歐 賢,周金瑤,孫 饒,王亞萍,吳禎祥,趙凱奇,汪華學(xué),2*

1蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科;2蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院急危重癥研究所;3蚌埠醫(yī)學(xué)院,蚌埠 233000

膿毒癥是宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]。腎臟是膿毒癥最常見的受累器官之一,膿毒癥相關(guān)急性腎損傷(sepsis-associated acute kidney injury,SA-AKI)常常成為膿毒癥患者死亡的直接原因,具有極高的死亡率[2],給臨床醫(yī)生帶來了前所未有的挑戰(zhàn)。AKI遷延不愈,成為慢性腎病(chronic kidney disease,CKD)的潛在風(fēng)險(xiǎn)增加,存活患者往往不可避免地進(jìn)展到終末期腎病(end stage renal disease,ESRD),嚴(yán)重威脅患者的生活質(zhì)量和生命安全[3]。

遺憾的是,目前預(yù)防和治療SA-AKI的能力非常有限。積極的基于液體的治療可能并無可靠的循證醫(yī)學(xué)證據(jù),甚至是有害的。使用血管活性藥物維持血壓,需要兼顧大循環(huán)和微循環(huán),維持血壓目標(biāo)的多少才有助于避免AKI的發(fā)生尚無定論。如果腎臟預(yù)防失敗則不得不采用腎替代(renal replacement therapy,RRT)治療,但RRT干預(yù)的最佳時(shí)機(jī)和方式并不明確[4]。如果SA-AKI患者存活,雖然大多數(shù)患者腎功能會(huì)恢復(fù),但對(duì)腎臟修復(fù)或腎功能修復(fù)失敗的機(jī)制知之甚少,并且進(jìn)展到CKD和ESRD的終身風(fēng)險(xiǎn)更高。迄今為止,尚無確切可靠的治療AKI的藥物,臨床常規(guī)的治療措施主要還是腎替代和對(duì)癥綜合治療,腎臟功能的修復(fù)依賴于機(jī)體整體可靠的支持下的腎臟本身。因此,探索能夠早期及時(shí)有效預(yù)防或治療SA-AKI的藥物或措施,避免慢性腎病的發(fā)生或促進(jìn)腎臟修復(fù),對(duì)于降低膿毒癥患者病死率和提高存活患者的生活質(zhì)量,具有重要的臨床價(jià)值。

大黃素是一種自大黃、虎杖等中草藥中提取的天然化合物,具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤等多種藥理作用。既往研究證實(shí)大黃素對(duì)膿毒癥患者具有保護(hù)作用;最近的研究顯示,大黃素對(duì)氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡導(dǎo)致的損傷具有保護(hù)作用[5]。然而,尚不清楚大黃素能否改善SA-AKI患者的預(yù)后。本研究將通過生命科學(xué)相關(guān)數(shù)據(jù)庫探尋SA-AKI發(fā)病過程的關(guān)鍵基因,并分析關(guān)鍵基因所涉及的炎癥信號(hào)通路;繼之通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)探討大黃素是否影響SA-AKI的炎癥通路和對(duì)SA-AKI大鼠的保護(hù)作用及其機(jī)制,為其防治提供新思路。

1 材料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫分析

1.1.1 SA-AKI發(fā)病過程關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

利用GEO數(shù)據(jù)庫(www.ncbi.nlm.nih.gov)搜索SA-AKI相關(guān)數(shù)據(jù)集,其中GSE186822符合條件,包含3個(gè)盲腸結(jié)扎穿刺(cecal ligation and puncture,CLP)模型和2個(gè)正常模型鼠腎的原始測序數(shù)據(jù),將原始數(shù)據(jù)利用R語言DESeq2包處理,條件設(shè)定logFC>1,P<0.05,篩選出SA-AKI發(fā)病過程中的關(guān)鍵基因。最后利用GeneToList(www.genetolist.com)將差異基因的ID與名稱進(jìn)行比對(duì),舍棄無法對(duì)應(yīng)的基因ID。

1.1.2 潛在靶點(diǎn)的GO和KEGG 分析

基因本體論(gene ontology,GO)中生物過程數(shù)據(jù)庫(biological process,BP)、細(xì)胞成分?jǐn)?shù)據(jù)庫(cellular component,CC)和分子功能數(shù)據(jù)庫(molecular function,MF)分別描述了基因產(chǎn)物涉及的生物過程、所處的細(xì)胞環(huán)境和可能的分子功能?；蚝突蚪M(kyoto encylopaedia of genes and genomes,KEGG)路徑包括大多數(shù)已知的代謝途徑和一些已知的調(diào)控途徑。為了更進(jìn)一步了解SA-AKI發(fā)病過程所涉及的生物學(xué)過程,進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。

