李翱翔，張加研，趙一鶴

(1.西南林業(yè)大學(xué) 材料與化學(xué)工程學(xué)院，云南 昆明 650224；2.云南省林業(yè)和草原科學(xué)院，云南 昆明 650201)

云南擁有豐富的竹資源，包括28個(gè)屬，280余種[1]，其中牡竹屬(DendrocalamusNees)、方竹屬(ChimonobambusaMakino)、香竹屬(ChimonocalamusHsueh et Yi)等竹類植物具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，以牡竹屬竹種最具云南熱帶竹子的特色。相比于竹子的其他部分利用，竹葉幾乎被視為廢棄物，每年有超過80%的竹葉都會(huì)腐爛在竹林中。為了實(shí)現(xiàn)竹葉的高價(jià)值利用，近20年來科技人員對(duì)提取竹葉黃酮等有價(jià)值的活性成分越來越感興趣，并將其應(yīng)用于新產(chǎn)品的開發(fā)，以拓展竹資源產(chǎn)業(yè)鏈[2-3]。本研究從以上3個(gè)竹屬中選取具有代表性的4種竹種進(jìn)行研究，分別是勃氏甜龍竹(Dendrocalamusbrandisii)、龍竹(D.giganteus)、大葉慈竹(D.farinosus)、刺竹子(Chimonobambusapachystachys)和流蘇香竹(Chimonocalamusfimbriatus)。

竹葉提取物中含有黃酮類化合物、多糖、礦物質(zhì)以及其他多種成分，并且已經(jīng)被用于治療多種疾病[4]。竹葉中的黃酮類化合物包括黃酮類、內(nèi)酯類和酚酸類化合物。其中黃酮類化合物以黃酮C苷為主要活性物質(zhì)[5]。研究表明，竹葉黃酮具有抗氧化、清除亞硝化物、阻斷亞硝化反應(yīng)、消除潰瘍和抑制腫瘤活性，以及降低動(dòng)脈粥樣硬化、老年癡呆癥、帕金森綜合征和高血脂高血糖的風(fēng)險(xiǎn)[6-8]。竹葉中提取的黃酮類化合物在食品、飲料、藥品、化妝品等方面有廣泛的應(yīng)用。

人體內(nèi)會(huì)產(chǎn)生大量的自由基，組織內(nèi)的能量傳遞以及體內(nèi)毒素的排出都需要適量的自由基參與，但是當(dāng)產(chǎn)生過多的自由基且無法被身體清除掉時(shí)，過量的自由基將對(duì)人體造成細(xì)胞衰老、誘發(fā)細(xì)胞癌變、引起動(dòng)脈粥樣硬化、引起炎癥反應(yīng)等嚴(yán)重傷害[9]。根據(jù)各種研究報(bào)道，竹葉黃酮具有良好的抗氧化活性[10-12]，目前尚缺乏關(guān)于滇產(chǎn)不同竹種竹葉黃酮含量的比較分析，尤其是不同竹種竹葉提取物的體外抗氧化活性能力的研究報(bào)道。因此，本研究以滇產(chǎn)5種經(jīng)濟(jì)竹種竹葉為試驗(yàn)材料，分析不同竹種竹葉黃酮的總含量和主要黃酮碳苷的種類及含量，重點(diǎn)在于比較不同竹葉提取物的體外抗氧化效果，篩選出抗氧化能力較強(qiáng)的竹種竹葉提取物，為進(jìn)一步開發(fā)抗氧化和抗衰老的產(chǎn)品提供理論和科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

(1)實(shí)驗(yàn)材料 勃氏甜龍竹和龍竹竹葉于2022年10月采摘自云南省普洱市景谷縣(23.497 0°N、100.702 8°E，海拔1 866 m)，大葉慈竹、箣竹子及流蘇香竹的竹葉均采自云南省林業(yè)和草原科學(xué)院昆明樹木園(25.0845°N、102.4442°E，海拔1 891 m)。采摘期連續(xù)降雨，采摘區(qū)域立地條件溫度適宜，水分充足，采光較好，選擇母竹稈齡在兩年以上竹子樹冠部分的新鮮竹葉，去除葉柄和葉鞘部分，清洗，去除竹葉表面蟲卵等雜質(zhì)，葉表霉菌以及真菌清除干凈；置于干燥通風(fēng)處風(fēng)干至含水量低于12.0%，將其粉碎后過60目篩網(wǎng)，用PE保鮮袋分別裝好，放入干燥皿中備用。

