min 20% A →8 min 24% A→10 min 35% A→16 min 65% A→18 min 65% A→18.01 min 10% A→20 min 10% A，流速：0.25 mL/min，柱溫：35 ℃，進樣盤溫度：4 ℃，進樣量：5 μL。

1.5 質(zhì)譜條件 可加熱的電噴霧離子源（HESI），負(fù)離子檢測模式，噴霧電壓：-3.5 kV，毛細(xì)管溫度：350 ℃，輔助氣加熱溫度：300 ℃，霧化氮氣壓力：350 kPa，輔助氣壓力：70 kPa，離子掃尾氣壓力：3.5 kPa，掃描方式：平行反應(yīng)監(jiān)測（parallel reaction monitoring，PRM）掃描模式。12種分析物和內(nèi)標(biāo)的化合物信息、保留時間和質(zhì)譜關(guān)鍵參數(shù)等具體情況如表1所示。

表1 十二味參芍益腦合劑中12種分析物和內(nèi)標(biāo)的平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）參數(shù)

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 物質(zhì)濃度和峰面積比值之間的線性回歸采用加權(quán)最小二乘法計算。應(yīng)用SPSS 23.0軟件對本研究數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學(xué)分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，以P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 專屬性實驗 在所建立的測定條件下，綠原酸、梔子苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、柚皮苷、黃芩苷、芹菜素、甘草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素A、漢黃芩苷和漢黃芩素的保留時間分別為4.71、6.03、6.52、6.90、7.89、9.31、11.67、11.77、12.06、12.99、14.08、15.60、15.95 min，各待測物和內(nèi)標(biāo)完全分離，峰形良好，典型色譜圖見圖1，方法的專屬性良好。

圖1 十二味參芍益腦合劑中12種混合對照品溶液、供試品溶液的平行反應(yīng)監(jiān)測（PRM）色譜圖：A1為綠原酸對照品；A2為綠原酸供試品；B1為梔子苷對照品；B2為梔子苷供試品；C1為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對照品；C2為芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷供試品；D1為甘草苷對照品；D2為甘草苷供試品；E1為黃芩苷對照品；E2為黃芩苷供試品；F1為芹菜素和黃芩素對照品；F2為芹菜素和黃芩素供試品；G1為甘草素對照品；G2為甘草素供試品；H1為漢黃芩苷對照品；H2為漢黃芩苷供試品；I1為漢黃芩素和千層紙素A對照品；I2為漢黃芩素和千層紙素A供試品；J1為柚皮苷對照品；J2為供試品添加柚皮苷

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線 精密量取“1.2”項下對照品線性工作液適量，50%甲醇稀釋10倍后，制成梔子苷和黃芩苷的質(zhì)量濃度均分別約為0.50、1.25、2.50、3.75和5.00 mg/L，芍藥苷、漢黃芩苷和綠原酸的質(zhì)量濃度均分別約為50、125、250、375和500 μg/L，芍藥內(nèi)酯苷和黃芩素的質(zhì)量濃度均分別約為20、50、100、150和200 μg/L，芹菜素、甘草苷、甘草素、漢黃芩素和千層紙素A的質(zhì)量濃度均分別約為5、12.5、25、37.5和50 μg/L，內(nèi)標(biāo)柚皮苷均為500 μg/L的5種濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線測試溶液，分別測定。以待測物峰面積（Ax）和內(nèi)標(biāo)峰面積（Ai）比值R（Ax/Ai）對濃度（C）進行線性回歸（不加權(quán)）。12種主要化學(xué)成分在設(shè)定的線性濃度范圍內(nèi)，峰面積比值和進樣濃度呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）均大于0.99。

2.3 基質(zhì)效應(yīng)和加樣回收率試驗 取21063001、21083101、21101401、21121301、22022301和22042401共計6個批次十二味參芍益腦合劑適量，等體積混勻后，經(jīng)50%甲醇稀釋500倍。取稀釋500倍的混合樣本450 μL，分別加入混合對照品線性工作液（2，3，4）和內(nèi)標(biāo)工作液各50 μL，制得樣本添加低（low，L）、中（medium，M）、高（high，H）濃度的加樣回收率試驗溶液，每個濃度樣品平行制備3份；取“1.2”項對照品工作液2、3、4，經(jīng)50%甲醇稀釋10倍，作為對照品溶液；照“1.3”項制備混合樣本供試品溶液，測定其12種主要化學(xué)成分本底值。參照內(nèi)標(biāo)法以峰面積比計算12種主要化學(xué)成分的測得質(zhì)量濃度，并分別計算回收率和基質(zhì)效應(yīng)，結(jié)果見表2。12種主要化學(xué)成分在L、M和H濃度的回收率范圍為80.58%～112.90%［相對標(biāo)準(zhǔn)差（RSD）均低于10%］，表明本法準(zhǔn)確度良好；基質(zhì)效應(yīng)范圍為76.58%～110.80%（RSD均低于10%），說明本法無明顯的基質(zhì)增強或抑制效應(yīng)，方法可準(zhǔn)確定量。

表2 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學(xué)成分含量測定加樣回收率試驗結(jié)果

2.4 精密度試驗 取“2.3”項下方法制備“中濃度”的加樣供試液，連續(xù)進樣6次，計算12種主要化學(xué)成分峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD（n=6）范圍為0.72%～4.34%，表明儀器進樣精密度良好。

2.5 重復(fù)性試驗 按照“2.3”項下方法制備“中濃度”的加樣供試液6份，分別測定，12種主要化學(xué)成分峰面積和內(nèi)標(biāo)峰面積比值的RSD（n=6）范圍為0.69%～4.71%，方法符合重復(fù)性要求。

