康永鋒,武改芳,李 立,甘建紅*

1上海海洋大學(xué)食品學(xué)院;2上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心;3食品科學(xué)與工程國家級實驗教學(xué)示范中心,上海 201306

海洋的高壓、高鹽、缺氧和少光等特殊的生態(tài)環(huán)境,使得海洋生物能夠擁有獨特的代謝機(jī)制,從而產(chǎn)生結(jié)構(gòu)新穎的次級代謝產(chǎn)物。海綿是海洋的第二大生物,被認(rèn)為是海洋天然產(chǎn)物最豐富的來源[1,2]。Dactylospongia屬海綿擁有豐富的具有生物活性的次生代謝產(chǎn)物,文獻(xiàn)報道的該屬海綿的化學(xué)成分主要有倍半萜醌/氫醌、倍半萜酸類、二萜、類固醇、二倍半萜類以及其他類型的化合物[3],其中大部分為倍半萜醌/氫醌。這些代謝產(chǎn)物顯示出一系列的生物活性,如抗腫瘤、抗血管生成、抗菌[4]、抗炎[5]、抗錐蟲、抗瘧原蟲[6]和抗氧化[7]等活性。目前,從D.elegans海綿中分離得到的二倍半萜類化合物相對較少,僅有少量的文獻(xiàn)進(jìn)行了報道,如Yu等[8]從D.elegans海綿中分離得到了5個新的二倍半萜類化合物。

本文對胄甲海綿D.elegans的化學(xué)成分進(jìn)行了一系列的研究,致力于發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎、具有生物活性的化合物,豐富海洋來源的天然產(chǎn)物,同時發(fā)現(xiàn)具有潛在藥用價值的先導(dǎo)化合物。

1 材料與方法

1.1 主要儀器與試劑

Waters 1525/2996高效液相色譜儀(美國Waters公司);Bruker AV-600型核磁共振儀、Bruker AVANCE NEO 400兆核磁共振波譜儀(美國Bruker公司);TLC高效薄層層析板(煙臺江友硅膠開發(fā)有限公司);甲醇、乙腈(色譜純,美國Promptar公司);二氯甲烷、甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇(分析純,上?；瘜W(xué)試劑公司);氘代試劑(上海思域化工科技有限公司);顯色劑用10%硫酸香蘭素溶液;小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7(中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心);胎牛血清(美國Hyclone 公司,批號:SH30406.05);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司,批號:812557);飲用純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司);地塞米松(北京索萊寶科技有限公司,純度:≥98%,批號:D8040)。

1.2 樣品來源

胄甲海綿D.elegans樣品于2020年3月采自中國南海永興島,種屬由上海交通大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院林厚文教授鑒定。樣本(編號D20-3)存放于上海海洋大學(xué)食品學(xué)院。

1.3 實驗方法

1.3.1 提取分離

將海綿(D.elegans)切碎后,用乙醇反復(fù)浸泡、超聲提取,直到薄層色譜法檢驗完全提取為止,合并提取液,減壓濃縮得到粗浸膏;將粗浸膏混懸于1.5 L水中,用等體積二氯甲烷萃取4次;減壓濃縮得到總浸膏;將其混懸分散于90%的甲醇溶液中,用等體積的石油醚萃取3次,濃縮萃取液得到石油醚部位浸膏;再加水將混懸液的甲醇濃度調(diào)整至60%,用等體積的二氯甲烷萃取3次,濃縮萃取液得到二氯甲烷部位浸膏。