(2)試劑 蘆丁(≥98.0%)、葒草苷(≥98.0%)、異葒草苷(≥98.0%)、牡荊苷(≥98.0%)、異牡荊苷(≥98.0%)標(biāo)準(zhǔn)品購自詩丹德標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)服務(wù)有限公司(中國上海)，氫氧化鈉、乙醇、乙酸、磷酸、甲醇、乙腈、氯仿、亞硝酸鈉、硝酸鋁和聚酯酰胺樹脂(60～80目)(均為分析純，其中磷酸、甲醇和乙腈為色譜純)購自致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司(中國天津)。DPPH自由基清除率、羥基自由基清除率以及超氧陰離子清除率檢測試劑盒由Solarbio科技有限公司(中國北京)生產(chǎn)。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 5000雙光束紫外可見分光光度計(jì)：Agilent Technologies；Ultimate 3000高效液相色譜儀：Thermo；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、SHB-III循環(huán)水真空泵、DL-2005低溫冷卻液循環(huán)泵：上海谷寧儀器有限公司；101-3AB電熱鼓風(fēng)干燥箱、DK-98-IIA電熱控溫水浴鍋：天津市泰斯特儀器有限公司；PX224ZH電子天平：奧豪斯儀器(常州)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 竹葉黃酮的提取工藝

稱取1.0 g處理保存的竹葉干粉，置于平底燒瓶后加入70%的乙醇溶液50 mL，進(jìn)行水浴加熱回流提取，溫度80 ℃，時(shí)間120 min。竹葉黃酮粗提液冷卻至室溫后，進(jìn)行減壓抽濾除去濾渣，用少量的提取溶劑洗滌濾渣，合并濾液并置于圓底燒瓶中。50 ℃下減壓濃縮，除去濾液中的乙醇。倒出燒瓶內(nèi)剩余溶液，并用適量50 ℃的超純水分三次洗滌燒瓶，將洗滌燒瓶的液體與目標(biāo)溶液合并，進(jìn)行二次抽濾后置于分液漏斗中，每次25 mL的三氯甲烷進(jìn)行3次萃取脫脂，萃取脫脂后，收集下層的水溶液置于50 mL的容量瓶中并用超純水定容至刻度線。脫脂后的粗體液進(jìn)行柱層析法純化，將處理好的聚酰胺樹脂進(jìn)行濕法裝柱。待測液與聚酰胺樹脂的比例應(yīng)在1︰2(mL︰g)左右，吸取上述適量脫脂后的粗體液加入層析柱內(nèi)，等待溶液充分吸附后，選取70%乙醇作為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫液的流速控制在1.0 mL/min，等到流出液基本無色后收集10 mL，用70%乙醇定容后即可用于測定。

1.3.2 竹葉黃酮總含量測定

(1)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品精確稱量15.0 mg后，用適量甲醇進(jìn)行超聲溶解，并轉(zhuǎn)移至100 mL的容量瓶中定容至刻度線，制成蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液，恒溫4 ℃下避光保存。取適量蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液進(jìn)行梯度稀釋，在6個(gè)10 mL的比色管中分別加入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液0.5、1.0、2.0、3.0、4.0 mL，分別加入0.3 mL的5% Na2NO2溶液，充分搖勻后靜置5 min左右，后加入0.3 mL的10% Al(NO3)3溶液，充分混勻，計(jì)時(shí)反應(yīng)60 min，加入2 mL的1.0 mol/mL NaOH溶液進(jìn)行顯色反應(yīng)，最后以30%乙醇定容至刻度，相同條件下不加蘆丁標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)存液作為空白對(duì)照，于510 nm處測定吸光度，繪制蘆丁的標(biāo)準(zhǔn)曲線；得出線性回歸方程如下。

Abs=0.011 74C+0.000 39(R2=0.999 13)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

(2)竹葉黃酮總含量的計(jì)算

①

式中：X為樣品總黃酮含量〔g/(100 g)〕，m1為依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出被測液中黃酮含量(μg)，m為試樣的質(zhì)量(g)，V1為待測液分取的體積(mL)，V2為待測液的總體積(mL)。

