卯吉華，楊斌，2，姜遠標，2，李榮波，景躍波，2

(1.云南省林業(yè)和草原科學院，云南 昆明 650201；2.國家林業(yè)草原思茅松工程技術研究中心，云南 昆明 650201)

思茅松(Pinuskesiyavar.langbianensis)為松科(Pineaceae)松屬(Pinus)植物，是卡西亞松(Pinuskesiya)的地理變種，在我國天然分布于云南南亞熱帶及準熱帶的濕潤及半濕潤地區(qū)，集中分布于思茅、景東、鎮(zhèn)沅、景谷、普洱、墨江等縣市[1-3]。其材質(zhì)優(yōu)良，具有速生、纖維長、松脂產(chǎn)量高等特點，是云南熱區(qū)的優(yōu)良鄉(xiāng)土樹種之一，在區(qū)域林業(yè)發(fā)展中占有重要的地位。

外生菌根(ectomycorrhizal，ECM)真菌是森林生態(tài)系統(tǒng)中土壤微生物的重要組分，很多研究已證實，ECM真菌對宿主植物的生長和發(fā)育起著關鍵作用，能增強植物對水分的吸收、提高植物的抗旱性[4-5]、增強植物對養(yǎng)分的吸收[6]、減少植物對外源肥料的需求和提高苗木的造林成活率[7]，同時保護植物免受病原菌的侵害[8]。

目前通過外生菌根真菌促進松科植物生長和提高其抗逆性已有廣泛報道，如：徐玲潔等[9]研究表明，接種牛肝菌屬(Suillus)真菌顯著提升了油松(P.tabulaeformis)的地徑、地上和地下部分生物量，分別提高了30.00%、31.57%和47.37%，并顯著促進了苗木地上及地下部分N、P、K含量的提高。趙敏等[4]研究發(fā)現(xiàn)，分離自樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)林地的淺黃根須腹菌(Rhizopogonluteolus)、褐環(huán)粘蓋牛肝菌(Suillusluteus)、粘蓋牛肝菌(S.bovinus)、亞褐環(huán)粘蓋牛肝菌(S.subluteus)、黃褐口蘑(Tricholomafulvum)接種樟子松幼苗形成了棒狀、二叉狀和羽狀等不同形態(tài)的菌根，顯著促進了苗木高生長和生物量的積累。外生菌根真菌接種對苗木生長和營養(yǎng)元素吸收利用的效應，在其他一些松屬樹種如馬尾松、華山松、云南松和濕地松上也有相關的研究證實[10-13]。

思茅松是典型的外生菌根共生樹種，對菌根真菌的依賴性很強，菌根土在思茅松育苗中的應用效果已被證實[14-15]，另外張春霞等[16]研究并報道了印度塊菌(Tuberindicum)與思茅松苗木的菌根合成，研究發(fā)現(xiàn)印度塊菌接種顯著促進了思茅松苗木的生長。可見，利用外生菌根真菌資源培育思茅松菌根化苗木具有廣闊的應用前景。

盡管在思茅松菌根方面開展了一些研究，然而還遠遠不夠深入，發(fā)掘具有優(yōu)良促生效果菌種的研究也十分缺乏，制約了菌根技術在該樹種上的應用。有研究表明，自然生境的植物通常共生著豐富的真菌資源，生境中的土著菌種具有巨大的開發(fā)潛力[9]，天然菌根土即可用作接種劑[17-18]。本研究在云南省思茅松的主要栽培和分布區(qū)，選取中齡思茅松林的菌根土作為接種體，開展不同來源菌根土人工接種的盆栽試驗，研究土著菌對思茅松苗木的共生情況和接種效果，為研發(fā)思茅松高效菌劑和構(gòu)建優(yōu)良菌種組合體系提供依據(jù)和材料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

在云南思茅松的主要分布區(qū)，采集中齡思茅松林的根際土壤作為參試的菌根土，6個采樣點采樣林分分別是鎮(zhèn)沅縣勐大鎮(zhèn)勐統(tǒng)村東邊組人工林(ZY)、云南省林業(yè)和草原科學院普文試驗林場人工林(PW)、普洱市思茅區(qū)萬掌山林場人工林(WZS)、云景林業(yè)開發(fā)有限公司思茅松無性系種子園(JG)、威遠江自然保護區(qū)思茅松天然林(WYJ)和墨江縣新安鎮(zhèn)挖巖村丁帕組人工林(MJ)。2021年3月，在每一個采樣點，隨機選取10株思茅松，采集根際土壤樣品，先用鋤頭、鐵鍬和小鐵鏟等工具在主干附近挖掘，找出一級側(cè)根，然后沿著側(cè)根方向追溯到細根，從細根上抖落土壤以及從細根附近采集根際土，揀除雜質(zhì)。土樣采回后風干，過2 mm土樣篩，得到的菌根土即用于接種試驗。供試思茅松種子采自景谷林業(yè)示范區(qū)示范林場思茅松種子園。本試驗共6個接種處理，1個不接種的對照，每一處理為24株參試苗木。