1.1.3 PPI分析和核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

STRING網(wǎng)站(cn.string-db.org)是一個(gè)在線蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interaction,PPI)分析數(shù)據(jù)庫,它可以使用計(jì)算預(yù)測來補(bǔ)充現(xiàn)有的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)相互作用的信息。將SA-AKI發(fā)病過程關(guān)鍵靶點(diǎn)生成PPI網(wǎng)絡(luò),以鼠為研究對(duì)象,最小相互作用得分為0.4。利用Cytoscape3.8.2軟件將PPI結(jié)果導(dǎo)入,采用MCODE插件進(jìn)行核心互作網(wǎng)絡(luò)分析并展示,同時(shí)將KEGG富集分析的炎性信號(hào)通路涉及的核心靶點(diǎn)構(gòu)建信號(hào)通路與核心靶蛋白的互作網(wǎng)絡(luò)。

1.2 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證

1.2.1 藥物、主要試劑和儀器

大黃素(貨號(hào)為:E886074,純度 ≥ 96%,上海麥克林生化科技股份有限公司);羧甲基纖維素鈉和BSA封閉液(貨號(hào)為:C8620、A8020,Solarbio公司);蘇木素-伊紅染液(貨號(hào)為:KGA224,江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司);Scr、BUN和MDA(貨號(hào)為:C011-2-1、C013-2-1、A003-1-2,南京建成生物科技有限公司);IFN-γ、IL-17和TNF-α的ELISA檢測試劑盒(貨號(hào)為:YX-E21193、YX-E21019、YX-E21174,上海優(yōu)選生物科技有限公司);一抗TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65、IκBα和p-IκBα(貨號(hào)為:AF7014、DF6127、AF5376、AF5006、AF5002、AF2002,Affinity公司);內(nèi)參GAPDH(貨號(hào)為:AF2819,上海碧云天生物技術(shù)有限公司);HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG和BCA蛋白定量試劑盒(貨號(hào)為:GB23303、G2026,武漢賽維爾生物科技有限公司);ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、上樣緩沖液和蛋白Marker(貨號(hào)為:SQ202、PG112、WJ103、LT101S,上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司);電熱扶風(fēng)干燥箱(貨號(hào)為:101AS-3,上海圣欣科學(xué)儀器有限公司);冰箱(貨號(hào)為:BCD-258A/C,海爾);生物熒光顯微鏡(貨號(hào)為:BX63,Olympus);天平(貨號(hào)為:E200,賽多利斯);酶標(biāo)儀(貨號(hào)為:1681130,Bio-rad);TOUCH IMAGER接觸式化學(xué)發(fā)光成像儀(貨號(hào)為:E-BLOT XLi,E-Blot)。

1.2.2 動(dòng)物模型、模型構(gòu)建和分組方法

6～8周雄性SDF級(jí)Wistar大鼠(許可證號(hào)為:SCXK(魯)20190003,濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖有限公司),體重200～220 g。所有操作流程按照蚌埠醫(yī)學(xué)院倫理委員會(huì)指定的實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物使用和護(hù)理指南進(jìn)行,同時(shí)符合國際實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南建議(倫理審批號(hào)為:倫動(dòng)科批字[2022]第403號(hào))。將40只Wistar大鼠喂食普通飼料兩周后,隨機(jī)選取30只后按照隨機(jī)數(shù)表法分為3組:假手術(shù)組(Sham)、膿毒癥組(CLP)和藥物組(CLP+EMO),每組各10只。造模前大鼠禁食12 h,自由飲水。CLP模型利用水合氯醛(40 mg/kg)麻醉大鼠,然后取腹部正中切口2 cm,暴露盲腸,用18號(hào)針頭穿刺,少量盲腸內(nèi)容物通過穿刺傷口擠出,關(guān)閉剖腹術(shù)切口,并給予無菌生理鹽水(24 mL/kg)進(jìn)行液體復(fù)蘇。Sham組除未用18號(hào)針頭穿刺盲腸,其余步驟與CLP組相同。CLP+EMO組在造模前5 d內(nèi)灌胃(35 mg/(kg·d))含大黃素的羧甲基纖維素鈉混懸液,另兩組大鼠給予相同劑量的0.5%羧甲基纖維素鈉混懸液進(jìn)行灌胃,最后一次灌胃后2 h時(shí)制備CLP模型[6]。干預(yù)期間,觀察大鼠的一般情況,并記錄各組死亡數(shù)目。造模后24 h時(shí)處死大鼠,留取腎組織及血液標(biāo)本。