將二氯甲烷部位浸膏進(jìn)行減壓硅膠柱色譜,用石油醚-乙酸乙酯(100∶1 → 1∶1,MeOH)進(jìn)行梯度洗脫,根據(jù)TLC顯色合并相似流份得到7個組分A～G。對組分C進(jìn)行反相ODS色譜柱色譜,甲醇-水(40∶60 →100∶0)梯度洗脫,根據(jù)TLC顯色合并相似流分得到8個組分D1～D8,對組分D3進(jìn)行正相硅膠柱色譜,石油醚-乙酸乙酯(100∶1 → 1∶1)梯度洗脫,根據(jù)TLC顯色合并相似流分得到5個組分(D3a～D3e)。從D3c組分以甲醇-水(90∶10)為洗脫體系經(jīng)高效液相色譜純化得到化合物2(2.1 mg,tR=39 min)。對組分D4進(jìn)行正相硅膠柱色譜,石油醚-乙酸乙酯(100∶1 → 1∶1)梯度洗脫,根據(jù)TLC顯色合并相似流分得到4個組分(D4a～D4d);從D4b組分以乙腈-水(75∶25,0.1%甲酸)為洗脫體系經(jīng)高效液相色譜純化得到化合物1(2.0 mg,tR= 25 min),從D4c組分以甲醇-水(90∶10,0.1%甲酸)為洗脫體系經(jīng)高效液相色譜純化得到化合物3(2.3 mg,tR= 40 min)和4(1.7 mg,tR= 46 min)。對組分E進(jìn)行正相硅膠柱色譜,二氯甲烷-甲醇(100∶1 → 1∶1)梯度洗脫,根據(jù)TLC顯色合并相似流分得到7個組分(E1～E7)。從E4組分以甲醇-水(87∶13,0.1%甲酸)為洗脫體系經(jīng)高效液相色譜純化得到化合物5(2.2 mg,tR= 31 min)和7(1.8 mg,tR= 49 min)以及組分E4a;組分E4a以乙腈-水(75∶25,0.1%甲酸)體系經(jīng)過HPLC二次純化得到化合物6(2.1 mg,tR= 47 min)組分E5以甲醇-水(85∶15,0.1%甲酸)為洗脫體系經(jīng)高效液相色譜得到化合物8(3.2 mg,tR= 52 min)。

1.3.2 生物活性測定

1.3.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

將小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞用含10%新生胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng),37 ℃,5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞覆蓋率達(dá)85%以上時傳代,生長狀態(tài)良好的細(xì)胞用于實驗研究。

1.3.2.2 NO生成抑制率測定

采用Griess法[9]檢測化合物對脂多糖LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的抑制作用。對數(shù)生長期的RAW 264.7細(xì)胞以5×104個/孔的密度接種到96孔板中,每孔100 μL,并設(shè)LPS組、空白對照組和給藥組。待細(xì)胞貼壁后,LPS組加入LPS(1 μg/mL),空白對照組每孔加入0.1 μL的DMSO,給藥組加入10 μmol/L單體化合物,37 ℃孵育1 h后,加入LPS(1 μg/mL),繼續(xù)培養(yǎng)24 h;收取100 μL細(xì)胞上清液,與100 μL Griess試劑等體積混合,室溫孵育10 min,記錄各孔在540 nm處的吸光度值(OD值)。按照公式:抑制率=(OD樣品-OD空白)/(ODLPS-OD空白)×100%,計算NO生成抑制率。

1.3.2.3 細(xì)胞活力的檢測

采用CCK-8法[9]測定化合物對細(xì)胞增殖的影響。收取100 μL細(xì)胞上清液用于測定NO的釋放后,將10 μL的CCK8溶液加入每個孔,37 ℃孵育1 h后,使用酶標(biāo)儀在450 nm波長處記錄每個孔的吸光度。

2 實驗結(jié)果

2.1 化合物的結(jié)構(gòu)鑒定

表1 化合物1的1H NMR和13C NMR數(shù)據(jù)(400和100 MHz,CDCl3)Table 1 1H NMR和13C NMR data for compound 1 (400 and 100 MHz,CDCl3)

1H NMR譜高場區(qū)域顯示了分子中4個甲基單峰[δH0.82(3H,s,H-17),1.03(3H,s,H-19),1.56(3H,s,H-24),1.65(3H,s,H-25)]、1個甲基雙峰[δH0.86(3H,d,J= 6.8 Hz,H-18)]以及1個活潑氫[δH4.68(1H,br s,16-OH)]信號的存在;低場區(qū)域顯示3個烯烴質(zhì)子[δH5.42(1H,t,J= 5.4 Hz,H-1),5.79(1H,s,H-14),5.01(1H,t,J= 6.4 Hz,H-22)]信號。13C NMR和DEPT譜中共顯示有25個碳信號,包括6個季碳,6個次甲基碳,8個亞甲基碳以及5個甲基碳,其中包括1個羰基碳(δC171.9),3個烯烴季碳(δC171.5,145.1,131.8),3個烯烴次甲基碳(δC124.9,118.6,116.9),1個連氧次甲基碳(δC99.5)。1個羰基和3個雙鍵占據(jù)了4個不飽和度,提示分子中三環(huán)結(jié)構(gòu)的存在。