1.2 試驗方法

1.2.1 幼苗的接種及培養(yǎng)

接種試驗于2021年4月開始在云南省林業(yè)和草原科學院溫室進行。選取顆粒飽滿、大小均勻、無機械損傷的思茅松種子，先用0.5%的KMnO4溶液表面消毒30 min，后用無菌水沖洗數(shù)次后，然后用30 ℃溫水浸種12 h，用草炭加蛭石體積比1︰1混合作基質(zhì)，基質(zhì)經(jīng)過高溫高壓蒸汽滅菌處理(121 ℃，2 h)，接種試驗時，先將基質(zhì)裝入高18 cm，直徑12 cm的育苗袋，用玻棒戳一個深2～3 cm左右的孔穴，把準備好的思茅松菌根土放入孔穴(20 g/株)，攪拌使菌根土與育苗袋中上半部分的基質(zhì)充分混合，試驗同時設置對照(CK)處理，即將6個地點采集的菌根土等量混合，進行高溫高壓蒸汽滅菌(121 ℃，2 h)后，按20 g/株加入育苗容器中。將經(jīng)過表面消毒和溫水浸種處理的思茅松種子，播于育苗營養(yǎng)袋內(nèi)，每袋點播2～3粒，后將種子覆蓋，用噴霧器澆透水，置于溫室中培養(yǎng)，待思茅松芽苗高度2～3 cm時，觀察同一營養(yǎng)袋里出苗的情況，挑選留下一株生長最好的芽苗，其余的輕輕拔除，試驗期間苗木按照常規(guī)管理，適時適量澆水，使基質(zhì)保持濕潤，不施用肥料和殺菌劑。

1.2.2 幼苗菌根形態(tài)觀察和菌根侵染率的統(tǒng)計

接種8個月后，每一處理隨機取6株幼苗進行根系形態(tài)觀察和菌根侵染率的統(tǒng)計。菌根形態(tài)采用體視顯微鏡進行觀察；采用劃線交叉法測定思茅松幼苗根系的菌根侵染情況[19]。將根系清洗干凈，剪成小段，在底部劃分有方格的培養(yǎng)皿中分散均勻鋪開，觀察統(tǒng)計與方格線相交的點是否形成菌根，計算菌根侵染率。

1.2.3 苗木生長及葉綠素含量的測定

對所有參試思茅松幼苗測定苗高和地徑，用直尺測量苗高，用游標卡尺測量地徑。每一個處理隨機抽取6株苗木測定生物量，將幼苗整株取出清洗干凈，沿幼苗莖基部剪斷，分開地上部分和地下部分，用烘箱在105 ℃殺青30 min后，在80 ℃下烘干至恒重，用天平稱量干重。每一處理隨機抽取6株參試苗木，采用分光光度計法測定針葉的葉綠素含量[20]。

1.3 數(shù)據(jù)處理及分析

所有數(shù)據(jù)均采用Excel進行統(tǒng)計，并繪制圖表，用DPS 19.05軟件進行方差分析和Ducan多重比較檢驗差異的顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 思茅松幼苗的菌根侵染率及菌根形態(tài)

經(jīng)不同來源菌根土接種處理的思茅松苗木，根系均形成了典型的外生菌根結(jié)構(gòu)，形態(tài)有棒狀、二叉分支、密簇二叉分支等多種形狀(圖1)，而對照未形成菌根。不同來源菌根土對思茅松苗木根系的侵染能力存在差異，ZY、PW、WZS、JG、WYJ、MJ等各處理的侵染率分別為47.11%，44.38%，34.99%、33.01%、30.30%和18.60%(圖2)。方差分析結(jié)果表明，ZY和PW此2個處理侵染率極顯著高于其他處理(P<0.01)，WZS、JG和WYJ 3個處理侵染率極顯著高于MJ(P<0.01)。

圖1 思茅松苗木菌根的形成及不同形態(tài)

圖2 不同來源菌根土接種對思茅松幼苗菌根侵染率的影響

2.2 接種處理對思茅松幼苗生長的影響

經(jīng)接種處理思茅松幼苗的高徑生長量如圖3所示。ZY、PW、WZS、JG、WYJ和MJ等各處理的幼苗株高分別為51.13、39.47、44.59、44.67、44.50 cm和21.01 cm(圖3A)，地徑分別為4.13、3.61、3.98、3.88、3.69 mm和2.27 mm(圖3B)，對照組的株高和地徑分別為23.45 cm和2.15 mm。方差分析結(jié)果表明，接種處理顯著影響了思茅松幼苗的株高和地徑生長，但不同來源菌根土的效應存在差異。除MJ接種處理與對照無顯著差異外(P>0.05)，其余5個來源的菌根土接種后幼苗的苗高均極顯著高于對照(P<0.01)，效果最為顯著的是ZY接種處理，較對照提高了118.04%，而JG、WZS、WYJ和PW接種處理的幼苗，其苗高較對照也分別提高了90.49%、90.15%、89.77%和68.32%。對地徑生長的效應，除MJ接種處理與對照無顯著差異外(P>0.05)，接種其余5個處理均極顯著高于對照(P<0.01)，特別是接種ZY處理的幼苗，其地徑較對照提高了92.09%，而WZS、JG、WYJ和PW接種處理的幼苗，其地徑較對照也分別提高了85.12%、80.47%、71.63%和67.91%。