2.6 進樣盤（4 ℃）穩(wěn)定性 按照“2.3”項下方法制備L、H濃度的加樣供試液，分別在0和12 h進樣測定，記錄色譜圖。計算12種主要化學(xué)成分濃度，樣本放置12 h，各物質(zhì)的準(zhǔn)確度范圍為89.7%～107.0%（RSD均低于10%），表明該處理條件下的12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7 樣本測定結(jié)果 按照“1.3”項下方法分別配制供試品溶液，每批次取3瓶，每瓶平行配制3份，分別測定，記錄色譜圖。共檢測了16批十二味參芍益腦合劑，生產(chǎn)日期分別為2021年7月（21063001、21071301）、2021年8月（21081001）、2021年9月（21083101、21092301）、2021年10月（21101401）、2021年11月（21110801、21110901、21111001）、2021年12月（21121301）、2022年1月（22012101）、2022年2月（22022301）、2022年3月（22030901）、2022年4月（22042301、22042401、22042501），12種主要化學(xué)成分的測定結(jié)果見表3，黃芩苷含量均＞1 g/L，為含量最高的主要化學(xué)成分（約占總物質(zhì)含量的50%），符合制劑標(biāo)準(zhǔn)的規(guī)定。

2.8 不同批次間含量差異分析 根據(jù)測定的16批次中12種主要化學(xué)成分濃度，結(jié)合多元變量統(tǒng)計分析，建立模型，考察各批次之間的物質(zhì)差異。采用Metaboanalyst軟件進行數(shù)據(jù)的歸一化、對數(shù)轉(zhuǎn)化和中心化，建立主成分分析（principal component analysis，PCA）模型，結(jié)果見圖2A，同一批次樣本聚在一起，表明同一批次樣本之間差異??；在分析批次之間差異時，除批次1、2和4外，余下各批次幾乎聚集在一起，表明制劑工藝整體相對穩(wěn)定。將批次1、2和4定義為一組（第1組），余下各批次為另一組（第2組），建立偏最小二乘法判別分析（partial least square discriminant analysis，PLS-DA）模型，見圖2B，得到變量投影重要性值（variable importance in theprojection，VIP值）。結(jié)合t檢驗計算得到P值，篩選出評價質(zhì)量差異的標(biāo)志物［16-17］，差異有統(tǒng)計學(xué)意義的物質(zhì)見表4。結(jié)合P值和變異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C）值分析發(fā)現(xiàn)梔子苷和芍藥內(nèi)酯苷是導(dǎo)致批次1、2、4樣本差異大的主要成分。其中梔子苷的VIP值最大（1.565）、P=0.005、FC=1.172，其含量僅次于黃芩苷（約占總物質(zhì)含量的20%），梔子苷的含量測定，可作為進一步控制制劑質(zhì)量的指標(biāo)。

圖2 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學(xué)成分含量的多元變量統(tǒng)計分析圖：A為16批次樣本的主成分分析（PCA）得分圖；B為PLS-DA分析得分圖

表4 十二味參芍益腦合劑中12種主要化學(xué)成分差異物質(zhì)分析

3 討論

本研究定量的3對同分異構(gòu)體（芹菜素-黃芩素、漢黃芩素-千層紙素A和芍藥苷-芍藥內(nèi)酯苷），各自質(zhì)譜檢測參數(shù)相同，良好的色譜分離是保證3對同分異構(gòu)體準(zhǔn)確定量的必要前提；還需要兼顧單個樣本的分析時間，以增加檢測的通量。Waters HSS T3色譜柱是極性改良柱，可增大極性物質(zhì)的色譜保留，研究采用Waters HSS T3色譜柱（100 mm ×2.1 mm， 1.8 μm），優(yōu)化色譜梯度，保證測定的3對同分異構(gòu)體達(dá)到基本色譜分離的前提下，在20 min內(nèi)即可完成十二味參芍益腦合劑中12種主要化學(xué)成分的同步定量。研究優(yōu)化了各測定物的碰撞能，選擇特征的二級碎片進行定量，保證定量的準(zhǔn)確度和專屬性［18-19］。

待測物在十二味參芍益腦合劑中濃度差別大，黃芩苷濃度最高，達(dá)1 g/L，甘草素和黃芩素濃度較低，在1～10 mg/L范圍。因此合適的樣本前處理方法，不僅可以避免高濃度測定物污染儀器和待測物響應(yīng)飽和，還能將濃度低的物質(zhì)準(zhǔn)確檢測。研究比較了樣本經(jīng)稀釋50、100、500和1 000倍，發(fā)現(xiàn)稀釋500倍最佳。研究還對稀釋的溶劑組成進行優(yōu)化，對比了20%甲醇、50%甲醇和70%甲醇3種體系。樣本經(jīng)20%甲醇稀釋后，12 h內(nèi)黃芩苷不穩(wěn)定，50%甲醇和70%甲醇各待測物12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。結(jié)合流動相和溶液匹配的原則，最終選擇稀釋液為50%甲醇。定量方法采用內(nèi)標(biāo)法，可有效校正樣本前處理和儀器的進樣誤差。取樣前應(yīng)將制劑充分搖勻，同時還要保證取樣量，確保取樣具有代表性。

綜上所述，本研究建立了十二味參芍益腦合劑中綠原酸、梔子苷、芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷、甘草苷、黃芩苷、芹菜素、甘草素、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素和千層紙素A的LC-MS測定法，測定16批次制劑中12種主要化學(xué)成分的含量，方法的分析效率高、專屬性好、重復(fù)性好，同時發(fā)現(xiàn)梔子苷可以作為進一步評價制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的成分，該研究為十二味參芍益腦合劑的質(zhì)量控制提供科學(xué)的實驗依據(jù)。