1.2.3 腎組織病理學(xué)檢測

將大鼠腎組織浸泡于4%多聚甲醛溶液中,經(jīng)過梯度乙醇脫水后用石蠟包埋并切片,常規(guī)HE染色,在光鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行病理性觀察并拍照。

1.2.4 腎功能和氧化指標(biāo)測定

將經(jīng)腹主動(dòng)脈采集的血液經(jīng)3 000 r/min離心10 min取上清液于-80 ℃保存?zhèn)溆?。分別采用脲酶法和肌氨酸氧化酶法對(duì)各組血清肌酐(serum creatinine,Scr)和血尿素氮(blood urea nitrogen,BUN)進(jìn)行檢測;硫代巴比妥酸法測定大鼠血清丙二醛(malondialdehyde,MDA)。

1.2.5 血清IFN-γ、IL-17、TNF-α濃度測定

采用雙抗體夾心ELISA測定-80 ℃保存的大鼠血清,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作測量干擾素-γ(interferon gamma,IFN-γ)、白細(xì)胞介素-17(interleukin 17,IL-17)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)含量。

1.2.6 Western blot

利用細(xì)胞裂解液和蛋白酶抑制劑混合液提取腎組織蛋白,BCA法測定其樣品蛋白濃度。制備SDS-PAGE膠在120 V電壓下電泳60 min,然后轉(zhuǎn)移至PVDF膜后轉(zhuǎn)膜120 min,BSA室溫封閉2 h,TBST洗膜3次后加入稀釋的一抗:TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65、p-IκBα、IκBα和GAPDH在冰箱中4 ℃過夜,TBST洗膜3次后加入二抗稀釋液搖床孵育1 h,再次洗膜后加入顯影液后進(jìn)行曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 關(guān)鍵靶基因篩選

利用R語言的DESeq2設(shè)定logFC>1,P<0.05篩選出2 814個(gè)SA-AKI發(fā)病過程中與健康對(duì)照組之間存在顯著差異的基因,經(jīng)過GeneToList將ID與基因名稱對(duì)應(yīng)共2 801個(gè)匹配成功,故舍棄13個(gè)基因,將匹配成功的基因繼續(xù)用于后續(xù)分析。圖中展示了差異基因的火山圖(見圖1)。

圖1 差異基因的火山圖 Fig.1 Volcano diagram of differential genes

2.2 GO和KEGG分析

將2 801個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行了GO和KEGG分析,并將富集排名前十結(jié)果進(jìn)行展示。GO中BP主要富集于脈管系統(tǒng)發(fā)育的調(diào)節(jié)、血管調(diào)節(jié)、內(nèi)皮發(fā)育、傷口愈合、上皮細(xì)胞增殖、創(chuàng)傷反應(yīng)、細(xì)胞-基質(zhì)黏附和小GTP酶介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等。CC則是富集于含膠原的細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞頂端、膜筏、膜微區(qū)、基底外側(cè)質(zhì)膜、膜區(qū)、頂質(zhì)膜、基底膜、細(xì)胞皮質(zhì)和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架等。MF富集于核苷、嘌呤核苷、核糖核苷、GTP、鳥苷酸、鳥苷酸核糖核苷酸、細(xì)胞粘附分子和整合素的結(jié)合以及GTP酶活性等(見圖2)。KEGG則是富集于ECM-受體相互作用、IL-17信號(hào)通路、脂質(zhì)和動(dòng)脈粥樣硬化、MAPK信號(hào)通路、NF-κB信號(hào)通路、破骨細(xì)胞分化、PI3K-Akt信號(hào)通路、小細(xì)胞肺癌、TNF信號(hào)通路和弓形蟲病(見圖3)。

