伍燕平，王蒙，張平平，朱凱，袁媛，李佳佳

蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院血液科，安徽蚌埠 233003

急性髓系白血病（AML）是常見的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，特征為骨髓中未成熟髓系造血細(xì)胞異常增殖和分化［1-2］。AML 的發(fā)病率為3.7/100 000，病死率為2.7～18/100 000［3-4］。HL60是人原髓細(xì)胞白血病細(xì)胞，多用于AML 的功能實驗研究［5］。盡管過去幾十年對AML 的研究不斷深入提高了對該病的認(rèn)識與理解，但其發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。因此，闡明AML發(fā)生發(fā)展的基礎(chǔ)機(jī)制，有助于改善AML的治療效果。微小RNA（miRNA）是一類小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后水平上調(diào)節(jié)基因表達(dá)，已被確定為正常和惡性生物過程中的主要調(diào)節(jié)因子［3］。在AML 中，miRNA 的失調(diào)與造血前體的不同分化階段有關(guān)，因此miRNA 的作用在于造血和腫瘤發(fā)生具有重要作用［6］。近年研究［7-9］發(fā)現(xiàn)，微小RNA-1306-5p（miR-1306-5p）在多種腫瘤中低表達(dá)并發(fā)揮抑癌作用，但目前其在AML 發(fā)生發(fā)展中的具體作用機(jī)制尚不明確。2021 年6—12 月，我們觀察了miR-1306-5p 在AML 患者骨髓組織單個核細(xì)胞中的表達(dá)，以及對HL60 細(xì)胞增殖凋亡和遷移侵襲調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及主要試劑 HL60細(xì)胞（無錫懷信生物公司）。RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green試劑盒（Thermo Fisher公司），CCK8檢測試劑盒、細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（Abcam 公司），Transwell（Corning 公司），RI-PA細(xì)胞裂液（Boster公司），1%青鏈霉素10%胎牛血清（Gibco公司），質(zhì)粒（上海 Genepharma 公司）。miR-1306-5p mimics sense：5′-CCACCUCCCCUGCA AACGUCCA-3’，miR-1306-5p mimics antisense：5′-UG?GACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；miR-1306-5p in?hibitor：5′-UGGACGUUUGCAGGGGAGGUGG-3′；U6 sense：5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′，U6 antisense：5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′；miR-1306-5p reverse primer：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGC AATTCAGTTGAGTGGACGTT-3′，miR-1306-5p sense：5′-AATACCACCT CCCCTGCA-3′。

1.2 骨髓組織單個核細(xì)胞miR-1306-5p 檢測 取2021 年6—12 月收治的AML 患者和再生障礙性貧血（AA）患者的骨髓血標(biāo)本各2 mL。該研究方案經(jīng)蚌埠醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院倫理委員會簽署批準(zhǔn)，所有參與者均獲得知情同意，所有受試者均同意并同意本研究。將AA和AML患者的骨髓血標(biāo)本各2 mL分別置于EDTa_K2 管中，用紅細(xì)胞裂解液提取單個核細(xì)胞。用TRIzol 提取總RNA，后取RNA 樣品1 μL，使用超微量分光光度計SMA1000 測量總RNA的純度與濃度，并收集濃度在30～70 ng/μL 之間且OD260/280 比值在1.8～2.0 之間總RNA 樣本。按照miRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（MR101-01/01/02，南京諾唯贊生物公司）說明書逆轉(zhuǎn)錄出cDNA，在PCR 儀上擴(kuò)增特定DNA 片段（單樣本均設(shè)置3 個復(fù)孔進(jìn)行對照）計算其均值，AML 患者與AA 患者均以U6 作為內(nèi)參基因采用一體化miRNA RT-qPCR 檢測試劑盒（Q711-02，南京諾唯贊生物公司）檢測。逆轉(zhuǎn)錄體系10 μL，反應(yīng)條件如下：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃保存。PCR 反應(yīng)階段體系20 μL，循環(huán)條件：95 ℃、30 s，95 ℃、5 s，60 ℃、34 s，95 ℃、15 s，60 ℃、1 min，95 ℃、15 s，循環(huán)次數(shù)40 次。采用2-ΔΔCt法計算miR-1306-5p相對表達(dá)水平。

