榮小婷,何文妮,郭 哲,李鑫鑫,王 璐,高 坤,余利巖*,張 濤*

1 中國醫(yī)學科學院 &北京協(xié)和醫(yī)學院醫(yī)藥生物技術研究所,北京 100050;2 江蘇科技大學生物技術學院,鎮(zhèn)江 212100

葡萄穗霉屬真菌(Stachybotrys)隸屬于葡萄穗霉科(Stachybotryaceae),多營腐生或弱寄生生活,廣泛存在于土壤、植物和潮濕的室內環(huán)境[1]。該屬真菌產生的次級代謝產物結構類型豐富,包括單端孢霉烯類(trichothecenes)、二萜類、phenylspirodrimanes(PSM)類、聚酮類、氧雜蒽酮類、環(huán)肽類和細胞松弛素類(alachalasins)等[2,3]。這些化合物在抗腫瘤、抗菌、抗瘧疾、抗病毒、抑制膽固醇酯酶和抗炎等方面具有顯著的生物學活性[3-6]。近年來,葡萄穗霉屬來源的結構新穎的活性化合物分子仍然不斷被分離報道。Li等[7]從海綿中分離的紙葡萄穗霉(S.chartarum)WGC-25C-6中分離鑒定到單端孢霉烯類化合物。其中,mytoxinA和satratoxin G等化合物對HCT-11 6,HepG2,BGC-823等細胞株具有顯著的抗腫瘤活性,其IC50< 0.01 μmol/L。Yang等[8]從海洋來源的紙葡萄穗霉菌J403-SS6中鑒定6個二萜化合物,atranone Q對致病菌包括白色念珠菌和糞腸球菌具有顯著的抑制作用,MIC值分別為8和16 μg/mL。

PSM類化合物家族龐大,自1980年Miyazaki等[9]在葡萄穗霉菌S.complementi中分離得到補體抑制劑K-76,已有近120余個PSM類化合物分子被分離鑒定。Ma等[4]從S.chartarumMXH-X73中分離獲得11個PSM類單體化合物,研究表明stachybotrin D能夠抑制野生型HIV-1和非核苷類逆轉錄酶抑制劑(NNRTIs)耐受型HIV(如HIV-1RT-K103N等),EC50值為6.2～23.8 μmol/L。Liu等[10]從S.chartarumCGMCC 3.5365中分離獲得11個PSM類二聚體分子(bistachybotrysins L～V),其中,化合物bistachybotrysin L對HepG2,HCT-116和NCI-H460等細胞株具有顯著的抑瘤活性,IC50為1.8～3.5 μmol/L。

本研究選取內生真菌Stachybotryssp.CPCC 401591進行深入研究。結合OSMAC技術、LC-MS/MS質譜分子網絡分析和PSM類化合物紫外吸收特征對菌株CPCC 401591的大米固體發(fā)酵產物的乙酸乙酯相分離純化。同時,結合人肝癌細胞株HepG2等腫瘤細胞篩選模型,以期從該菌株中挖掘分離抗腫瘤活性分子。研究表明,葡萄穗霉真菌CPCC 401591能夠產生PSM類化合物,是一株值得深入研究的資源菌。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器與試劑

安捷倫1290高效液相色譜分析儀器(美國Agilent公司);600M NMR Spectrometer(TMS為內標,德國Bruker公司);Thermo Scientific LTQ XL ESI質譜儀(美國Thermo公司);SepaFlashTM硅膠快速分離柱購自常州三泰科技有限公司;C18spherical反相分離柱購自美國Agela公司。甲醇、二氯甲烷、乙酸乙酯等均為分析純(北京通廣精細化工公司);色譜純乙腈和甲醇購自德國Merck公司;三氟乙酸、氘代甲醇等購自北京百靈科技有限公司。

1.1.2 菌株來源

菌株Stachybotryssp.CPCC 401591為葡萄穗霉屬真菌,現(xiàn)保存于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。人肝癌細胞株HepG2、人宮頸癌細胞株HeLa以及人結腸癌細胞株HCT116均購自中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所細胞資源中心,現(xiàn)保存于中國藥學微生物菌種保藏管理中心。