圖2 GO功能富集分析 Fig.2 GO functional enrichment analysis

圖3 KEGG通路分析Fig.3 KEGG pathway analysis

2.3 PPI分析和核心網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

由于PPI互作網(wǎng)絡(luò)最多允許2 000個(gè)蛋白之間進(jìn)行構(gòu)建,因此將2 801個(gè)基因通過差異倍數(shù)絕對(duì)值大小篩選出前2 000個(gè)基因進(jìn)行分析。結(jié)果含有1 850個(gè)節(jié)點(diǎn)數(shù)和15 591條邊。MOCDE篩選的核心互作網(wǎng)絡(luò)含有69個(gè)節(jié)點(diǎn)和1 190條邊,核心節(jié)點(diǎn)排名前十的基因?yàn)镃-X-C基序趨化因子配體10(CXCL10)、腫瘤壞死因子(TNF)、白細(xì)胞介素1β(IL-1β)、白細(xì)胞介素6(IL-6)、C-C基序趨化因子配體2(CCL2)、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(STAT3)、JUN原癌基因(JUN)、前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶2(PTGS)、Toll樣受體2(TLR2)和整合素亞單位αM(ITGAM)(見圖4)。同時(shí)將5條炎性信號(hào)通路與所涉及的36個(gè)核心靶點(diǎn)構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)(見圖5)。

圖4 69個(gè)核心靶標(biāo)的PPI互作網(wǎng)絡(luò)Fig.4 PPI interaction network of 69 core targets

圖5 炎性信號(hào)通路與核心靶標(biāo)的互作網(wǎng)絡(luò)Fig.5 Interaction network between inflammatory signaling pathways and core targets

2.4 各組大鼠一般情況觀察和死亡率比較

Sham組灌藥期間死亡2只,手術(shù)后24 h未出現(xiàn)死亡,大鼠皮毛順滑,呼吸正常,行為良好。CLP組灌藥期間未死亡,造模24 h后死亡2只,大鼠皮毛順滑度較低,盲腸化膿性感染呈深黑色,反應(yīng)較遲鈍,全身乏力。CLP+EMO組灌藥期間死亡1只,造模24 h后死亡2只,癥狀相對(duì)CLP組有所緩解,但出現(xiàn)腹瀉癥狀。Sham組、CLP組和CLP+EMO組6 d死亡率分別為20.00%、20.00%和30.00%,3組死亡率比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P> 0.05)(見表1)。

表1 大鼠一般情況和死亡率Table 1 General condition and mortality of rats

2.5 腎組織病理學(xué)結(jié)果

通過HE染色法觀察到Sham組的腎小球結(jié)構(gòu)清晰,大小無改變,腎小管無腫脹、水腫,未見空泡化改變,高倍鏡下無炎細(xì)胞浸潤;而CLP組則腎小球大小不一,有萎縮和分裂現(xiàn)象,腎小管擴(kuò)張,空泡樣改變多見,高倍鏡下可見大量炎性細(xì)胞浸潤;CLP+EMO組相比于CLP組腎小球大小不一,有萎縮和分裂現(xiàn)象,腎小管擴(kuò)張,空泡樣改變減少,高倍鏡下見炎性細(xì)胞浸潤減少(見圖6)。

2.6 大鼠血清腎功能和氧化應(yīng)激指標(biāo)

與Sham組相比,CLP組大鼠血清Scr和血漿BUN水平顯著升高(P<0.001),同時(shí)反映機(jī)體脂質(zhì)過氧化的程度的MDA含量也顯著升高(P<0.001),與CLP組比較,CLP+EMO組中的Scr、BUN和MDA水平降低(P<0.01)(見表2)。

2.7 大鼠血清TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 水平

與Sham組比較,CLP組大鼠血清中TNF-α、IL-17和IFN-γ表達(dá)均明顯增高(P<0.001),與CLP組比較,CLP+EMO組的TNF-α、IL-17和IFN-γ水平顯著降低(P<0.001)(見表3)。結(jié)果提示大黃素可能參與調(diào)節(jié)Th17/Treg信號(hào)軸減弱膿毒癥大鼠的炎癥反應(yīng)。

