石艷宏，何丹，馬曉燕，董兵衛(wèi)，郭文文，高應(yīng)芳，司小敏

1 咸陽市中心醫(yī)院病理科，陜西咸陽 712000；2 西安市中心醫(yī)院病理科；3 咸陽市中心醫(yī)院腫瘤科

膀胱癌是常見的泌尿外科惡性腫瘤，全世界每年新發(fā)病例達(dá)43.0 萬，死亡例數(shù)達(dá)16.5 萬［1］。膀胱癌以非肌層浸潤膀胱癌（NMIBC）最為常見，約占所有初發(fā)膀胱腫瘤的70%。NMIBC 的治療包括經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切、術(shù)后膀胱局部灌注化療等，但仍會發(fā)生腫瘤局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的現(xiàn)象，導(dǎo)致不良預(yù)后［2］。因此，有必要深入研究膀胱癌疾病機(jī)制，尋找能夠評估膀胱癌預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。長鏈非編碼RNA 膀胱癌相關(guān)轉(zhuǎn)錄本2（BLACAT2）是一種長鏈非編碼RNA，又稱為LNC00958，長度為2.6 kb。BLACAT2 在膀胱癌［3］、食管癌［4］等惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，通過促進(jìn)腫瘤細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤增殖及轉(zhuǎn)移，是新的腫瘤標(biāo)志物。WD 重復(fù)域蛋白5（WDR5）屬于WD 重復(fù)蛋白家族成員，具有典型的WD 重復(fù)序列，該序列有助于異源三聚體或多蛋白復(fù)合物的形成，參與包括細(xì)胞周期進(jìn)展、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、細(xì)胞凋亡和基因調(diào)控等多種細(xì)胞過程［5］。胃癌、結(jié)腸癌中WDR5 的表達(dá)升高能夠通過組蛋白H3 賴氨酸4（H3K4）三甲基化，促進(jìn)細(xì)胞周期素D1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖［6-7］。目前，BLACAT2 和WDR5在NMIBC中的表達(dá)尚不清楚，鑒于既往研究中BLACAT2、WDR5的腫瘤促進(jìn)作用，兩者可能是新的NMIBC 腫瘤標(biāo)志物，影響NMIBC 患者的無進(jìn)展生存預(yù)后。本研究觀察了NMIBC患者癌組織BLACAT2、WDR5表達(dá)變化，并分析患者預(yù)后的影響因素。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018 年2 月—2019 年2 月咸陽市中心醫(yī)院收治的NMIBC 患者94 例，男55 例，女39 例；年齡38～69（62.52 ± 4.26）歲；<60 歲40 例，≥60 歲54 例；有吸煙史41 例，無吸煙史53 例；腫瘤直徑≥3 cm 者25例，<3 cm 者69例；腫瘤數(shù)目為單發(fā)67例，多發(fā)27 例；腫瘤TNM 分期為Ta/Tis 期43 例，T1期51例；病理分級為低級別54例，高級別40例。納入標(biāo)準(zhǔn)：①所有患者均接受經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)，經(jīng)術(shù)后病理診斷為非肌層浸潤膀胱尿路上皮癌；②首次診治，術(shù)前均未接受放化療等抗腫瘤治療；③患者及家屬對本研究知情同意并簽字，臨床和隨訪資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并其他器官惡性腫瘤；②合并尿道狹窄，尿路感染或嚴(yán)重肝腎功能障礙等；③妊娠哺乳期婦女。留取經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)切除的NMIBC 和正常膀胱黏膜組織各94 例份。本研究經(jīng)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織BLACAT2、WDR5 mRNA 檢測 取NMIBC 和正常膀胱黏膜組織，液氮中研磨，TRIzol 法提取組織總RNA，微量分光光度計(jì)檢測OD260/OD280 比值介于1.8～2.1。將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)。引物由上海華大公司設(shè)計(jì)合成。BLA?CAT2 正向序列：5'-AGCAGCGAAAACGTGGTTGTA-3'，反向序列：5'-GCCGCAAAATAGTGTGCAAAG-3'；WDR5 mRNA 正向序列：5'-TTTTGCGGCTTC?GAGTAACCA-3'，反向序列：5'-GGCCTTGTA?AGGTTGTGCCA-3'；GAPDH 正向序列：5'-ACTCGT?GTCATCAGCGACTTG-3'，反向序列：5'-GCAACAG?TAGGTTTCCTTGTGT-3'。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，70 ℃延伸30 s，變性退火延伸共40 個(gè)循環(huán)?？傮w系20 μL，包括SYBR Premix Master Mix 10 μL，正反向游引物各1 μL，cDNA 1 μL 和雙蒸水 7 μL。以GAPDH 為內(nèi)參，BLACAT2、WDR5 mRNA 相對表達(dá)量采用2-ΔΔCt法表示。

