崔露露 池雨鋒 張銳利 馬繼永 高德民

【摘 要】 目的：建立廣西產(chǎn)不同品種石韋藥材的HPLC指紋圖譜，對其進行分析和質量評價，同時測定石韋中綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁的含量。方法：采用HPLC測定廣西產(chǎn)6批不同品種石韋藥材的含量， 分別運用SPSS 19.0軟件和中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004 A版對廣西產(chǎn)6批不同品種石韋藥材的14個共有峰進行聚類分析（HCA）、主成分分析（PCA）和相似度分析。結果：廣西產(chǎn)不同品種石韋中綠原酸含量最高，其次為蘆丁、芒果苷和山奈素。其中，有柄石韋中綠原酸最高，石韋中芒果苷最高，而在柔軟石韋中蘆丁及山奈素含量較高。對其指紋圖譜進行比較，聚類分析中除絨毛石韋外，其它石韋可為一類；主成分分析中越石韋、廬山石韋、有柄石韋和柔軟石韋為一類；在相似度分析中，對比藥典項下石韋，可見中越石韋與廬山石韋、有柄石韋較接近。結論：廣西產(chǎn)不同品種石韋中綠原酸，芒果苷，山奈素，蘆丁含量存在差異。此外，相似度分析，主成分分析和聚類分析結果為鑒別石韋藥材提供依據(jù)，為石韋藥材質量標準的完善和臨床用藥提供參考。

【關鍵詞】 石韋；高效液相色譜法；相似度分析；聚類分析；主成分分析

【中圖分類號】R284.1 【文獻標志碼】 A 【文章編號】1007-8517（2023）15-0050-07

DOI：10.3969/j.issn.1007-8517.2023.13.zgmzmjyyzz202315012

Abstract：Objective The HPLC Fingerprints were built to analyze and evaluate the different Pyrrosia from Guangxi province. Simultaneously， the contents of chlorogenic acid， mangiferin， kaempferol and rutin were determined.Methods 14 peaks of the common model were collected and used by establishing HPLC fingerprint from Guangxi Pyrrosia species The data were applied to professional software named SPSS 19.0 statistical analysis software for hierarchical cluster analysis （HCA） and principal component analysis （PCA） and Similarity Evaluation System for chromatographic fingerprint of TCMs （Version 2004 A） recommended by the SFDA of China for evaluating similarities.Results The content of four ingredients were determined， which it were chlorogenic acid> rutin > mangiferin> kaempferol. Among them， chlorogenic acid and mangiferin were the highest in P. petiolosa and P. lingua respectively， while the contents of rutin and kaempferol were higher in P. mollis. To compare their fingerprints， except for P. subfurfuracea， the others can be classified as one class by HCA. The PCA method showed that it was categorized into one group： P. tonkinensis，P. sheareri，P. petiolosa and P. mollis. And the similarity values， P. tonkinensis，P. sheareri， and P. petiolosa， were very close by comparing the pharmacopeia. Conclusions The content of main ingredients （chlorogenic acid， mangiferin， kaempferol and rutin） was difference from different species Pyrrosia. Besides，it provides a basis for identifying and evaluating the quality of Pyrrosia by the similarity analysis，PCA and HCA， and offers a reference for the quality standards and clinical application of Pyrrosia.

Keywords：Pyrrosia; HPLC; Similarity Analysis; HCA; PCA

石韋為水龍骨科（Polypodiaceae）石韋屬（Pyrrosia）的多種植物的干燥葉，主要分布于華北、西北及湖南等地區(qū)。2020年版《中華人民共和國藥典》將同屬植物石韋［Pyrrosia lingua（Thunb.） Fat-well］、有柄石韋［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］和廬山石韋［Pyrrosia sheareri（Bak.） Ching］的干燥葉作為石韋藥材來源。石韋具有利尿通淋、清肺止咳、涼血止血的功效，臨床用于治療熱淋、血淋、石淋、肺熱喘咳、吐血、衄血等癥?，F(xiàn)代研究［1］表明石韋含有黃酮、酚酸及皂苷類成分，如綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁、咖啡酸、胡蘿卜苷等。綠原酸具有抗菌解毒、消炎利膽和抗脂質過氧化等作用［2-4］；芒果苷具有良好的抗炎、抗病毒和保肝等作用［5-7］；山奈素具有抗癌、抗感染及抗炎作用［8-10］；蘆丁具有抗自由基、抗病毒及抗腫瘤等作用［11-13］。

