李旭陽(yáng),郭潤(rùn)晴,路江浩,鄢夢(mèng)潔,張鵬,劉明月,楊玲

(河北一然生物科技股份有限公司,河北 石家莊,050800)

益生菌制劑是天然的免疫激活劑,可以激活巨噬細(xì)胞并提高干擾素的含量,激活機(jī)體免疫力和抗病能力[1]。當(dāng)益生菌進(jìn)入機(jī)體后,其可定殖于腸道并繁殖,在機(jī)體消化過(guò)程中可以產(chǎn)生多種維生素、氨基酸、過(guò)氧化氫和乳酸等物質(zhì),可抑制腸道內(nèi)病原菌的生產(chǎn)繁殖,維持腸道健康,促進(jìn)機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收[2-3]。

免疫是機(jī)體通過(guò)識(shí)別和排除抗原性異物,從而保持體內(nèi)外環(huán)境穩(wěn)定的一種特異性生理反應(yīng)[4]。在新冠疫情的大環(huán)境下,如何提升機(jī)體免疫力引起了越來(lái)越多人的關(guān)注。機(jī)體的細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程主要由T細(xì)胞介導(dǎo),有研究表明,鼠李糖乳桿菌(Lactobacillusrhamnosus,LGG)能夠促進(jìn)動(dòng)物腸道T淋巴細(xì)胞的有效增殖,表現(xiàn)為成熟T淋巴細(xì)胞(CD3+)和輔助性T細(xì)胞(CD4+)數(shù)量升高[5];WANG等[6]通過(guò)在飼料中添加植物乳桿菌和低聚果糖,顯著提高了動(dòng)物血清中IgG和IgA含量,從而有效介導(dǎo)機(jī)體體液免疫應(yīng)答反應(yīng);此外,腸道免疫屏障作為腸道黏膜免疫系統(tǒng)的第一道防線(xiàn),益生菌能夠通過(guò)對(duì)細(xì)胞因子分泌量的調(diào)節(jié)來(lái)改善腸道免疫屏障功能,例如,動(dòng)物腸道白細(xì)胞介素-6(interleukin-6,IL-6)、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor,TNF-α)、Toll樣受體2和γ干擾素(interferon-γ,IFN-γ)的基因表達(dá)可經(jīng)唾液乳桿菌B1進(jìn)行增強(qiáng)[7],同時(shí),植物乳桿菌ZLP001能夠?qū)Ξa(chǎn)腸毒素性大腸桿菌(enterotoxigenicEscherichiacoli,ETEC)誘導(dǎo)的動(dòng)物小腸上皮細(xì)胞中IL-6、IL-8以及TNF-α分泌的增加產(chǎn)生顯著的抑制作用[8];YANG等[9]報(bào)道證實(shí),植物乳桿菌通過(guò)NF-κB和MAPK信號(hào)通路能夠在一定程度上抑制ETEC K88誘導(dǎo)的IL-6、IL-8、TNF-α和IL-1α表達(dá)的增強(qiáng)及抗炎細(xì)胞因子PPAR-γ表達(dá)的減弱。目前,益生菌及其制劑對(duì)機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究已經(jīng)日趨全面,然而,對(duì)于某單個(gè)菌株腸道定殖穩(wěn)定性及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制的綜合研究較少。

對(duì)于人體,具有較強(qiáng)腸道定殖穩(wěn)定特性的益生菌菌株更能夠有效地發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制,從而增強(qiáng)人體免疫力。因此,本研究主要針對(duì)嗜熱鏈球菌S131腸道定殖穩(wěn)定性及其對(duì)巨噬細(xì)胞免疫調(diào)節(jié)的功能特性進(jìn)行研究,并對(duì)其提升免疫力的作用機(jī)制進(jìn)行解析,為益生菌及其免疫力調(diào)節(jié)功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯化鈉、三氯乙酸、95%(體積分?jǐn)?shù))乙醇、苯酚、濃硫酸、透析袋(10 kDa)、胎牛血清、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline, PBS)、青鏈霉素混合液、CCK-8試劑盒、0.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液,生工生物工程(上海)股份有限公司;MRS液體培養(yǎng)基、MRS固體培養(yǎng)基,北京陸橋技術(shù)股份有限公司;2型豬胃黏蛋白(Sigma M2 378-100G)、吐溫20、曲拉通X-100,生工生物工程(上海)股份有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)液,美國(guó)Invitrogen公司;快速細(xì)胞凍存液(無(wú)血清),上海雅酶生物醫(yī)藥科技有限公司;脂多糖(lipopolysaccharide,LPS),美國(guó)Sigma公司;中性紅細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒,碧云天;ELISA試劑盒,北京四正柏生物科技有限公司;DMEM完全培養(yǎng)液由90%(體積分?jǐn)?shù))的DMEM、10%(體積分?jǐn)?shù))的胎牛血清和1%(體積分?jǐn)?shù))的青鏈霉素混合液組成。