1.3 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織WDR5 蛋白檢測 取NMIBC 和正常膀胱黏膜組織，以10%中性甲醛固定后，常規(guī)石蠟包埋切片，切片厚度4 μm，常規(guī)進(jìn)行免疫組化染色。WDR5兔單克隆抗體購于英國Abcam公司（貨號ab178410）。梯度酒精脫水后中性樹脂封片。切片置于倒置顯微鏡下觀察染色情況。根據(jù)染色深度評分與染色面積評分的乘積進(jìn)行評分，染色深度評分：無染色0 分，淺黃色1 分，棕黃色2 分，棕褐色3 分；染色面積評分：陽性面積<25%計(jì)1 分，25%～50%計(jì)2 分，51%～75%計(jì)3 分，>75%計(jì)4分。乘積≥2分為陽性，<2分為陰性。

1.4 NMIBC 患者隨訪方法 所有患者術(shù)后接受規(guī)范的膀胱灌注化療。術(shù)后第1 年每3 個(gè)月電話或門診隨訪1次，術(shù)后第2～3年每半年隨訪1次，隨訪內(nèi)容為腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展及患者生存情況，隨訪方式為膀胱鏡鏡檢，尿脫落細(xì)胞及盆腔CT 等影像學(xué)檢查等。隨訪終點(diǎn)為2022 年3 月1 日。進(jìn)展定義腫瘤膀胱局部復(fù)發(fā)，盆腔或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移或發(fā)生腫瘤相關(guān)死亡。無進(jìn)展生存時(shí)間（PFS）定義為自確診之日至腫瘤復(fù)發(fā)，轉(zhuǎn)移或腫瘤相關(guān)死亡時(shí)間發(fā)生的間隔時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計(jì)軟件。符合正態(tài)性分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)。相關(guān)性分析采用Pearson 相關(guān)分析法。生存分析采用Kaplan-Meier 分析，Log-rank 檢驗(yàn)比較生存曲線間的差異。單因素及多因素Cox 回歸分析影響膀胱癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的因素。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 NMIBC 和正常膀胱黏膜組織BLACAT2、WDR5 mRNA及WDR5蛋白相對表達(dá)量比較 NMIBC組織BLACAT2、WDR5 mRNA 相對表達(dá)量分別為2.19 ± 0.38、1.62 ± 0.41，正常膀胱黏膜組織分別為0.47 ± 0.09、0.61 ± 0.12，兩者比較，P均<0.05。NMIBC、正常膀胱黏膜組織WDR5 蛋白陽性率分別為71.28%、10.64%，P<0.05。

2.2 NMIBC 組織BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)的相關(guān)性 NMIBC 組織BLACAT2 mRNA 與WDR 5 mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)（r=0.756，P=0.000）。

2.3 BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)與NMIBC 臨床病理特征的關(guān)系 BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)與NMIBC 臨床病理特征的關(guān)系見表1，由表1 可知，BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)與NMIBC 腫瘤分期、病理分級有關(guān)（P均<0.05）。

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表達(dá)與NMIBC臨床病理特征的關(guān)系（± s）

表1 BLACAT2、WDR5 mRNA表達(dá)與NMIBC臨床病理特征的關(guān)系（± s）

?

2.4 不同BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)的NMIBC患者總體無進(jìn)展生存率比較 分別根據(jù)癌組織BLACAT2、WDR5 mRNA 表達(dá)的平均值2.19、1.62為界，分為BLACAT2高表達(dá)者（n=50）和低表達(dá)者（n=44），WDR5 mRNA高表達(dá)者（n=48）和低表達(dá)者（n=46）。BLACAT2 高表達(dá)者、低表達(dá)者3 年總體無進(jìn)展生存率分別為44.00%（22/50）、77.27%（34/44），WDR5 mRNA 高表達(dá)者、低表達(dá)者3 年總體無進(jìn)展生存率分別為41.67%（20/48）、78.26%（36/46），兩者比較，P均<0.05。