石韋作為藥材應用，首載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，此后歷代本草著作多有記載。目前有部分地區(qū)以非藥典品種入藥，尤其是在廣西省，柔軟石韋［Pyrrosia mollis（Kunze）Ching］常見于藥材市場［14］。本研究在廣西藥材市場收集了多份廣西產(chǎn)石韋藥材樣本，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學徐凌川教授鑒定，除藥典品種外，還有中越石韋［Pyrrosia tonkinensis（Gies.） Ching］、有柄石韋［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］（A005）及柔軟石韋［Pyrrosia mollis （Kunze） Ching］。為比較廣西產(chǎn)不同品種石韋之間的差異，本次實驗采用高效液相法建立石韋的指紋圖譜，并測定石韋中綠原酸、芒果苷、山奈素及蘆丁的含量，同時進行相似度分析，主成分分析和聚類分析［15-19］，用以比較廣西產(chǎn)不同品種石韋的質量差異。為石韋質量控制和臨床用藥提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 安捷倫高效液相色譜儀（型號1100，DAD 檢測器）；分析天平（上海菁海儀器有限公司）；KQ-100DE超聲波清洗器（醫(yī)用超聲波清洗器）；SHZ-DⅢ真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.2 試藥 中國食品藥品檢定研究院綠原酸標準品（批號：110753-202018）；山奈素標準品（批號：110861-202013）；蘆丁對照品（批號：100080-201811）；芒果苷對照品（批號：111607-201704）。乙腈為色譜純，磷酸、甲醇為分析純，水為娃哈哈純凈水。

1.3 藥材 購買的藥材樣品，產(chǎn)地為廣西省，經(jīng)山東中醫(yī)藥大學徐凌川教授鑒定，分別為石韋［Pyrrosia lingua（Thunb.） Fat-well］（A001廣西桂林）、絨毛石韋［Pyrrosia subfurfuracea（Hook.） Ching］（A002廣西玉林）、中越石韋［Pyrrosia tonkinensis（Gies.） Ching］（A003廣西河池）、廬山石韋［Pyrrosia sheareri（Bak.） Ching］（A004廣西玉林）、有柄石韋［Pyrrosia petiolosa（Christ） Ching］（A005廣西河池）及柔軟石韋［Pyrrosia mollis（Kunze） Ching］（A006廣西茂名）。

2 方法和結果

2.1 色譜條件 采用Agilent 5 HC-C18（2）（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；進樣量20 μL，流動相為乙腈（A）-0.2%磷酸溶液（B）梯度洗脫，流速1.0 mL/min，柱溫25 ℃，洗脫程序（0～15 min，10% A；15～35 min，10%～15% A；35～60 min，15%～23% A；60～70 min，23% A），檢測波長300 nm。

2.2 對照液的制備 分別精密稱取綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁對照品25.00 mg、1.00 mg、0.75 mg、2.00 mg，置于4個10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，作為對照品儲備液。然后分別精密吸取上述4種儲備液各2 mL置于同一10 mL容量瓶中，用50%甲醇定容至刻度，作為混合對照品溶液（每1 mL混合對照品溶液含綠原酸500.0 μg、芒果苷20.0 μg、山奈素15.0 μg、蘆丁 40.0 μg）。

2.3 供試液的制備 取藥材粉末1.0 g，精密稱定，置50 mL碘量瓶中，移取50%甲醇15 mL加入，蓋塞稱重，超聲提取40 min，冷至室溫后，再次稱重，用50%甲醇補足失重，搖勻，過濾得提取液，二次提取用50%甲醇15 mL，重復上述操作，提取20 min，合并兩次提取液，過 0.45 μm 微孔濾膜，即得供試液。

2.4 線性關系考察 分別精密吸取“2.2”項下的混合對照品溶液0.2 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL置于2 mL容量瓶中，用50%甲醇稀釋至刻度，測定線性關系，以濃度X（μg/mL）為橫坐標，峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線。見表1。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度考察 取2.3項下的供試品，連續(xù)進樣6次，以3號特征峰為基準，計算色譜圖各特征峰的相對保留時間（RRT）和相對峰面積（RPA）的RSD，分別為0.33%～4.92%和0.69%～4.75%，表明該儀器的精密度良好。結果見表2。

2.5.2 穩(wěn)定性考察 取有柄石韋（A005）藥材，按前述方法制備供試品溶液，分別于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h進樣，計算各特征峰RRT和RPA的RSD，結果均小于5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。結果見表2。

2.5.3 重復性考察 取石韋（A001）樣品6份，按前述方法制備6份供試液進行測定，得到4種成分含量，計算其RSD值，四種成分RSD值均在5%以內(nèi)，表明本方法的重復性好。結果見表3。

2.5.4 加樣回收率考察 精密稱定已知含量的石韋（A001）藥材，取與藥材含量接近的對照品儲備液，加入藥材中，按前述方法制備供試品溶液，進行測定，測得加樣回收率均在95%～105%之間。結果見表4。

2.6 石韋指紋圖譜的建立 本實驗選取6種石韋樣品，按前述方法制備供試液進行測定。依據(jù)各峰的RRT和RPA挑選14個特征峰，如圖1所示，由于品種不同，僅對藥典項下石韋（A001）、廬山石韋（A004）、有柄石韋（A005）三種樣品建立共有模式指紋圖譜，如圖2所示，經(jīng)與對照指紋圖譜（如圖3所示）對照，確定峰5為綠原酸，峰8為芒果苷，峰11為山奈素，峰12為蘆丁。