1.3 HL60 細(xì)胞培養(yǎng)、分組、過表達(dá)和敲低miR-1306-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率檢測 將HL60細(xì)胞放在加入1%青鏈霉素、10%胎牛血清的DEME 培養(yǎng)基中，并置于37 ℃含有5%CO2的細(xì)胞箱中培養(yǎng)，每隔24 h進(jìn)行傳代。取生長良好的HL60細(xì)胞接種于6孔板，1×105/孔，當(dāng)細(xì)胞生長至70%以上融合時進(jìn)行后續(xù)轉(zhuǎn)染。將HL60細(xì)胞各分為1、2、3、4組。1組為過表達(dá)對照組，轉(zhuǎn)染mimic control；2 組為miR-1306-5p 過表達(dá)組，轉(zhuǎn)染miR-1306-5p mimics；3 組為敲低對照組，轉(zhuǎn)染Inhibitor control；4 組為miR-1306-5p 敲低組，轉(zhuǎn)染miR-1306-5p inhibitor。使用Lipofectamine? 2000（美國Invitrogen）轉(zhuǎn)染試劑盒，所有操作均嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。轉(zhuǎn)染后將各組細(xì)胞置于37 ℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。轉(zhuǎn)染48 h 取各組細(xì)胞，RT-PCR法檢測各組miR-1306-5p，確定miR-1306-5p 轉(zhuǎn)染效率。1、2、3、4 組miR-1306-5p 相對表達(dá)量分別為3.55 ± 0.40、5.64 ± 0.28、3.65 ± 0.29、1.64 ±0.17，2 組較1 組miR-1306-5p 相對表達(dá)量增高，4 組較3 組miR-1306-5p 相對表達(dá)量降低（P均<0.05），提示miR-1306-5p質(zhì)粒轉(zhuǎn)染成功。

1.4 轉(zhuǎn)染過表達(dá)和敲低miR-1306-5p 質(zhì)粒的HL60細(xì)胞增殖能力檢測 采用CCK-8法。將各組HL60細(xì)胞（2×103/孔）接種于96孔板中。使用RPMI1640培養(yǎng)基（含10%胎牛血清）進(jìn)行孵育。轉(zhuǎn)染48 h 后，每個孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，37 ℃孵育3 h。測定酶標(biāo)儀在450 nm 吸光度時的光密度OD 值。以O(shè)D 值代表各組細(xì)胞的增殖活力，每組實驗重復(fù)3次，取平均值。

1.5 轉(zhuǎn)染過表達(dá)和敲低miR-1306-5p 質(zhì)粒的HL60細(xì)胞凋亡能力檢測 采用流式細(xì)胞儀。轉(zhuǎn)染48 h后的各組HL60 細(xì)胞用預(yù)冷的PBS 重懸，用PI（5 μL，50 μg/mL）和Annexin V-FITC（10 μL）染色。避光室溫孵育15 min，采用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測各組細(xì)胞的凋亡率。實驗重復(fù)3次，取平均值。細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.6 轉(zhuǎn)染過表達(dá)和敲低miR-1306-5p 質(zhì)粒的HL60細(xì)胞遷移、侵襲能力檢測 采用Transwell 法。侵襲能力，將100 μL 的Matrigel 膠均勻地鋪在Transwell小室，在培養(yǎng)箱中聚合成薄膜。調(diào)整HL60 細(xì)胞濃度為2×105/mL，上室中加入細(xì)胞懸液200 μL，下室中加入600 μL 含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基。24 h后取出上室用多聚甲醇固定30 min，PBS 清洗兩次，結(jié)晶紫染色10 min，PBS 液漂凈，用棉簽擦去未侵襲細(xì)胞，干燥后觀察，隨機(jī)選取5 個低倍鏡視野（×100），計算平均數(shù)后以代表細(xì)胞的侵襲能力。遷移能力，無需在Transwell 小室中加入Matrigel 膠其余同侵襲步驟。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件。符合正態(tài)分布的計量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相對表達(dá)量比較 AML 患者和AA 患者miR-1306-5p 相對表達(dá)量分別為0.27 ± 0.07、1.00 ± 0.08，兩者比較，P<0.05。