圖3 不同來源菌根土接種處理對思茅松幼苗生長量的影響

2.3 接種處理對思茅松幼苗生物量積累的影響

經(jīng)接種處理思茅松幼苗的生物量如圖4所示。ZY、PW、WZS、JG、WYJ和MJ接種處理的幼苗地上部分生物量分別為2.89、1.63、3.03、2.74、2.84 g和0.64 g，地下部分生物量分別為0.81、0.71、0.75、0.50、0.63 g和0.20 g，而對照組的地上和地下部分生物量分別為0.63 g和0.18 g。方差分析結(jié)果表明，除MJ接種處理與對照無顯著差異外(P>0.05)，接種其余5個來源的菌根土幼苗地上部分生物量均極顯著高于對照(P<0.01)，尤其是WZS處理的幼苗，其地上部分生物量較對照提高了380.95%，而ZY、WYJ、JG和PW接種處理的幼苗，地上部分生物量分別較對照提高了358.73%、350.79%、334.92%和158.73%。除MJ接種處理與對照無顯著差異外(P>0.05)，接種其余5個來源菌根土幼苗的地下部分生物量均極顯著高于對照(P<0.01)，尤其是ZY接種處理的幼苗，其地下部分生物量比對照提高了350.00%，而WZS、PW、WYJ和JG接種處理的幼苗，地下部分生物量較對照分別提高了316.67%、294.44%、250.00%和177.78%。

2.4 接種處理對思茅松幼苗葉綠素含量的影響

由圖5可知，不同來源的菌根土接種對思茅松幼苗針葉葉綠素含量的影響較大。與對照相比，MJ、PW、JG、WYJ、ZY和WZS接種處理其幼苗針葉的葉綠素b(Chl b)含量分別提高了46.48%、23.74%、21.21%、17.96%、12.91%和2.98%；JG、MJ、WZS、PW、ZY和WYJ接種處理其針葉的葉綠素a(Chl a)含量分別增加了74.27%、62.56%、46.99%、42.19%、40.96%和27.12%。菌根的形成顯著增加了思茅松幼苗葉綠素總含量，與對照處理相比，接種MJ、JG、PW、ZY、WZS和WYJ處理其幼苗葉綠素總含量(Chl t)分別增加了56.41%、54.00%、35.14%、30.24%、30.17%和23.62%。

圖5 不同來源菌根土接種對思茅松幼苗葉綠素含量的影響

3 討論

在林木育苗階段接種菌根真菌，可顯著提高苗木成活率和苗木質(zhì)量，縮短上山造林緩苗期，并促進幼樹生長[21]。本研究中，菌根化的思茅松幼苗各項生長指標和針葉的葉綠素含量顯著高于對照，表明外生菌根真菌在不同程度上促進了思茅松苗木的生長，事實上，已有大量研究證實外生菌根真菌能夠促進松屬樹種苗木對養(yǎng)分和水分的吸收[22-24]。

本研究還發(fā)現(xiàn)，根系菌根侵染率最高的接種處理(ZY)，苗木的高、地徑和地下部分生物量均為所有接種處理中最高，這在一定程度上可以說明，菌根形成率高加大了宿主植物根系吸收面積，從而對宿主植物的促生效果較明顯[13]，菌根侵染對苗木高、徑生長和地下部分生物量具有積極的作用，這與其他研究者在樟子松上的研究結(jié)果相符[4，25]。

已有很多研究表明，菌根真菌對林木幼苗的促生效果以及林木菌根生長響應因菌種或菌株而異，不同接種體的效果不同[9，26-27]，發(fā)掘和篩選高效促生的外生菌根真菌資源，是菌根技術應用于生產(chǎn)實際的基礎性工作。本研究證實取自云南6個分布點的思茅松菌根土均能與思茅松苗木形成外生菌根，且其中5個地點的菌根土對思茅松苗木的生長和生物量的積累均具有顯著的促進效應。結(jié)合林木輕基質(zhì)育苗，加入少量的菌根土是一種簡便易行的方法，然而該方法在實際中的應用也會受到一些限制，生產(chǎn)中應現(xiàn)用現(xiàn)采，因為隨著儲存時間的延長，天然菌根土的接種勢會顯著下降，另外還存在接種效果不一致的情況[17]。本研究對云南省主要的思茅松分布和栽培地外生菌根真菌在苗木培育中的應用潛力進行了探索，下一步將針對接種效果好的林下及根際土壤中的外生菌根真菌多樣性進行深入研究，分離培養(yǎng)和篩選優(yōu)良菌種，擴繁制備標準化的思茅松菌根菌劑，研發(fā)苗木菌根化的配套技術措施，從而更好地促進思茅松菌根化壯苗的培育。