1.1.3 試劑與配制

麥芽提取物肉湯瓊脂培養(yǎng)基(MEPA):麥芽提取物肉湯15 g,1.5 g黃豆粉,20 g瓊脂粉,1 L蒸餾水,MEB培養(yǎng)基購自美國BD公司。F2培養(yǎng)基:葡萄糖 2 g,甘油1 mL,黃豆粉0.2 g,蔗糖1 g,蛋白胨1 g,聚乙二醇0.25 g,K2HPO40.03 g,NaNO30.3 g,(NH4)2SO40.2 g,100 mL蒸餾水。BY培養(yǎng)基:馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基3 g,甘露醇1 g,麥芽糖1 g,酵母提取物1 g,K2HPO40.3 g,MgSO4.7H2O 0.03 g,海鹽1 g,100 mL蒸餾水。PDB:馬鈴薯葡萄糖水培養(yǎng)基(BD公司)3 g,100 mL蒸餾水。大米發(fā)酵培養(yǎng)基(RICE):大米100 g,去離子水100 mL,121 ℃滅菌25 min。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌株的發(fā)酵

將菌株CPCC 401591從甘油管中接種于MEPA平板培養(yǎng)基,于28 ℃恒溫培養(yǎng)7 d,用無菌接種環(huán)挑取適量菌體接種于種子培養(yǎng)基(200 mL PDB培養(yǎng)基/500 mL三角瓶)中,28 ℃震蕩培養(yǎng)96 h得到種子液(180 r/min)。將種子液5 mL接種至滅菌后的大米發(fā)酵培養(yǎng)基中,28 ℃靜置培養(yǎng)30 d,共發(fā)酵100瓶。

1.2.2 色譜及質譜條件

Agilent- ZORBAX SB C18色譜柱(4.6 nm × 250 mm,5 μm);體積流量1 mL/min;PDA全波長掃描;柱溫30 ℃;進樣量10 μL。以為流動相乙腈(A)和1.5%甲酸水溶液(B),梯度洗脫:0～20 min,10%→100% A;20.01～25.00 min,100%A;25.01～30.00 min,10% A。

采用電噴霧離子化源(ESI),正離子掃描模式,MS條件:離子噴霧電壓:4 500 V;離子源溫度:550 ℃;碰撞能量:45 eV;擴散碰撞能量:15 eV;去簇電壓:100 V;霧化器壓力:379 kPa;輔助氣壓力:379 kPa;氣簾氣壓力:241 kPa;掃描范圍m/z150～2 000。

1.2.3 菌株CPCC 401591天然產物分子網絡的建立

按照色譜及質譜條件進樣,質譜儀采集樣品的二級質譜,獲得正離子模式下葡萄穗霉菌Stachybotryssp.CPCC 401591乙酸乙酯粗提物的Q-TOF-MS/MS二級質譜文件。將原始數據通過ProteoWizard軟件轉化為mzXML格式并上傳至GNPS平臺(https://gnps.ucsd.edu),進行分子網絡聚類分析,結合開放數據庫對生成的分子網絡中的化合物進行推測與分析。

1.2.4 化合物的提取和分離

發(fā)酵產物用等體積乙酸乙酯萃取3次,減壓濃縮得到浸膏(80 g)。將80 g浸膏以1∶1的比例用200-300目硅膠填充至樣品柱,以二氯甲烷-甲醇體系進行梯度洗脫(洗脫條件100∶0→95∶5→90∶10→85∶15→80∶20→75∶25→70∶30→65∶35→60∶40→55∶45→50∶50→45∶55→40∶60→0∶100),流速為50 mL/min。每個梯度250 mL收集1瓶,對所有收集的流分經TLC薄層色譜分析后合并,共收集10個流分(A1～A10)。根據HPLC-DAD指紋圖譜和PSM類化合物紫外吸收特征,選取流分A13,A12和A14進行分離純化。流分A13(0.62 g)經半制備高效液相色譜(pHPLC),流動相為乙腈-水(45∶55+0.01% TFA;3 mL/min),分離得到化合物1(8.3 mg,tR= 6.2 min),化合物2(21.5 mg,tR= 6.7 min)和化合物3(9.1 mg,tR7.7 = min)。流分A12(0.5 g)繼續(xù)采用pHPLC制備,流動相為乙腈-水(40∶60+0.01% TFA;3 mL/min),純化得到化合物4(2.4 mg,tR21.3 = min),化合物5(21.0 mg,tR31.7 = min)。流分A14(1.0 g)利用中壓快速液相色譜,流動相為乙腈-水梯度洗脫(0～15 min,15∶85;15∶85→40∶60,40 min;40∶60→90∶10,30 min;90∶10→100∶0,10 min;100∶0,15 min;流速為20 mL/min),共收集洗脫液16瓶(B1～ B16)。 流分B6 采用半制備型HPLC制備,流動相乙腈-水(37∶63+0.01% TFA;3 mL/min),分離得到化合物6(4.2 mg,tR= 11.8 min);化合物7(3.6 mg,tR= 14.6 min)。流分B9繼續(xù)采用半制備型HPLC制備,流動相為乙腈-水(45∶55+0.01% TFA;3 mL/min),純化得到化合物8(11.2 mg,tR= 14.6 min)。