1.3.3 竹葉中4種黃酮碳苷含量的測定

參考王暉[13]和陳再興[14]的檢測方法，適當(dāng)調(diào)整后測定竹葉中4種黃酮碳苷的含量，色譜條件：色譜柱為AcclaimTM120 C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為2%冰乙酸∶乙腈(86∶14)；流速控制在1.0 mL/min，柱溫箱溫度設(shè)定為40 ℃。進(jìn)樣量為20 μL，檢測波長350 nm。對(duì)照品溶液的制備精密稱取葒草苷、異葒草苷、牡荊苷、異牡荊苷對(duì)照品適量，加甲醇超聲溶解定容制成含量分別為0.186，0.085，0.191，0.205 mg/mL的儲(chǔ)備溶液，將儲(chǔ)備溶液經(jīng)0.45μm微孔濾膜濾過，即為對(duì)照品溶液[15]。將供試品溶液將上述1.3.1提取濃縮后的不同竹葉提取液經(jīng)0.45 μm濾膜濾過后即為供試品溶液，取供試品溶液20 μL進(jìn)樣測定。以超純水作為空白。

標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍考察[16]精密吸取葒草苷、異葒草苷、牡荊苷和異牡荊苷(分別為0.186，0.085，0.191，0.205 mg/mL)對(duì)照品進(jìn)行梯度進(jìn)樣測定(2.0、4.0、8.0、12.0、16.0 μL)，線性回歸縱坐標(biāo)為峰面積的積分值，橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品的進(jìn)樣量(μg)，結(jié)果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍

1.4 竹葉黃酮抗氧化性評(píng)價(jià)

1.4.1 DPPH的清除作用

竹葉黃酮對(duì)DPPH的清除作用參考文獻(xiàn)[17]測定方法改進(jìn)如下，在2 mL的EP管中加入950 μL濃度為0.067 mg/mL的DPPH-甲醇溶液，然后分別加入50 μL由上述1.3.1提取工藝得到的不同竹種竹葉黃酮提取液樣品，充分混勻，室溫避光反應(yīng)20 min，于1 mL石英比色皿測定515 nm吸光值(超純水調(diào)零)，每個(gè)重復(fù)測定3次，另外相同條件下加入50 μL超純水為空白組，以抗壞血酸(濃度為0.839 mg/mL)作為陽性對(duì)照，按式②計(jì)算清除率。

②

式中：A為DPPH清除率(%)，A0為空白組吸光度，A1為待測樣品吸光度。

1.4.2 羥基自由基的清除能力

竹葉黃酮對(duì)羥基自由基的清除能力參考文獻(xiàn)[18]測定方法改進(jìn)如下，每個(gè)2 mL的EP管中依次加入150 μL濃度為0.5 mg/mL的1，10-菲羅啉(鄰二氮菲)溶液、100 μl濃度為2.1 mg/mL FeSO4溶液、100 μL 6.6 mmol/L的H2O2溶液，然后分別加入250 μL由上述1.3.1提取工藝得到的不同竹種竹葉黃酮提取液樣品，混勻，恒溫水浴37 ℃下反應(yīng)60 min，超純水調(diào)零后，于1 mL石英比色皿測定536 nm吸光值，每個(gè)重復(fù)測定3次，另外相同條件下加入650 μL超純水為對(duì)照組；不加過氧化氫溶液，直接加750 μL超純水作為空白組；以抗壞血酸(濃度為0.839 mg/mL)作為陽性對(duì)照，按式③計(jì)算清除率。

③

1.4.3 超氧陰離子的清除能力

竹葉黃酮對(duì)超氧陰離子的清除能力參考文獻(xiàn)[19]測定方法改進(jìn)如下，每個(gè)5 mL的EP管中加入Tris-Hcl緩沖液24 μL(36.2 mg/mL，pH 9.2)，加入1.6 mL濃度為0.5 mg/mL的(NH4)2S2O8溶液，25 ℃反應(yīng)1 min后，然后分別加入0.4 mL由上述1.3.1提取工藝得到的不同竹種竹葉黃酮提取液樣品，加入0.8 mL濃度為0.7 mg/mL的鹽酸羥胺溶液，充分混勻，恒溫水浴37 ℃反應(yīng)30 min，分別加入C6H7NO3S—CH3COOH緩沖液和α-萘胺-CH3COOH緩沖液(3.0 mg/mL pH 2.8；1.0 mg/mL pH 2.8)，充分搖晃均勻以后，在37 ℃恒溫條件下進(jìn)行顯色反應(yīng)20 min，另外相同條件下加入0.4 mL超純水為對(duì)照組，不加過硫酸銨，直接加入2 mL超純水作為空白管，以抗壞血酸(濃度為0.839 mg/mL)作為陽性對(duì)照，于1 mL石英比色皿，以空白管調(diào)零，在530 nm處測定對(duì)照管和測定管的吸光值。每個(gè)重復(fù)測定3次，按式④計(jì)算清除率。