1.2 儀器與設(shè)備

CX41顯微鏡,日本奧林巴斯公司;Micro21R離心機(jī)、Multiscan Go多功能酶標(biāo)儀,美國(guó)Thermo公司;Accri C6 Plus流式細(xì)胞儀,君曉電子。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 菌株活化富集及細(xì)胞培養(yǎng)

將嗜熱鏈球菌S131和陽(yáng)性對(duì)照組鼠李糖乳桿菌LGG在MRS液體培養(yǎng)基中活化3代及以上,分別離心后收集各菌泥;用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液對(duì)菌泥進(jìn)行重懸,0.9%(體積分?jǐn)?shù))生理鹽水對(duì)重懸菌液進(jìn)行梯度稀釋,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)菌液濃度,調(diào)整菌液濃度1.5×108CFU/mL左右,得到活菌菌懸液。滅活菌菌體收集同上,重懸菌體,置于80 ℃水浴鍋中30 min進(jìn)行滅活,鹽水稀釋后調(diào)整菌懸液濃度為1.5×108CFU/mL左右。

將RAW264.7細(xì)胞于含有10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中復(fù)蘇,于37 ℃、5%(體積分?jǐn)?shù))CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行孵育,待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好且密度達(dá)80%左右進(jìn)行傳代,傳代3次后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.2 菌株黏附能力測(cè)定

向96孔板中各孔加入100 μL質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL黏蛋白溶液,4 ℃過(guò)夜孵育,向過(guò)夜孵育后的96孔板中每孔加入含1%(體積分?jǐn)?shù))吐溫20的PBS封閉1 h;去除PBS后,向各孔中加入菌懸液,每組3個(gè)平行,空白對(duì)照組加入PBS,37 ℃孵育3 h,待孵育完畢后,加入含0.05%吐溫20的PBS,清洗2次,去除未黏附的菌,在60 ℃烘箱中干燥1 h;干燥后向每孔加入結(jié)晶紫溶液,室溫放置染色45 min;PBS清洗后加入無(wú)水乙醇,靜置10 min;于595 nm波長(zhǎng)下使用酶標(biāo)儀測(cè)各孔的吸光值[10]。

1.3.3 菌株產(chǎn)胞外多糖能力檢測(cè)

參考李嘉文等[11]的方法對(duì)待測(cè)菌懸液中的胞外多糖進(jìn)行粗提取,樣品測(cè)定采用苯酚-硫酸法[12],建立葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)方程計(jì)算胞外多糖含量。

1.3.4 菌株對(duì)細(xì)胞增殖和吞噬能力影響的實(shí)驗(yàn)

用自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)儀檢測(cè)1.3.1節(jié)中活化后的細(xì)胞數(shù)量并調(diào)整細(xì)胞濃度為1.5×105個(gè)/mL,接種于96孔板,每孔100 μL細(xì)胞懸液在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中過(guò)夜孵育。

細(xì)胞貼壁后,棄去上清液,每孔加入100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液(DMEM培養(yǎng)基,10%胎牛血清)和100 μL的活菌菌懸液或滅活菌懸液(1.3.1節(jié)中已調(diào)整好),空白對(duì)照組為100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液,每組5個(gè)重復(fù),在37 ℃、5% CO2條件下活菌組與RAW264.7細(xì)胞一起孵育4 h,滅活菌組與細(xì)胞RAW264.7一起孵育24 h。

用CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性及增殖情況[13-14]。按公式(1)計(jì)算細(xì)胞增殖率:

(1)

式中:As表示各個(gè)實(shí)驗(yàn)組OD值;Ac表示空白對(duì)照組OD值。

中性紅試劑盒檢測(cè)細(xì)胞吞噬效果[15-16]。按公式(2)計(jì)算細(xì)胞吞噬率:

(2)

式中:As表示各個(gè)實(shí)驗(yàn)組OD值;Ac表示空白對(duì)照組OD值。

1.3.5 菌株對(duì)細(xì)胞免疫因子分泌能力影響的測(cè)定

RAW264.7細(xì)胞以2×105個(gè)/mL濃度接種于24孔板中,待細(xì)胞貼壁后,去除上清液,進(jìn)行不用分組試驗(yàn)。各組設(shè)置如下(每組5個(gè)重復(fù)):