2.2 各組細(xì)胞OD 值、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較 細(xì)胞OD 值、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較見表1。

表1 各組細(xì)胞OD值、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較（± s）

表1 各組細(xì)胞OD值、細(xì)胞凋亡率、遷移細(xì)胞數(shù)、侵襲細(xì)胞數(shù)比較（± s）

注：與mimics control組比較，*P<0.05；與inhibitor control組比較，#P<0.05。

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3 討論

AML 是血液系統(tǒng)常見的高度異質(zhì)性的惡性腫瘤，也是癌癥相關(guān)死亡的重要原因。其特征主要表現(xiàn)為髓系祖細(xì)胞的增殖失控，使未成熟的前體細(xì)胞在骨髓中異常聚集，從而引起正常成熟血細(xì)胞生成不足［10］。盡管近年來隨著臨床和實驗室診斷方法不斷完善，使AML 的治療有了顯著改善，但是AML 的預(yù)后仍然很差，5 年生存率仍低至30%［11］。AML 仍是癌癥相關(guān)死亡的重要原因，AML 發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，尚未完全闡明，因此在此研究我們選擇AML 原髓細(xì)胞株HL60，設(shè)計miR-1306-5p 過表達(dá)和敲低質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HL60 細(xì)胞株，為AML 潛在的發(fā)病機(jī)制進(jìn)行闡明及研究，以期改善AML 的治療效果，提高患者生存率。