1.2.5 CCK-8檢測化合物的細胞毒活性

將儲存于-80 ℃的細胞復蘇,體外培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基,5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)。HepG2,HCT116和HeLa細胞以5×104個/mL接種于96孔細胞培養(yǎng)板,每孔體積100 μL,同時96孔細胞培養(yǎng)板的邊緣孔以無菌PBS緩沖液填充,盡量避免邊緣效應。待24 h后加藥(待測樣品通過DMSO溶解稀釋分別為5個濃度梯度)。不同梯度的待測樣品加入96孔板,各個濃度均做3個復孔,并設置等量DMSO的對照組和無細胞僅含培養(yǎng)基的空白組,順鉑處理組為陽性對照組。將培養(yǎng)板板置于5% CO2、37 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h,每孔加入20 μL CCK-8溶液,于細胞培養(yǎng)箱37 ℃繼續(xù)孵育2 h。經酶聯(lián)免疫檢測OD450測量各孔的吸光值,按下式計算抑制率。

細胞抑制率=

(OD對照組-OD實驗組)/(OD對照組-OD空白組)× 100%

對照組:具有細胞、CCK-8溶液但不加藥物;實驗組:具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液;空白組:含CCK-8溶液,不含細胞和藥物。

2 實驗結果

2.1 OSMAC策略優(yōu)化菌株Stachybotrys sp.CPCC 401591發(fā)酵培養(yǎng)基

OSMAC策略廣泛應用于微生物次級代謝產物挖掘和發(fā)現(xiàn),也是應用最為廣泛且成熟的方法[11,12]。葡萄穗霉菌Stachybotryssp.CPCC 401591在4種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中次級代謝產物化學多樣性分析結果如圖1所示。HPLC分析280 nm檢測條件下,三種液體發(fā)酵培養(yǎng)基(PDB、BY和F2)化合物出峰時間多集中于5～13 min,大米發(fā)酵培養(yǎng)基主要集中在10～18 min。同時,菌株CPCC 401591大米固體發(fā)酵物代謝譜更為豐富,且代謝物產量更大(圖1A、1B)。進一步分析大米發(fā)酵提取物中一類化合物的紫外吸收特征(230、285、330 nm)(見圖1A)。為此,選取大米發(fā)酵培養(yǎng)基作為菌株CPCC 401591大規(guī)模發(fā)酵的培養(yǎng)基開展后續(xù)化合物分離純化工作。

圖1 Stachybotrys sp.CPCC 401591在四種不同發(fā)酵培養(yǎng)基中的代謝譜分析Fig.1 Metabolic spectrum analysis of Stachybotrys sp.CPCC 401591 on four different fermentation media注:A1:280 nm波長下檢測的色譜圖差異;B:ELSD檢測差異;A2:A1圖中紅框內化合物紫外吸收圖譜。Note:A1:The differences of detection by measuring UV absorbance spectra at 280 nm;B:The differences of detection by measuring ELSD;A2:UV absorption spectra of the compounds shown in red box of Fig.A1.