查閱文獻(xiàn)[8]發(fā)現(xiàn),化合物1與已知化合物dactylospene C的核磁數(shù)據(jù)基本一致,不同的是與化合物dactylospene C相比,化合物1缺少了一個碳信號(δC56.5)和一個氫信號[δH3.50(3H,s,16-OCH3)],同時C-16的碳譜化學(xué)位移值由化合物dactylospene C中的δC104.4向高場位移至化合物1中的δC99.5,C-16的氫譜化學(xué)位移值由化合物dactylospene C中的δH5.61(1H,s,H-16)向低場位移至化合物1中的δH5.92(1H,s,H-16),推測可能是由于C-16位的取代基不同導(dǎo)致的。結(jié)合化合物1的HR-EI-MS、1H NMR和13C NMR,確定化合物1的C-16位的取代基是羥基而不是化合物dactylospene C中的甲氧基。同時,一組碳信號δC171.9(C-15),171.5(C-13),116.9(C-14)以及99.5(C-16),以及H-16與C-13/C-14/C-15,H-14與C-13/C-15/C-16的HMBC相關(guān)可以進(jìn)一步證實α,β-不飽和-γ-羥基-γ-內(nèi)酯結(jié)構(gòu)單元的存在。由上述信息,最終確定了化合物1的平面結(jié)構(gòu),如圖1所示。

圖1 化合物1的1H-1H COSY和關(guān)鍵HMBC相關(guān)Fig.1 1H-1H COSY and HMBC correlations of compound 1

化合物1的相對構(gòu)型是通過NOSEY譜確定的(見圖2)。在NOESY譜中,H-5與H3-18、H-20a有NOESY相關(guān),可知這些氫是處于同一平面。H-8與H3-19有NOESY相關(guān),表明這些氫是處于另一平面的?；衔?的絕對構(gòu)型是通過CD譜確定的。化合物1在205 nm左右處正Cotton效應(yīng),在250 nm左右處正Cotton效應(yīng)(如圖3所示),與已知化合物dactylospene C一致,因此確定化合物1的絕對構(gòu)型為4R,5S,8R,9R,16S?；衔?的詳細(xì)結(jié)構(gòu)鑒定數(shù)據(jù)原始圖譜可從本刊官網(wǎng)免費(fèi)下載(www.trcw.ac.cn)。

圖2 化合物1的關(guān)鍵NOESY相關(guān)Fig.2 Key NOESY correlations of compound 1

圖3 化合物1的CD譜圖Fig.3 The CD spectrum of compound 1

化合物2白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z445.29 [M + H]+,分子式為C27H40O5。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:6.80(1H,d,J= 2.8 Hz,H-16),5.67(d,J= 5.0 Hz,H-25),4.90(1H,br s,H-12),2.09(3H,s,CH3CO),0.93(3H,s,H-21),0.85(3H,s,H-22),0.84(3H,s,H-19),0.81(3H,s,H-20),0.80(3H,s,H-23);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.6(C-1),18.0(C-2),41.4(C-3),33.2(C-4),56.4(C-5),18.5(C-6),41.9(C-7),37.9(C-8),52.5(C-9),37.3(C-10),22.3(C-11),74.6(C-12),36.9(C-13),49.9(C-14),24.1(C-15),135.3(C-16),128.1(C-17),50.8(C-18),33.3(C-19),21.4(C-20),16.3(C-21),16.0(C-22),15.1(C-23),167.9(C-24),98.9(C-25),171.1(CH3CO),21.4(CH3CO)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[10]報道一致,鑒定化合物2為scalarin。

化合物3白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z521.34 [M + Na]+,分子式為C31H46O5。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.60(1H,br t,J= 2.4 Hz,H-12),4.77(1H,dd,J= 13.0,6.6 Hz,H-24),4.09(1H,m,H-3′),1.35(3H,d,J= 7.0 Hz,H-26),1.18(3H,d,J= 7.0 Hz,H-4′),1.17(3H,s,H-23),1.09(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.87(3H,s,H-21),0.79(3H,s,H-22),0.58(1H,dd,J= 8.6,4.5 Hz,H-19b),0.47(1H,t,J= 5.0 Hz,H-19a);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.9(C-1),21.6(C-2),33.5(C-3),22.9(C-4),50.5(C-5),17.9(C-6),40.5(C-7),37.9(C-8),51.6(C-9),37.7(C-10),21.6(C-11),74.9(C-12),38.6(C-13),51.4(C-14),17.0(C-15),24.4(C-16),164.4(C-17),132.9(C-18),13.8(C-19),13.6(C-20),17.1(C-21),13.8(C-22),21.3(C-23),77.9(C-24),171.1(C-25),18.6(C-26),13.2(C-27),171.7(C-1′),41.7(C-2′),64.9(C-3′),22.5(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[11]報道一致,鑒定化合物3為 honulactone A。