2.5 NMIBC 患者生存影響因素 以隨訪過程中NMIBC患者的是否發(fā)生腫瘤進(jìn)展為因變量（1=進(jìn)展，0=未進(jìn)展，t=無進(jìn)展生存時(shí)間），納入年齡（≥60歲vs.<60歲）、性別（男vs.女）、吸煙史（有vs.無）、病理分級（高級別vs.低級別）、腫瘤直徑（≥3 cmvs.<3 cm）、腫瘤數(shù)量（多發(fā)vs.單發(fā)）、腫瘤分期（T1期vs.Ta/Tis期）、BLACAT2（高表達(dá)vs.低表達(dá)）、WDR5 mRNA（高表達(dá)vs.低表達(dá)）為自變量，將單因素分析中差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素（P<0.05）納入多因素Cox回歸分析，結(jié)果顯示腫瘤分期T1期、腫瘤分級高級別、BLA?CAT2高表達(dá)、WDR5 mRNA高表達(dá)是影響NMIBC患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，詳見表2～3。

表2 NMIBC患者無進(jìn)展生存預(yù)后的單因素Cox回歸分析結(jié)果

表3 NMIBC患者無進(jìn)展生存預(yù)后的多因素Cox回歸分析結(jié)果

3 討論

膀胱癌是常見的尿路惡性腫瘤，每年新發(fā)患者例數(shù)達(dá)8.2 萬［8］。NMIBC 是臨床最常見的膀胱癌類型，腫瘤分期包括Ta、T1、Tis 期。NMIBC 的臨床治療以經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切術(shù)為主，輔以術(shù)后膀胱灌注化療，但術(shù)后仍有約60%患者發(fā)生腫瘤局部復(fù)發(fā)，約15%患者進(jìn)展為肌層浸潤膀胱癌，導(dǎo)致不良預(yù)后［9］。目前，NMIBC 預(yù)后的評估主要根據(jù)腫瘤分期，病理分級等因素進(jìn)行危險(xiǎn)分層，但由于腫瘤異質(zhì)性，仍然難以準(zhǔn)確評估患者臨床預(yù)后［10］。深入研究膀胱癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制，尋找有效評估膀胱癌預(yù)后的分子標(biāo)志物，對于指導(dǎo)臨床治療，改善高危患者的臨床預(yù)后意義重大。

BLACAT2 基因位于11p15.3，是一種長鏈非編碼RNA。近年來發(fā)現(xiàn)，BLACAT2 作為一種致癌因子，其表達(dá)升高促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的惡性增殖、轉(zhuǎn)移，是新的腫瘤治療靶點(diǎn)［11］。組蛋白甲基化修飾是組蛋白在組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶的作用下其氨基酸殘基甲基化過程，參與多種真核生物轉(zhuǎn)錄激活過程。WDR5 是WD-40 蛋白家族成員，具有甘氨酸—組氨酸及色氨酸—天冬氨酸支架結(jié)構(gòu)，能與H3K4 甲基化位點(diǎn)結(jié)合，參與胚胎干細(xì)胞分化，發(fā)育等生物學(xué)過程。近年來發(fā)現(xiàn)，WDR5通過參與形成蛋白復(fù)合體，在表觀遺傳學(xué)水平轉(zhuǎn)錄激活下游基因表達(dá)，參與胃癌等惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展［12］。

本研究顯示，NMIBC 組織BLACAT2 表達(dá)升高，此結(jié)果與SEITZ 等［13］研究結(jié)果一致。SEITZ 等［13］利用二代測序?qū)Π螂装┲胁町愋员磉_(dá)的長鏈非編碼RNA 進(jìn)行分析，證實(shí)癌組織BLACAT2 表達(dá)上調(diào)較為顯著，但該研究納入的病例主要以Ta 期為主，本研究增加Tis 和T1 期病例，能夠更為客觀反映非肌層浸潤膀胱癌中BLACAT2 的表達(dá)情況。本研究還顯示，BLACAT2 表達(dá)與NMIBC 腫瘤分期、病理分級有關(guān)，提示BLACAT2 參與促進(jìn)膀胱癌的腫瘤進(jìn)展。分析其機(jī)制，BLACAT2 能夠促進(jìn)膀胱癌侵襲和轉(zhuǎn)移。XIAO 等［14］發(fā)現(xiàn)，膀胱癌中BLACAT2 的表達(dá)升高，其通過抑制c-Jun 氨基末端激酶通路，促進(jìn)膀胱癌細(xì)胞的增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)腫瘤的侵襲能力。HE 等［15］報(bào)道，BLACAT2 的表達(dá)上調(diào)能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮生長因子C的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌淋巴轉(zhuǎn)移，動物實(shí)驗(yàn)中予以抗血管內(nèi)皮生長因子C抗體則能夠逆轉(zhuǎn)BLACAT2過表達(dá)引起的膀胱癌轉(zhuǎn)移。因此，膀胱癌中BLACAT2表達(dá)升高參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展，可能是評估膀胱癌患者不良預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物。本研究證實(shí)，BLACAT2 高表達(dá)的NMIBC 患者無進(jìn)展生存預(yù)后較差，是影響患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，表明BLACAT2 有助于評估NMIBC 患者的臨床預(yù)后。分析其原因，一方面是BLACAT2高表達(dá)患者腫瘤惡性程度高，術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)較大。另一方面，REN 等［16］發(fā)現(xiàn)，BLACAT2 高表達(dá)的腫瘤細(xì)胞對5 氟尿嘧啶等化療藥具有較強(qiáng)的耐藥性，從而增加了患者術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)。