表3 血清 TNF-α、IL-17 和 IFN-γ 水平比較Table 3 Comparison of serum TNF-α,IL-17 and IFN-γ

2.8 大黃素對(duì)IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的影響

對(duì)IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信號(hào)通路主要示意圖進(jìn)行繪制(見圖7)。在大黃素對(duì)上述信號(hào)通路的作用中發(fā)現(xiàn),與Sham組相比,CLP組腎組織中TNF-α、IL-17A、TRAF6、NF-κBp65蛋白表達(dá)及IκBα磷酸化水平升高(P<0.05),與CLP組比較,CLP+EMO組中上述蛋白均呈現(xiàn)不同水平的降低(P<0.05)(見圖8)。提示大黃素可能通過減少大鼠腎組織中IL-17A和TNF-α的表達(dá)減弱NF-κB信號(hào)通路的激活。

圖7 IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB主要信號(hào)通路Fig.7 Main signaling pathways of IL-17/NF-κB and TNF/NF-κB

圖8 大黃素對(duì) TNF-α、IL-17A、TRAF6和NF-κB信號(hào)通路蛋白的影響Fig.8 Effect of emodin on TNF-α,IL-17A,TRAF6,and NF-κB signaling pathway 注:與Sham組比較,#P<0.05,##P<0.01,####P<0.0001;與CLP組比較,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001。Note:Compared with Sham group,#P<0.05,##P<0.01,####P<0.0001;Compared with CLP group,*P<0.05,**P<0.01,****P<0.0001.

3 討論與結(jié)論

研究顯示,導(dǎo)致SA-AKI的發(fā)病因素多且復(fù)雜,涉及炎癥、微循環(huán)功能障礙和代謝重編程之間的相互作用,其病理生理學(xué)涉及多種細(xì)胞類型的損傷和功能障礙。在膿毒癥發(fā)病過程中,細(xì)菌釋放內(nèi)毒素或內(nèi)毒素樣物質(zhì),致使機(jī)體中性粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等炎性細(xì)胞激活,釋放出大量的內(nèi)源性炎癥介質(zhì)進(jìn)入血液循環(huán)中,一方面造成包括腎臟在內(nèi)的多器官損害,另一方面又激活更多的炎性細(xì)胞參與發(fā)病,形成惡性的免疫網(wǎng)絡(luò)反應(yīng)[7]。在脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的SA-AKI的SD大鼠模型中,橙花叔醇通過抑制NF-κB和Toll樣受體4(toll like receptor 4,TLR4)信號(hào)通路減輕SA-AKI[8]。TLR4/NF-κB通路被證實(shí)參與腎臟炎癥應(yīng)答的過程,抑制TLR4/NF-κB介導(dǎo)的炎性反應(yīng)對(duì)LPS誘導(dǎo)的AKI具有保護(hù)作用?？梢?炎性反應(yīng)是SA-AKI發(fā)病的重要機(jī)制,抑制炎性反應(yīng)通路是治療膿毒癥的一種重要的治療方案,為臨床上治療SA-AKI患者提供了新思路。

本研究借助于生物數(shù)據(jù)庫分析出包含了2 801個(gè)SA-AKI發(fā)病過程的關(guān)鍵靶點(diǎn),對(duì)靶點(diǎn)KEGG分析結(jié)果表明共5條關(guān)鍵的炎癥反應(yīng)信號(hào)通路,其中TNF信號(hào)通路與IL-17信號(hào)通路排名靠前,并且NF-κB信號(hào)通路作為兩者的樞紐共同參與SA-AKI發(fā)病進(jìn)程。在TNF信號(hào)通路中,TNF-α不僅是上游激活NF-κB信號(hào)的關(guān)鍵,同時(shí)又作為NF-κB信號(hào)通路的下游響應(yīng)分子,提示其通過正反饋促進(jìn)NF-κB信號(hào)通路,且二者相輔相成。在IL-17信號(hào)通路中,IL-17家族中IL-17A是主要的啟動(dòng)因子,Th17細(xì)胞是其主要分泌細(xì)胞。在CLP誘導(dǎo)的模型中發(fā)現(xiàn)IL-17A在腹腔中的高表達(dá),且在嚴(yán)重膿毒癥后的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵作用,并且通過中和腹腔中的IL-17A則能夠減少促炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生[9]。同時(shí)有研究表明樹突狀細(xì)胞(dendritic cell,DC)中Toll樣受體9(toll like receptor 9,TLR9)介導(dǎo)γδT細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17A可能在SA-AKI的發(fā)展中起關(guān)鍵作用[10];另有研究表明敲除IL-17A可預(yù)防SA-AKI[11]。上述表明TNF-α與IL-17A是膿毒癥的促炎因子,且TNF信號(hào)通路與IL-17信號(hào)通路廣泛參與膿毒癥的發(fā)生發(fā)展過程中,與數(shù)據(jù)分析結(jié)果相吻合。