④

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有指標(biāo)數(shù)據(jù)進(jìn)行了3次重復(fù)實(shí)驗(yàn)測定。數(shù)據(jù)通過Microsoft Excel和IBM SPSS Statistics 27進(jìn)行整理計(jì)算以及ANOVA方差分析(P<0.05為顯著差異)，圖像使用origin 2021進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 5個(gè)竹種的竹葉黃酮總含量的分析比較

對(duì)比5個(gè)不同竹種的竹葉黃酮含量如圖2所示，由圖2可知，竹葉黃酮的總含量變化規(guī)律為：流蘇香竹>龍竹>勃氏甜龍竹>箣竹子>大葉慈竹。流蘇香竹竹葉總黃酮的含量顯著高于其他4個(gè)竹種(P<0.05)，龍竹次之，其他3個(gè)竹種之間黃酮總含量無顯著性差異(P>0.05)。通過對(duì)比發(fā)現(xiàn)流蘇香竹竹葉中含有的有效成分最多，這為研究竹葉黃酮生物活性提供了較佳的實(shí)驗(yàn)材料；同時(shí)也發(fā)掘出流蘇香竹的科研價(jià)值。

2.2 不同竹種竹葉主要黃酮碳苷的種類及含量對(duì)比分析

通過對(duì)4種黃酮碳苷進(jìn)行定性分析，得到它們各自的峰保留時(shí)間如圖3，得出四種碳苷標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間后，與樣品相應(yīng)的成分進(jìn)行比對(duì)(圖4)。其中異牡荊苷保留時(shí)間最長，異葒草苷保留時(shí)間最短。HPLC檢測樣品中所含四種碳苷黃酮的分類及含量見表2。

圖3 4種黃酮碳苷標(biāo)準(zhǔn)品色譜

圖4 供試品與四種碳苷標(biāo)準(zhǔn)品比對(duì)色譜

不同竹種龍竹、勃氏甜龍竹、箣竹子、大葉慈竹、流蘇香竹竹葉中的4種碳苷含量總和變化規(guī)律分別為龍竹>勃氏甜龍竹>箣竹子>大葉慈竹>流蘇香竹。

2.3 不同竹葉提取液體外抗氧化能力試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 DPPH清除能力分析

不同竹葉提取液對(duì)DPPH清除率測定如圖5所示，不同竹種竹葉提取液對(duì)DPPH的清除率能力為流蘇香竹>龍竹>箣竹子>大葉慈竹>勃氏甜龍竹，流蘇香竹77.86%、勃氏甜龍竹僅為18.10%；流蘇香竹和龍竹對(duì)DPPH清除率顯著高于其他竹種(P<0.05)，流蘇香竹的清除能力最好，略高于陽性對(duì)照Vc對(duì)DPPH的清除率，由此可以看出，流蘇香竹竹葉提取液對(duì)DPPH有較強(qiáng)的清除能力。黃酮類化合物具有良好的抗氧化能力[20]，流蘇香竹中含有多種黃酮類化合物，推測可能是多種黃酮類化合物的協(xié)同作用，提高流蘇香竹竹葉提取物的抗氧化能力。

圖5 樣品DPPH清除率與Vc對(duì)照

2.3.2 羥基自由基清除能力分析

不同竹葉提取液對(duì)羥基自由基清除率測定如圖6所示，不同竹種竹葉提取液對(duì)羥基自由基的清除率變化規(guī)律為流蘇香竹>龍竹>箣竹子>大葉慈竹>勃氏甜龍竹，流蘇香竹97.29%、勃氏甜龍竹僅為3.76%；其中流蘇香竹對(duì)羥基自由基清除率顯著高于其他竹種(P<0.05)，流蘇香竹的清除能力最好，遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照Vc對(duì)羥基自由基的清除率，由此可以看出來，流蘇香竹竹葉提取液對(duì)羥基自由基有很強(qiáng)的清除能力。