陰性對(duì)照組(DMEM):各孔中加100 μL DMEM,陰性對(duì)照組一孵育4 h,陰性對(duì)照組二孵育24 h;陽(yáng)性對(duì)照組(LPS):加入LPS,陽(yáng)性對(duì)照組一孵育4 h,陽(yáng)性對(duì)照組二孵育24 h;LGG組:各孔中加100 μL鼠李糖乳桿菌LGG活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h)。S131組:各孔中加100 μL嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);競(jìng)爭(zhēng)組(S131+LPS):在各孔中同時(shí)加入LPS和嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h(24 h);預(yù)防組(S131+LPS):各孔中先加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,然后再加入LPS,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h);治療組(LPS+S131):各孔中先加入LPS,然后再加入嗜熱鏈球菌S131活菌菌懸液或滅活菌菌懸液,活菌組孵育4 h+4 h(12 h+12 h)。(注:括號(hào)內(nèi)的時(shí)間為滅活菌需孵育時(shí)間,孵育均于37 ℃,5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行。)

收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液,1 000 r/min離心10 min后分裝到無(wú)菌離心管中,-80 ℃保藏備用。

按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定上述7種不同組中的TNF-α、IL-6和IL-10的細(xì)胞因子的分泌量[17-18]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株黏附能力的測(cè)定

通過(guò)對(duì)不同菌株黏附能力的檢測(cè)試驗(yàn),結(jié)果顯示,嗜熱鏈球菌S131和鼠李糖乳桿菌LGG菌株的活菌與滅活菌均顯示出一定的黏附能力。同一菌株(嗜熱鏈球菌S131或鼠李糖乳桿菌LGG)的活菌與滅活菌的黏附能力未表現(xiàn)出顯著性差異,通過(guò)對(duì)比不同菌株的黏附能力檢測(cè)結(jié)果,發(fā)現(xiàn)活化3代之后的嗜熱鏈球菌S131相較于鼠李糖乳桿菌LGG,其活菌和滅活菌株均表現(xiàn)出較強(qiáng)的黏附能力,且滅活菌結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01),結(jié)果見(jiàn)圖1。從該結(jié)果可以推論,具有較好黏附能力的嗜熱鏈球菌S131,也應(yīng)具備更加優(yōu)異的機(jī)體腸道定殖穩(wěn)定性潛力。該結(jié)論可以為嗜熱鏈球菌S131益生菌相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)與創(chuàng)新提供腸道定殖穩(wěn)定性的理論依據(jù),為后續(xù)研究提供良好的基礎(chǔ)。

圖1 菌株黏附實(shí)驗(yàn)各組吸光度值

2.2 嗜熱鏈球菌S131菌株產(chǎn)胞外多糖能力檢測(cè)

以MRS為對(duì)照組,葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)為y=0.005x-0.01,R2=0.998時(shí)胞外多糖含量為(304.2±0.416 3) μg/mL[19]。同條件下,嗜熱鏈球菌S131的胞外多糖產(chǎn)量測(cè)定結(jié)果為(444.2±2.013) μg/mL,存在極顯著差異(P<0.000 1)。研究表明,不同乳酸菌產(chǎn)胞外多糖的能力不同,產(chǎn)量大致在25～600 μg/mL[20]。本研究結(jié)果S131胞外多糖的產(chǎn)量在合理范圍之內(nèi)。此外,胞外多糖作為一種具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫的作用的活性生物大分子[21-22],嗜熱鏈球菌S131高產(chǎn)胞外多糖的生物特性,為其在調(diào)節(jié)免疫功能方面的應(yīng)用提供理論依據(jù)。同時(shí),結(jié)合糖代謝和生物信息學(xué)分析研究其菌株遺傳背景,為運(yùn)用基因工程獲得高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)胞外多糖菌株奠定基礎(chǔ)。

2.3 嗜熱鏈球菌S131對(duì)巨噬細(xì)胞增殖和吞噬能力的影響

通過(guò)對(duì)嗜熱鏈球菌S131對(duì)RAW264.7細(xì)胞增殖和吞噬試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。如圖2所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌對(duì)巨噬細(xì)胞均具有一定的促增殖能力;且進(jìn)一步試驗(yàn)研究表明,在同為活性菌株或者同為滅活菌株條件下,嗜熱鏈球菌S131對(duì)巨噬細(xì)胞的增殖能力高于鼠李糖桿乳菌LGG,且無(wú)顯著性差異。