2.2 菌株Stachybotrys sp.CPCC 401591大米發(fā)酵提取物的GNPS分析

為分析菌株CPCC 401591的次級代謝產物并挖掘其潛在的新成分,采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜(LC-MS/MS)結合分子網絡GNPS策略,對粗提物的成分進行快速表征。基于MS/MS光譜的相似性,菌株大米發(fā)酵粗提物的可視化分子網絡聚簇被建立。其中,1個明顯的分子籠中,在正離子模式下,該簇內共包含了13個節(jié)點。其相對分子質量范圍在m/z209.108～540.520 之間,結構涉及PSM類化合物分子(見圖2)。特別地,通過文獻報道和數據庫分析,節(jié)點m/z386.962和430.857分別被鑒定為chartarlactam F和stachybotrin或其同分異構體[13]。同時,PSM類分子籠中還有一些分子量(520.56和524.68等)未見報道[3],提示我們這些化合物可能是新的PSM類化合物。

圖2 PSM類化合物分子網絡聚簇分析Fig.2 GNPS-based cluster of the PSM derivatives

2.3 結構鑒定

化合物1橘色粉末;ESI-MS:m/z430.4[M+H]+,分子式為C25H35NO5;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.40(1H,s,H-3′),4.47(2H,s,H-7′),3.79(2H,t,J= 5.6 Hz,H-2′′),3.66(2H,t,J= 5.6 Hz,H-1′′),3.28(1H,m,H-3),3.18(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.76(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.23(1H,dd,J= 12.4,2.7 Hz,H-5),2.02(1H,m,H-2b),1.85(1H,m,H-8),1.76(1H,m,H-1b),1.68(1H,m,H-7b),1.65(1H,m,H-6b),1.61(1H,m,H-6a),1.58(1H,m,H-7a),1.55(1H,m,H-2a),1.14(1H,m,H-1a),1.09(3H,s,H-15),1.04(3H,s,H-14),0.95(3H,s,H-13),0.72(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:25.3(C-1),26.3(C-2),77.3(C-3),38.8(C-4),41.2(C-5),22.3(C-6),32.0(C-7),38.8(C-8),100.8(C-9),43.3(C-10),32.2(C-11),15.9(C-12),23.5(C-13),28.7(C-14),16.6(C-15),114.4(C-1′),158.6(C-2′),102.6(C-3′),146.2(C-4′),107.1(C-5′),159.9(C-6′),52.8(C-7′),170.3(C-8′),45.9(C-1′′),61.4(C-2′′)。以上數據與文獻[14]中報道一致,因此鑒定化合物1為chartarlactam H。

化合物2黃色粉末;ESI-MS:m/z386.4 [M+H]+,分子式為C23H31NO4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.35(1H,s,H-3′),4.27(2H,s,H-7′),3.25(1H,m,H-3),3.18(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.76(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.20(1H,dd,J= 3.0,12.4 Hz,H-5),1.96(1H,m,H-2b),1.83(1H,m,H-8),1.81(1H,m,H-1b),1.68(1H,m,H-7b),1.65(1H,m,H-6b),1.60(1H,m,H-7a),1.59(1H,m,H-6a),1.55(1H,m,H-2a),1.13(1H,m,H-1a),1.05(3H,s,H-15),1.00(3H,s,H-14),0.90(3H,s,H-13),0.68(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:25.3(C-1),26.2(C-2),77.2(C-3),38.9(C-4),41.2(C-5),22.2(C-6),32.0(C-7),38.8(C-8),100.8(C-9),43.3(C-10),32.2(C-11),15.9(C-12),23.5(C-13),28.7(C-14),16.7(C-15),114.4(C-1′),159.0(C-2′),102.8(C-3′),148.6(C-4′),106.7(C-5′),160.3(C-6′),46.9(C-7′),173.2(C-8′)。以上數據與文獻中[14]報道一致,因此鑒定化合物2為chartarlactam F。

化合物3黃色粉末;ESI-MS:m/z430.5 [M+H]+,分子式為C25H35NO5;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.67(1H,s,H-3′),4.57(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.42(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),3.79(2H,t,J= 5.7 Hz,H-2′′),3.69(2H,t,J= 5.7 Hz,H-1′′),3.33(1H,m,H-3),3.23(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.84(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.14(1H,m,H-5),2.03(1H,m,H-2b),1.85(1H,m,H-1b),1.84(1H,m,H-8),1.58(2H,m,H-7),1.56(2H,m,H-6),1.55(1H,m,H-2a),1.06(1H,m,H-1a),1.05(3H,s,H-15),0.98(3H,s,H-14),0.90(3H,s,H-13),0.73(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:25.4(C-1),26.0(C-2),76.5(C-3),38.6(C-4),41.4(C-5),22.1(C-6),32.3(C-7),38.4(C-8),99.7(C-9),43.5(C-10),33.0(C-11),15.9(C-12),23.0(C-13),29.0(C-14),16.5(C-15),118.8(C-1′),155.2(C-2′),102.1(C-3′),134.6(C-4′),114.2(C-5′),7.69(C-6′),171.4(C-7′),48.3(C-8′),46.3(C-1′′),61.3(C-2′′)。以上數據與文獻[15]中報道一致,因此鑒定化合物3為stachybotrin。