化合物4白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z521.34 [M + Na]+,分子式為C31H46O5。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.59(1H,br t,J= 2.4 Hz,H-12),4.77(1H,d,J= 7.6 Hz,H-24),4.10(1H,m,H-3′),1.35(3H,d,J= 7.2 Hz,H-26),1.18(3H,d,J=7.0 Hz,H-4′),1.17(3H,s,H-23),1.10(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.87(3H,s,H-21),0.79(3H,s,H-22),0.58(1H,dd,J= 8.6,4.5 Hz,H-19b),0.48(1H,t,J= 5.0 Hz,H-19a);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.8(C-1),21.2(C-2),33.4(C-3),22.6(C-4),50.2(C-5),17.5(C-6),40.3(C-7),37.8(C-8),51.4(C-9),37.5(C-10),21.3(C-11),74.7(C-12),38.5(C-13),51.5(C-14),16.6(C-15),24.3(C-16),164.1(C-17),132.8(C-18),13.7(C-19),13.4(C-20),17.0(C-21),13.9(C-22),21.4(C-23),78.1(C-24),171.3(C-25),18.6(C-26),13.0(C-27),171.1(C-1′),43.4(C-2′),64.2(C-3′),22.5(C-4′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致,鑒定化合物4為 honulactone B。

化合物5白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z535.32 [M + Na]+,分子式為C32H48O5。1H NMR(600MHz,CDCl3)δ:5.59(1H,br t,J= 2.6 Hz,H-12),4.78(1H,dd,J=13.2,6.4 Hz,H-24),4.10(1H,m,H-3′),3.06(1H,br s,HO-3′),1.37(3H,d,J= 7.0 Hz,H-26),1.17(3H,s,H-23),1.08(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.93(3H,t,J= 7.5 Hz,H-5′),0.88(3H,s,H-21),0.79(3H,s,H-22),0.58(1H,dd,J= 8.8,4.5,Hz,H-19b),-0.47(1H,dd,J= 4.5,5.6 Hz,H-19a);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.8(C-1),21.1(C-2),32.9(C-3),22.7(C-4),49.9(C-5),17.5(C-6),40.2(C-7),37.7(C-8),51.4(C-9),37.2(C-10),21.1(C-11),74.6(C-12),38.5(C-13),51.2(C-14),16.8(C-15),24.1(C-16),164.2(C-17),132.8(C-18),13.6(C-19),13.4(C-20),16.9(C-21),13.8(C-22),21.5(C-23),77.9(C-24),171.8(C-25),18.8(C-26),13.2(C-27),172.1(C-1′),41.7(C-2′),64.5(C-3′),22.3(C-4′),10.1(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致,鑒定化合物5為honulactone E。

化合物6白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z535.32 [M + Na]+,分子式為C32H48O5。1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:5.59(1H,br t,J= 2.6 Hz,H-12),4.77(1H,q,J= 7.4 Hz,H-24),3.98(1H,m,H-3′),2.99(1H,s,HO-3′),1.36(3H,d,J= 7.0 Hz,H-26),1.18(3H,s,H-23),1.08(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.93(3H,t,J= 7.5 Hz,H-5′),0.88(3H,s,H-21),0.79(3H,s,H-22),0.57(1H,dd,J= 8.8,4.1 Hz,H-19),-0.49(1H,t,J= 5.2 Hz,H-19);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:39.8(C-1),21.1(C-2),33.1(C-3),22.6(C-4),50.2(C-5),17.4(C-6),39.9(C-7),37.9(C-8),51.4(C-9),37.2(C-10),21.0(C-11),74.7(C-12),38.5(C-13),51.4(C-14),16.5(C-15),24.3(C-16),164.2(C-17),132.8(C-18),13.7(C-19),13.5(C-20),16.8(C-21),13.9(C-22),21.4(C-23),78.1(C-24),171.7(C-25),18.7(C-26),13.2(C-27),172.3(C-1′),41.7(C-2′),64.4(C-3′),22.3(C-4′),10.1(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致,鑒定化合物6為honulactone F。