越來越多的證據(jù)表明，一些miRNAs 參與了AML的發(fā)生與發(fā)展，使其成為AML治療的治療靶點和潛在的診斷生物標(biāo)志物［12］。然而，miRNAs 在AML 進(jìn)展中的確切功能仍未得到充分的研究。miRNA 是一系列小的非編碼RNA，在轉(zhuǎn)錄后或翻譯水平的上調(diào)控基因表達(dá)［4，13］。miRNAs 在人體中具有非常強(qiáng)大的調(diào)節(jié)功能，調(diào)控范圍很廣，其與腫瘤的重要相關(guān)性已被大量研究證實。它在細(xì)胞分化、增殖和凋亡等各種生物過程中起著重要的作用。越來越多的證據(jù)表明，miRNAs 是AML 的關(guān)鍵調(diào)控因子［4，6］。DEBERNARDI 等［14］通過對HOX 家族基因的初步研究的文獻(xiàn)綜述，檢測到5 個可調(diào)控HOX 家族基因的特異性miRNA。在隨后的研究中，BRYANT等［15］發(fā)現(xiàn)，在伴有NPM1 突變的AML 患者中，miR-10a 的表達(dá)異常高。下調(diào)MiR-10a 可促進(jìn)AML 細(xì)胞的凋亡。研究人員發(fā)現(xiàn)，miR-10a 通過抑制兩個下游靶基因KLF4 和RB1CC1 來抵抗細(xì)胞凋亡。隨著先進(jìn)的檢測技術(shù)，AML 的miRNA 表達(dá)譜將不斷提高。miRNAs 將在AML 的發(fā)生和發(fā)展的診斷中發(fā)揮新的作用，為AML 的診斷和靶向治療提供新的思路。miR-1306-5p 涉及多種疾病以及腫瘤的發(fā)病機(jī)制，在多種不同類型的腫瘤組織或細(xì)胞中與其對應(yīng)相關(guān)對的正常對照標(biāo)本中，miR-1306-5p的表達(dá)量均表現(xiàn)出具有差異，并且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義。CHEN 等［12］研究發(fā)現(xiàn)，miR-1306-5p 可以通過靶向BIK 從而降低腦缺血/再灌注損傷。有研究［16］表明，miR-1306-5p 可以通過調(diào)控人釉質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系A(chǔ)M-1 細(xì)胞中與釉質(zhì)生成不全癥相關(guān)的基因來調(diào)節(jié)成釉細(xì)胞分化。此外DANG 等［17］研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA AC007207.2 可以通過miR-1306-5p/SIRT7 軸促進(jìn)骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，并且還發(fā)現(xiàn)miR-1306-5p發(fā)揮著骨肉瘤細(xì)胞惡性行為的作用，并抑制骨肉瘤細(xì)胞的惡性行為。一項研究［18-19］表明，miR-1306-5p在阿爾茲海默病患者中的表達(dá)明顯降低，其在阿爾茲海默病發(fā)展中起到保護(hù)作用。據(jù)報道，miRNAs通過調(diào)控幾個不同的靶基因，具有重要的生物學(xué)功能［16-17］。WANG 等［7］的研究中發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-1306-5p 時，PI3K/AKT/mTOR 信號通路被抑制，miR-1306-5p 與SLCO2A1 之間存在間接的相關(guān)性，表明SLCO2A1 是miR-1306-5p 的靶點。文獻(xiàn)［8］報道，在胰腺導(dǎo)管腺癌（PDAC）中還發(fā)現(xiàn)miR-1306-5p的另外一個靶基因ADP-核糖基化因子（Arf）樣蛋白4C（ARL4C）。其他研究顯示，ARL4C 在胰腺導(dǎo)管腺癌中呈高表達(dá)。ARL4C 在PDAC 細(xì)胞中的表達(dá)受到miR-1306-5p 的負(fù)調(diào)節(jié)，miR-1306-5p 是ARL4C 的上游調(diào)控基因，抑制ARL4C 的翻譯，從而阻礙ARL4C 的表達(dá)，抑制腫瘤的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)凋亡［8］。在GAO 等［20］的研究中發(fā)現(xiàn)，在AML 細(xì)胞中下調(diào)miR-1306-5p 與細(xì)胞增殖減少和凋亡率增加相關(guān)，并且此過程通過miR-1306-5p 直接調(diào)節(jié)PHF6 的表達(dá)發(fā)揮作用。從以上的研究成果我們可以看出，miR-1306-5p 在多種腫瘤包括AML的發(fā)生和發(fā)展中調(diào)控著腫瘤組織和細(xì)胞的生物學(xué)功能。

本研究顯示，與AA 患者比較，AML 患者miR-1306-5p 相對表達(dá)量低；與mimics control 組比較，miR-1306-5p mimics 組OD 值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)降低，凋亡率升高；與inhibitor control 組比較，miR-1306-5p inhibitor 組OD 值、侵襲細(xì)胞數(shù)、遷移細(xì)胞數(shù)升高，凋亡率降低。提示AML 患者骨髓組織單個核細(xì)胞miR-1306-5p 表達(dá)降低，轉(zhuǎn)染過表達(dá)miR-1306-5p質(zhì)粒的HL60細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力減弱及凋亡能力增強(qiáng)，敲低miR-1306-5p 質(zhì)粒的HL60 細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)及凋亡能力減弱。

綜上所述，本研究通過干擾AML 細(xì)胞中miRNA-1306-5p的表達(dá)水平，去探索miRNA-1306-5p與AML 的關(guān)系。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，miRNA-1306-5p 的變化能影響AML 細(xì)胞的生物學(xué)特性。因此我們有理由認(rèn)為，miRNA-1306-5p 可能AML 在內(nèi)的腫瘤的發(fā)病機(jī)制相關(guān)，并且有可能成為AML 的預(yù)后評估指標(biāo)之一，但是在miR-1306-5p 涉及對AML 細(xì)胞生物學(xué)功能的影響，還需進(jìn)一步研究。