圖6 樣品羥基自由基清除率和Vc對(duì)照

2.3.3 超氧陰離子清除能力分析

不同竹葉提取液對(duì)超氧陰離子的清除率測定如圖7所示，變化規(guī)律為箣竹子>大葉慈竹>勃氏甜龍竹>流蘇香竹>龍竹，不同竹種竹葉提取液對(duì)超氧陰離子的清除率分別為：箣竹子84.65%、龍竹59.05%；其中箣竹子對(duì)超氧陰離子清除率顯著高于其他竹種(P<0.05)，綜合對(duì)比不同竹種竹葉提取液對(duì)超氧陰離子清除的能力，即，箣竹子的清除能力最好，高于陽性對(duì)照Vc對(duì)超氧陰離子的清除率，不過這幾種竹葉提取液對(duì)超氧陰離子都有較為良好的清除能力，除龍竹外，均在60%以上，由此可以看出來，流蘇香竹竹葉提取液對(duì)超氧陰離子也有很好的清除能力。

圖7 樣品超氧陰離子清除率和Vc對(duì)照?qǐng)D

3 討論與結(jié)論

本研究以滇產(chǎn)5種經(jīng)濟(jì)竹竹葉為實(shí)驗(yàn)材料，通過分光光度法[21]和高效液相色譜法[22]兩種檢測方法，對(duì)竹葉黃酮的總含量以及主要的黃酮碳苷進(jìn)行分析對(duì)比，比較5種竹葉提取液的體外抗氧化活性研究，最后確定最優(yōu)竹種的竹葉。通過不同的檢測方法得出，流蘇香竹的竹葉總黃酮含量最多，高達(dá)1.083 g/(100 g)，其中主要4種黃酮碳苷分析，龍竹竹葉中4種碳苷均含有，其中異葒草苷最多20.248 mg/g，龍竹竹葉中4種黃酮碳苷的總含量34.997 mg/g，異葒草苷含量與國家關(guān)于竹葉抗氧化物標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定值(≥2%)相比[23]，完全超過了最低標(biāo)準(zhǔn)值。流蘇香竹的碳苷含量僅1.491 mg/g，但是其總黃酮的含量最多，根據(jù)液相色譜圖中分析得出流蘇香竹的提取液其他成分較多，可能是黃酮O苷的含量及其他類黃酮物質(zhì)含量高于其他竹種。重點(diǎn)分析不同竹葉提取液對(duì)1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH)[24]、羥基自由基(·OH)[25]、超氧陰離子(O2·-)[26]的清除能力，流蘇香竹竹葉提取液對(duì)DPPH、羥基自由基和超氧陰離子的清除率分別為：77.86%、97.29%和67.48%。得出流蘇香竹的竹葉提取物是最為理想的，龍竹次之，對(duì)比竹葉黃酮的總含量以及體外抗氧化實(shí)驗(yàn)結(jié)果，得出最優(yōu)竹種是流蘇香竹。

魏琦等[27]對(duì)10個(gè)竹種竹葉中的13種黃酮類化合物進(jìn)行了測定，其中包括牡竹屬中的龍竹、勃氏甜龍竹和大葉慈竹，本文中龍竹、勃氏甜龍竹和大葉慈竹的葉黃酮總含量測定結(jié)果均高于這13種黃酮總量的測定結(jié)果，可能是由于分光光度法的局限性所致。以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品的顯色法中，只要具有類似蘆丁結(jié)構(gòu)的黃酮化合物，比如酚酸類，內(nèi)酯類物質(zhì)，也可能會(huì)有顯色反應(yīng)。此外，在提取和脫色的過程中，脫色不完全可能會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏高。對(duì)于4種主要黃酮苷的測定結(jié)果接近，是因?yàn)椴捎昧烁咝б合嗌V法，并且由于色譜條件和處理方法的不同，導(dǎo)致了一些偏差。竹葉黃酮的抗氧化能力已經(jīng)被許多研究文章所報(bào)道，比如段麗娜等[28]的研究表明龍竹竹葉黃酮具有良好的抗氧化能力；黃珊等[29]的研究結(jié)果顯示方竹竹葉黃酮也具有較強(qiáng)的抗氧化活性。這些研究都證實(shí)了竹葉黃酮在抗氧化生理活性方面的重要性。本文中除了流蘇香竹外，其他竹種的抗氧化性能與前人的研究相似，進(jìn)一步驗(yàn)證了竹葉黃酮的科研價(jià)值。流蘇香竹提取液顯示出較高的抗氧化能力，表明其抗氧化的活性成分的種類和含量較多。目前尚缺乏關(guān)于流蘇香竹竹葉具體化學(xué)成分的分析報(bào)道，這為后續(xù)的科研工作者提供了有價(jià)值的研究材料，可能會(huì)有新的化合物被發(fā)現(xiàn)。