而大黃素對(duì)膿毒癥的治療也已有較多研究,主要集中于腦、血液、心肌、腸道和肺組織。在膿毒癥相關(guān)性腦病(sepsis-associated encephalopathy,SAE),大黃素可以改善認(rèn)知功能障礙和病理損傷,并且通過上調(diào) BDNF/TrkB 信號(hào)抑制 CLP 誘導(dǎo)的小鼠炎癥反應(yīng)[12]。在血液系統(tǒng)中,大黃素下調(diào)P-選擇素,改善膿毒癥后期的血小板數(shù)量和聚集能力,同時(shí)改善內(nèi)源性凝血因子活性和纖維蛋白原功能,發(fā)揮抗炎作用[13]。在膿毒癥心肌病中,發(fā)現(xiàn)大黃素可以逆轉(zhuǎn)膿毒癥大鼠心功能不全并改善心肌狀況,這可能與其抑制炎癥小體的激活有關(guān)[14]。在膿毒癥誘導(dǎo)腸損傷中,大黃素可以改善腸道黏膜損傷,表現(xiàn)為炎癥因子和氧化應(yīng)激標(biāo)志物水平的降低,而其作用機(jī)制可能與VDR/Nrf2/HO-1通路有關(guān)[15];并通過提高緊密連接(tight junction,TJ)蛋白表達(dá)水平保護(hù)腸屏障完整性,抑制腸屏障通透性[6]。除改善腸道的炎癥反應(yīng)和屏障功能外,大黃素還能阻止大腸埃希菌的位移,防止細(xì)菌的擴(kuò)散轉(zhuǎn)移,減少細(xì)菌所引起的二次危害[16]。在膿毒癥相關(guān)急性肺損傷中,大黃素可抑制NF-kB和高遷移率族蛋白B1(high mobility group box 1,HMGB1)通路[17],從而減輕肺部氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)。另一項(xiàng)關(guān)于肺部的研究是基于自噬通路所探討的,在大黃素的干預(yù)下可以有效的阻止急性肺損傷發(fā)病進(jìn)程[18]。不僅如此,另有研究表明大黃素可通過調(diào)節(jié)水通道蛋白(aquaporin,AQP)、TJ、炎癥因子和肺細(xì)胞凋亡等途徑有效減輕膿毒癥急性肺損傷中的肺組織水腫[19]。大黃素對(duì)于SA-AKI的研究尚未報(bào)道,通過本研究發(fā)現(xiàn)CLP模型大鼠經(jīng)過大黃素的治療后,ELISA結(jié)果顯示TNF-α、IL-17和IFN-γ表達(dá)降低,這與大黃素抑制膿毒癥炎癥反應(yīng)結(jié)果相一致。

同樣的對(duì)大黃素影響Th17/Treg炎癥軸也已被闡述。在對(duì)急性胰腺炎的研究中發(fā)現(xiàn),大黃素通過調(diào)節(jié)IFNγ/IL-17比例抑制嚴(yán)重急性胰腺炎免疫反應(yīng)進(jìn)而緩解腸屏障功能障礙[20]。而本研究發(fā)現(xiàn)在SA-AKI中,大黃素同樣可以減少IL-17A的表達(dá),并且改善其炎癥反應(yīng)。

綜上所述,本研究通過數(shù)據(jù)挖掘,確立了大黃素發(fā)病過程的2 801個(gè)關(guān)鍵基因,GO生物過程分析提示這些靶點(diǎn)的生物學(xué)功能主要涉及膜信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、血管調(diào)節(jié)和傷口愈合。KEGG 通路富集分析顯示,TNF、IL-17、PI3K-Akt、NF-κB和MAPK信號(hào)通路是富集與炎癥相關(guān)的信號(hào)通路。實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證大黃素治療SA-AKI腎功能好轉(zhuǎn),且氧化應(yīng)激水平(MDA)與炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-17和IFN-γ)水平降低,IL-17A、TNF-α、TRAF6、NF-κBp65蛋白表達(dá)和IκBα磷酸化水平與CLP組相比明顯下降,這與數(shù)據(jù)分析結(jié)果相符。提示大黃素可改善大鼠SA-AKI,可能與IL-17/NF-κB和TNF/NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。