2.6.1 樣品含量測定 分別取6種石韋樣品，依據(jù)前述方法制備供試液進行測定，用外標法計算4種成分的含量。結果見表5。

如表5顯示，所有的樣品中綠原酸含量較高，其次為蘆丁、芒果苷和山奈酚；其中有柄石韋綠原酸含量最高，中越石韋與有柄石韋不含山奈素（或含量極低）；石韋中芒果苷含量最高，絨毛石韋居其次；而在柔軟石韋中蘆丁及山奈素含量較高。

2.6.2 聚類分析 聚類分析可根據(jù)物質所含化學成分用數(shù)據(jù)統(tǒng)計軟件對其進行分類或描述，并將一些觀察對象依據(jù)某些特征加以歸類，是研究事物分類的有效方法［20-21］?？梢罁?jù)所測樣品的數(shù)據(jù)，對樣品進行分類。本實驗以同一產(chǎn)地不同品種的6種石韋為研究對象，進行指紋圖譜研究，獲得包括綠原酸、芒果苷、山奈素、蘆丁在內(nèi)的14個峰。系統(tǒng)聚類分析利用SPSS 19.0分析軟件，使用歐氏平方距離作為樣品的測度［22］，6種石韋樣品基本可以分為2大類（如圖4所示），石韋（A001）、 中越石韋（A003）、廬山石韋（A004）、有柄石韋（A005）和柔軟石韋（A006）為第1類，絨毛石韋（A002）為第2類。

2.6.3 主成分分析 主成分分析是利用降低空間維度，對樣品成分進行分類和分析的方法［23］。以6批樣品中共有峰的14個峰面積為數(shù)據(jù)，利用SPSS 19.0進行主成分分析，以著重分析同一產(chǎn)地不同品種樣品6批石韋樣品之間成分的差異（如圖5所示）。由結果可以看出，中越石韋（A003）、廬山石韋（A004）、有柄石韋（A005）和柔軟石韋（A006）分布較為接近，基本為一類。石韋（A001）和絨毛石韋（A002）與其它石韋樣品距離較遠，成分差異性較大，可歸為一類。

2.6.4 相似度評價 相似度評價系統(tǒng)可以對藥材進行更全面的化學成分的分析和評價。本次實驗 將6批藥材樣品的液相指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”進行相似度評價，根據(jù)多點校正法對樣品色譜峰進行自動匹配，然后設定標準模板（圖2）［24］，利用相關系數(shù)法對不同品種譜峰差異性和整體相似性進行評價，得各石韋相似度評價結果。石韋（A001）：0.5982；絨毛石韋（A002）：0.1844；中越石韋（A003）：0.6541；廬山石韋（A004）：0.7926；有柄石韋（A005）：0.9322；柔軟石韋（A006）：0.4973。從分析結果可以看出，藥典項下3種石韋由于品種的差異，其相似度值也存在差異；而除藥典項下外，只有A003中越石韋相似度較高，與廬山石韋、有柄石韋較接近；其它3種石韋相似度均較低。這更符合聚類分析的結果， 將A003、A004和A005分為一組，同時此結果也符合主成分分析。

3 分析與討論

化學指紋圖譜強調的是色譜的完整性，通過指標性成分的定量分析，可以在一定程度上反映中藥的質量。實驗建立的石韋指紋圖譜有良好穩(wěn)定性及重現(xiàn)性，3種評價方法相輔相成，從不同方面對石韋的化學成分進行分析。有柄石韋中綠原酸含量遠高于其它品種，石韋中的芒果苷含量較其它品種高，而柔軟石韋中的蘆丁和山奈素的含量均高于其它石韋，可以考慮依據(jù)成分的不同對其進行利用，擴大石韋的臨床藥用價值。

綜上所述，來源于廣西省不同地市的不同種石韋，化學成分有較大的差異，對于藥典項下的三種石韋而言，有效成分綠原酸含量差異也較大，相似度也存在很大差異，而中越石韋與藥典項下有柄石韋、廬山石韋比較接近，由聚類分析和主成分分析可以看出有柄石韋、廬山石韋和中越石韋較為接近。本次實驗研究的藥材批次較少，缺乏統(tǒng)計學意義，但是，也在一定程度上反映了不同品種石韋之間的差距。因此，以上分析結果可以為石韋藥材的鑒定及質量評價提供依據(jù)，亦可依據(jù)其化學成分含量的差異對不同品種的石韋進行利用，從而擴大石韋的使用范圍。

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（收稿日期：2022-11-30 編輯：陶希睿）

基金項目：2021年度山東省中醫(yī)藥科技項目（編號2021Q116）。

作者簡介：崔露露（1989—）女，漢族，碩士，藥品技術工程師，研究方向為中藥及中成藥質量控制。E-mail：cll5052@163.com

通信作者：高德民（1973—）男，漢族，博士，副教授，研究方向為中藥資源研究與中藥質量控制。E-mail： gdm607@126.com