化合物4白色粉末;ESI-MS:m/z444.4 [M+H]+,分子式為C25H33NO6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.65(1H,s,H-3′),4.82(1H,m,H-3),4.47(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.31(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),4.07(1H,m,H-2),3.30(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.94(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.09(3H,s,H-2′′),1.92(1H,H-5),1.87(1H,m,H-8),1.76(1H,m,H-1b),1.59(1H,m,H-6b),1.55(1H,m,H-7b),1.50(1H,m,H-6a),1.49(1H,m,H-7a),1.41(1H,dd,J= 4.6,12.5 Hz,H-1a),1.14(3H,s,H-15),1.01(3H,s,H-14),0.93(3H,s,H-13),0.80(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:34.7(C-1),65.8(C-2),81.5(C-3),39.2(C-4),41.7(C-5),21.1(C-6),32.2(C-7),37.7(C-8),99.3(C-9),44.8(C-10),32.1(C-11),15.8(C-12),22.1(C-13),28.4(C-14),17.3(C-15),116.3(C-1′),155.5(C-2′),102.3(C-3′),134.9(C-4′),116.3(C-5′),157.5(C-6′),173.9(C-7′),44.8(C-8′),172.9(C-1′′),21.6(C-2′′)。以上數據與文獻[14]中報道一致,因此鑒定化合物4為chartarlactam K。

化合物5白色粉末;ESI-MS:m/z386.5[M+H]+,分子式為C23H31NO4;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.73(1H,s,H-3′),4.46(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.30(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),3.33(1H,m,H-3),3.27(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.87(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.17(1H,dd,J= 3.0,12.4 Hz,H-5),1.95(1H,m,H-2b),1.86(1H,m,H-8),1.85(1H,m,H-1b),1.66(1H,m,H-7b),1.65(1H,m,H-6b),1.60(1H,m,H-7a),1.59(1H,m,H-6a),1.57(1H,m,H-2a),1.12(1H,m,H-1a),1.09(3H,s,H-15),1.01(3H,s,H-14),0.91(3H,s,H-13),0.77(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:25.4(C-1),26.0(C-2),76.5(C-3),38.6(C-4),41.3(C-5),43.5(C-6),32.3(C-7),38.4(C-8),99.7(C-9),22.1(C-10),33.0(C-11),16.0(C-12),29.0(C-13),23.0(C-14),16.5(C-15),119.0(C-1′),157.8(C-2′),116.7(C-3′),134.7(C-4′),102.1(C-5′),155.2(C-6′),174.1(C-7′),43.9(C-8′)。以上數據與文獻[16]中道一致,因此鑒定化合物5為stachybotrylactam。

化合物6白色粉末;ESI-MS:m/z402.4[M+H]+,分子式為C23H31NO5;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.70(1H,s,H-3′),4.42(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.29(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),3.99(1H,m,H-2),3.29(1H,m,H-3),3.29(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.92(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),1.90(1H,H-5),1.87(1H,m,H-8),1.78(1H,m,H-1b),1.59(1H,m,H-7a),1.59(1H,m,H-6b),1.55(1H,m,H-7b),1.52(1H,m,H-6a),1.32(1H,dd,J= 12.5,4.6 Hz,H-1a),1.10(3H,s,H-15),1.05(3H,s,H-14),0.89(3H,s,H-13),0.76(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:33.1(C-1),67.2(C-2),79.7(C-3),39.5(C-4),40.6(C-5),21.8(C-6),32.2(C-7),38.0(C-8),99.4(C-9),44.7(C-10),34.0(C-11),15.9(C-12),29.3(C-13),22.5(C-14),17.4(C-15),118.8(C-1′),155.3(C-2′),102.2(C-3′),134.8(C-4′),116.7(C-5′),157.6(C-6′),174.0(C-7′),43.9(C-8′)。以上數據與文獻中[2]報道一致,因此鑒定化合物6為chartarlactam J。