本研究顯示，NMIBC 組織WDR5 mRNA 和蛋白表達(dá)均明顯升高，此結(jié)果與國內(nèi)學(xué)者利用基因芯片研究結(jié)果一致［17］。HUANG 等［18］報(bào)道，膀胱癌中熱休克因子1 能夠與蛋白精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶5 相互作用，招募并激活WDR5 的表達(dá)，促進(jìn)H3K4 三甲基化，導(dǎo)致淋巴增強(qiáng)子結(jié)合因子1、基質(zhì)金屬肽酶9 和E2F 轉(zhuǎn)錄因子2 的表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)膀胱癌的侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移能力。本研究還顯示，WDR5 mRN 表達(dá)與NMIBC腫瘤分期及病理分級有關(guān)，提示W(wǎng)DR5促進(jìn)膀胱癌的腫瘤進(jìn)展。分析其機(jī)制，可能是WDR5的表達(dá)影響腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的浸潤。LU 等報(bào)道，WDR5的表達(dá)升高能夠通過H3K4三甲基化，上調(diào)胰腺癌腫瘤細(xì)胞骨橋蛋白水平及程序性死亡配體1的表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。本研究中，WDR5 mRNA高表達(dá)是影響膀胱癌患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立因素，表明WDR5 是一種新的NMIBC 預(yù)后相關(guān)腫瘤標(biāo)志物。分析其原因，NMIBC經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切后腫瘤可發(fā)生復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)高峰在術(shù)后半年和一年半，這與術(shù)中存在肉眼難以分辨的微小病灶或腫瘤殘余有關(guān)，而術(shù)后膀胱灌注化療對減少腫瘤復(fù)發(fā)發(fā)揮重要作用。本研究中WDR5 mRNA高表達(dá)患者術(shù)后易發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)進(jìn)展，這可能是WDR5 mRNA高表達(dá)腫瘤細(xì)胞存在化療耐藥的現(xiàn)象。ZHANG 等報(bào)道，膀胱癌腫瘤細(xì)胞T24、UM-UC-3 中過表達(dá)WDR5 能夠增強(qiáng)對順鉑化療藥物的耐藥性，而加用WDR5 的特異性抑制劑OICR-9429 后，提高了腫瘤對化療治療的敏感性。因此，臨床醫(yī)生可根據(jù)NMIBC 組織WDR5 的表達(dá)，對患者電切術(shù)后的預(yù)后進(jìn)行評估，對于高危復(fù)發(fā)的患者予以積極治療及隨訪，以改善患者臨床預(yù)后。本文結(jié)果還顯示，BLACAT2 mRNA 與WDR5 mRNA表達(dá)呈正相關(guān)，提示NMIBC 中BLACAT2 與WDR5可能存在協(xié)同的作用關(guān)系，共同參與膀胱癌的腫瘤進(jìn)展。HE 等在膀胱癌細(xì)胞系和小鼠模型中證實(shí)，BLACAT2的過度表達(dá)通過與人H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶復(fù)合物的核心亞基WDR5 直接相互作用，表觀遺傳學(xué)上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子-C 的表達(dá)，促進(jìn)膀胱癌相關(guān)的淋巴管生成和淋巴轉(zhuǎn)移［10］。但兩者能否成為新的治療靶點(diǎn)，值得臨床深入研究。

總之，NMIBC 組織BLACAT2、WDR5 表達(dá)升高，與腫瘤分期、病理分級及無進(jìn)展生存預(yù)后有關(guān)，是潛在的評估NMIBC 患者無進(jìn)展生存預(yù)后的腫瘤標(biāo)志物，腫瘤分期T1 期、腫瘤分級高級別、BLACAT2 高表達(dá)、WDR5 mRNA 高表達(dá)是影響NMIBC 患者無進(jìn)展生存預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。