化合物7白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z573.38 [M + H]+,分子式為C34H53O7。1H NMR(600 MHz,CDCl3)δ:5.61(1H,br t,J= 3.2 Hz,H-12),5.35(1H,q,J= 7.2 Hz,H-20),4.76(1H,q,J= 7.0 Hz,H-24),3.79(1H,m,H-3′),2.95(1H,s,HO-3′),2.04(3H,s,CH3CO),1.36(3H,d,J= 8.6 Hz,H-26),1.18(3H,s,H-23),1.07(3H,d,J= 8.4 Hz,H-27),0.95(3H,s,H-19),0.93(3H,t,J=8.4 Hz,H-5′),0.87(3H,s,H-21),0.86(3H,s,H-22);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:40.2(C-1),17.7(C-2),38.9(C-3),39.1(C-4),59.0(C-5),20.1(C-6),42.2(C-7),37.5(C-8),53.6(C-9),37.3(C-10),21.0(C-11),74.4(C-12),38.4(C-13),50.9(C-14),16.9(C-15),24.0(C-16),163.8(C-17),132.5(C-18),23.0(C-19),73.0(C-20),16.7(C-21),16.4(C-22),21.2(C-23),77.8(C-24),171.5(C-25),18.4(C-26),15.9(C-27),170.1(CH3CO),21.9(CH3CO),172.1(C-1′),41.7(C-2′),69.3(C-3′),29.2(C-4′),10.0(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致,鑒定化合物7為honulactone I。

化合物8白色粉末,易溶于二氯甲烷;ESI-MS:m/z573.38 [M + H]+,分子式為C34H53O7。1H NMR (600 MHz,CDCl3)δ:5.58(1H,br t,J= 3.4 Hz,H-12),5.36(1H,q,J= 7.4 Hz,H-20),4.77(1H,q,J= 8.0 Hz,H-24),3.79(1H,m,H-3′),2.95(1H,s,HO-3′),2.03(3H,s,CH3CO),1.37(3H,d,J= 6.6 Hz,H-26),1.19(3H,s,H-23),1.08(3H,d,J= 6.4 Hz,H-27),0.95(3H,s,H-19),0.92(3H,t,J= 11.4 Hz,H-5′),0.86(3H,s,H-21),0.85(3H,s,H-22);13C NMR(150 MHz,CDCl3)δ:40.3(C-1),17.7(C-2),39.0(C-3),39.1(C-4),59.0(C-5),20.0(C-6),42.3(C-7),37.5(C-8),53.6(C-9),37.3(C-10),21.0(C-11),74.4(C-12),38.4(C-13),50.9(C-14),16.8(C-15),24.0(C-16),163.8(C-17),132.5(C-18),23.1(C-19),73.0(C-20),16.7(C-21),16.4(C-22),21.3(C-23),78.1(C-24),171.4(C-25),18.5(C-26),15.9(C-27),170.2(CH3CO),21.9(CH3CO),171.9(C-1′),41.6(C-2′),69.4(C-3′),29.1(C-4′),10.0(C-5′)。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[12]報道一致,鑒定化合物8為honulactone J。

化合物1～8的結(jié)構(gòu)式見圖4。

圖4 化合物1～8的結(jié)構(gòu)式Fig.4 Structures of compounds 1-8

2.2 生物活性測試

測定了化合物對脂多糖LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7細(xì)胞NO釋放的抑制作用,結(jié)果顯示,在10 μmol/L時,化合物1具有顯著的抗炎活性,抑制率為65.5%,化合物3和4具有較好的抗炎活性,抑制率為48.5% 和46.0%,且化合物1、3和4對小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7無細(xì)胞毒性,抑制率分別為0.8%、4.0%和1.8%。其他化合物均為無活性。

3 結(jié)論

本文對中國南海永興島的海綿D.elegans的化學(xué)成分進(jìn)行了研究,分離得到8個該屬海綿罕見的二倍半萜類化合物,化合物1為新化合物,化合物2～8為首次從該海綿中分離得到?；衔?～8為Scalarane型二倍半萜類化合物,文獻(xiàn)報道該類化合物主要從Hyatellasp、Phyllospongiasp.、Dysideasp.、Lendenfeldiasp.等海綿中分離得到[13],首次從D.elegans海綿分離得到的Scalarane型二倍半萜可能與這幾種海綿的食物鏈或者共附生微生物有關(guān)。測定了8種化合物對脂多糖LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW 264.7釋放NO的抑制率,為了避免在抗炎評價過程中使用被試驗化合物的對RAW 264.7細(xì)胞的細(xì)胞毒性,同時進(jìn)行了CCK-8檢測,結(jié)果顯示,化合物1、3、4在10 μmol/L時具有較好的NO抑制作用,抑制率分別為65.5%,48.5%和46.0%,且對RAW 264.7細(xì)胞無細(xì)胞毒性。這些化合物可能在抗炎治療中具有潛在的價值,但參與抗炎作用的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。