化合物7白色粉末;ESI-MS:m/z488.5 [M+H]+,分子式為C27H37NO7;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.65(1H,s,H-3′),4.47(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.31(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),3.95(1H,m,H-2),3.67(1H,m,H-1b′′),3.59(1H,m,H-1a′′),3.32(1H,m,H-3),3.25(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.87(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.05(1H,H-5),1.98(2H,m,H-2′′),1.86(1H,m,H-8),0.75(3H,d,J= 6.6Hz,H-12),1.75(1H,m,H-1b),1.60(1H,m,H-7b),1.60(1H,m,H-3b′′),1.55(1H,m,H-6b),1.52(1H,m,H-7a),1.52(1H,m,H-3b′′),1.48(1H,m,H-6a),1.31(1H,dd,J= 4.6,12.5 Hz,H-1a),1.09(3H,s,H-15),1.04(3H,s,H-14),0.91(3H,s,H-13);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:34.0(C-1),67.2(C-2),79.7(C-3),39.5(C-4),40.7(C-5),21.8(C-6),32.2(C-7),38.0(C-8),99.4(C-9),44.7(C-10),33.1(C-11),15.9(C-12),22.6(C-13),29.3(C-14),17.4(C-15),118.6(C-1′),155.3(C-2′),102.2(C-3′),135.0(C-4′),114.3(C-5′),157.4(C-6′),171.2(C-7′),48.5(C-8′),43.1(C-1′′),24.8(C-2′′),32.2(C-3′′),176.6(C-4′′)。為進一步確定2,3位的構型,通過鉬試劑誘導CD(Snatzke法)[17]進行驗證,如圖3所示,在310 nm附近為負Cotton效應,2位和3位羥基均為S構型。以上數據與文獻[18]中報道一致,因此鑒定化合物7為Mer-VGF724B。

圖3 化合物7的CD圖譜Fig.3 The CD spectrum of compound 7

化合物8淺黃色粉末;ESI-MS:m/z458.5[M+H]+,分子式為C26H35NO6;1H NMR(600 MHz,CD3OD)δ:6.68(1H,s,H-3′),4.95(1H,q,J= 6.6 Hz,H-1′′),4.56(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8b′),4.37(1H,d,J= 17.1 Hz,H-8a′),3.35(1H,br,s,H-3),3.23(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11b),2.83(1H,d,J= 16.2 Hz,H-11a),2.13(1H,H-5),1.97(1H,m,H-2b),1.86(1H,m,H-1b),1.86(1H,m,H-8),1.60(1H,d,J= 6.6 Hz,H-3′′),1.53(1H,m,H-2a),1.53(2H,m,H-6),1.52(2H,m,H-7),1.09(1H,m,H-1a),1.06(3H,s,H-15),0.97(3H,s,H-14),0.88(3H,s,H-13),0.73(3H,d,J= 6.6 Hz,H-12);13C NMR(150 MHz,CD3OD)δ:25.4(C-1),26.0(C-2),76.4(C-3),38.6(C-4),41.4(C-5),22.1(C-6),32.2(C-7),38.5(C-8),99.8(C-9),43.5(C-10),33.0(C-11),15.9(C-12),23.0(C-13),29.0(C-14),16.6(C-15),119.1(C-1′),155.2(C-2′),102.1(C-3′),134.6(C-4′),114.7(C-5′),157.6(C-6′),171.4(C-7′),45.7(C-8′),51.1(C-1′′),15.9(C-2′′),174.8(C-3′′)。以上數據與文獻中[19]報道的化合物4一致,因此,將化合物8命名為3α-hydroxyl-N-isopropyl carboxyl-phenylspirodrimane。

化合物1～8的結構見圖4。

圖4 化合物1～8的化學結構Fig.4 The structures of compound 1-8

2.4 體外細胞毒活性檢測

采用CCK-8法對化合物1～8進行細胞毒活性檢測。測試細胞包括人肝癌細胞株(HepG2)、人宮頸癌細胞株(HeLa)以及人結腸癌細胞株(HCT116),以順鉑作為陽性對照藥進行活性評價(見表1)。活性測試結果顯示,PSM類化合物對HepG2、HeLa和HCT116細胞株有較好的抑瘤活性,但低于陽性對照藥。其中,化合物2對3株腫瘤細胞的抑制活性相對較高,化合物3和7對HeLa細胞株的抑瘤活性顯著降低。對比化合物2和7的化學結構,化合物7中C2位羥基化和N位的丁酸基團取代可能降低了抗腫瘤細胞活性(見表1)。

表1 化合物1～8的細胞毒活性Table 1 The cytotoxic activities of compounds 1-8

3 討論與結論

本研究利用OSMAC技術、LC-MS/MS質譜分子網絡分析策略,結合多種色譜及現(xiàn)代波譜手段從葡萄穗霉菌Stachybotryssp.CPCC 401591中分離得到8個PSM類化合物。近年來,對絲狀真菌基因組數據的挖掘分析發(fā)現(xiàn)大多數真菌通常含有40～60個與天然產物生物合成有關的生物合成基因簇(BGCs),但目前分離鑒定的代謝產物仍然是“冰山一角”。絲狀真菌基因組中大多數BGCs是沉默或隱蔽的,可能編碼的“暗物質”仍未得到鑒定。OSMAC技術不針對特定的沉默基因簇的激活,而是針對容易操作的培養(yǎng)參數的系統(tǒng)改變(包括培養(yǎng)基成分、pH值和培養(yǎng)溫度等),從而獲得結構新穎的生物活性分子[14]。這使得OSMAC技術成為用于激活微生物次級代謝的一種廉價高效、可用通用且相對簡單易行的研究方法。本研究針對菌株CPCC 401591,采用OSMAC策略研究PDB、BY、F2和大米發(fā)酵培養(yǎng)基對真菌次級代謝產物的影響。綜合菌株次級代謝產物的豐度和產量,確定了大米培養(yǎng)基是最佳發(fā)酵培養(yǎng)基,表明OSMAC技術對該菌株挖掘次級代謝產物的效率有顯著提高。同時,本研究將GNPS分子網絡分析策略運用到對菌株CPCC 401591發(fā)酵提取物乙酸乙酯相分析,將待分析物的二級質譜數據與數據庫中的化合物質譜數據進行比對,快速指認出待分析樣品中所包含的化合物類別,并進一步助力生物活性分子的高效發(fā)現(xiàn)。

PSM類化合物目前只在葡萄穗霉屬和刺黑烏梅屬真菌中分離得到,因此該類化合物為這兩類真菌的標志性分子[20]?；衔飐tachybotrin D具有顯著的抗HIV活性,對HIV-1wt、HIV-1RT-K103N等突變株的EC50值介于6.2～23.8 μM[4]。Jia等[5]研究發(fā)現(xiàn)bistachybotrysin K對HCT116和NCI-H460等腫瘤細胞株的IC50值介于1.1～4.7 μM。本研究對菌株Stachybotryssp.CPCC 401591中的次級代謝產物開展研究,結合化合物特征性紫外吸收(230、285、330 nm),利用多種色譜技術以及現(xiàn)代波譜技術,分離并確定了8個PSM類化合物的結構。進一步結合GNPS分析,發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵提取物中仍含有多個單體和PSM類二聚體化合物分子,但因為含量少未能得到單體化合物。因此,可通過進一步提高發(fā)酵量、優(yōu)化發(fā)酵條件并結合HPLC-UV-MS技術尋找更多的PSM類分子。目前,我們已經完成菌株Stachybotryssp.CPCC 401591的全基因組測序,通過基因組挖掘手段定位到2個可能的PSM類化合物的生物合成基因簇psd1和psd2。兩個基因簇均含有聚酮合酶和倍半萜合酶編碼基因,同時該基因簇編碼豐富的后修飾酶(包括氧化酶P450s、短鏈脫氫酶和乙酰轉移酶等)。這為我們后續(xù)借助基因敲除策略,從而為解析PSM類化合物生物合成途徑和鑒定關鍵生物酶功能的研究奠定基礎。因此,本研究表明葡萄穗霉真菌Stachybotryssp.CPCC 401591能夠產生PSM化合物,豐富了該菌次級代謝產物的結構多樣性,是一株值得深入研究的重要資源菌。