圖2 不同菌株處理RAW264.7細(xì)胞的增殖率

如圖3所示,嗜熱鏈球菌S131的活菌與滅活菌均可促進(jìn)巨噬細(xì)胞的吞噬作用,且在同為活菌或同為滅活菌株條件下,滅活的嗜熱鏈球菌S131對(duì)巨噬細(xì)胞吞噬能力的促進(jìn)作用高于鼠李糖乳桿菌LGG,且該結(jié)果具有顯著性差異(P<0.01)。巨噬細(xì)胞在宿主抵抗外來(lái)物質(zhì)入侵機(jī)體,免疫防御和創(chuàng)傷修復(fù)等過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[23],結(jié)果顯示,嗜熱鏈球菌S131可以提高巨噬細(xì)胞增殖和吞噬能力,說(shuō)明S131可以激活巨噬細(xì)胞,進(jìn)而可以改善機(jī)體免疫力。此結(jié)果與FOO等[24]的結(jié)果相近,益生菌可以促巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞增殖和吞噬,進(jìn)而提升機(jī)體免疫力。

圖3 不同菌株處理RAW264.7細(xì)胞的吞噬率

2.4 菌株對(duì)巨噬細(xì)胞炎癥因子分泌量的影響結(jié)果

由表1可知,與陰性對(duì)照相比,S131活菌組和LGG活菌組與細(xì)胞共孵育可促進(jìn)細(xì)胞因子IL-10、IL-6和TNF-α的分泌,活菌組S131可上調(diào)TNF-α、IL-6和IL-10的分泌,引起生理性炎癥反應(yīng),提高機(jī)體免疫,且活菌組促細(xì)胞分泌IL-10的能力高于LGG活菌組,表現(xiàn)出較良好的激活免疫系統(tǒng)的能力;當(dāng)LPS誘導(dǎo)細(xì)胞形成炎癥細(xì)胞時(shí),S131活菌的競(jìng)爭(zhēng)組、治療組、預(yù)防組的TNF-α和IL-6值沒(méi)有出現(xiàn)差異,且分泌抑炎因子IL-10增多,說(shuō)明S131活菌可以增加炎癥反應(yīng)中抑炎因子IL-10的分泌,從而調(diào)節(jié)細(xì)胞炎癥反應(yīng)。細(xì)胞因子是由多種組織細(xì)胞合成分泌的小分子多肽或糖蛋白,且具有多種生物學(xué)功能,可以直接表征細(xì)胞功能。此結(jié)果與王琳琳[25]的研究結(jié)果相似,益生菌具有菌株特異性,部分菌株可以降低由LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥模型中促炎因子TNF-α和IL-6的分泌量,還可促抗炎因子IL-10的分泌。結(jié)果表明,S131在細(xì)胞處于正常狀態(tài)時(shí),可以促細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,進(jìn)而激活免疫細(xì)胞,提升免疫系統(tǒng)免疫能力;同時(shí),當(dāng)細(xì)胞處于炎癥狀態(tài)時(shí),S131可以下調(diào)促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進(jìn)而緩解細(xì)胞炎癥狀態(tài),說(shuō)明S131可以雙向調(diào)控巨噬細(xì)胞分泌細(xì)胞因子,證明其可激活細(xì)胞的免疫功能,進(jìn)而提升機(jī)體免疫力。

表1 各組中RAW264.7細(xì)胞分泌細(xì)胞因子結(jié)果

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,嗜熱鏈球菌S131具有良好的黏附能力,即可以較好地在腸道內(nèi)定殖;對(duì)菌株產(chǎn)胞外多糖能力的測(cè)定結(jié)果表明,嗜熱鏈球菌S131相較于對(duì)照組具有更優(yōu)良的產(chǎn)胞外多糖特性,大量研究表明,胞外多糖是益生菌生長(zhǎng)代謝過(guò)程中的主要次級(jí)代謝產(chǎn)物,其具有多種生理功能,可增強(qiáng)人體免疫力等[26]。同時(shí),也可作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑等運(yùn)用到食品、醫(yī)藥及生化產(chǎn)品等領(lǐng)域[27]。為進(jìn)一步研究S131代謝產(chǎn)物的開(kāi)發(fā)利用提供基礎(chǔ)。

巨噬細(xì)胞在機(jī)體免疫系統(tǒng)中處于關(guān)鍵位置,在機(jī)體免疫過(guò)程中,它發(fā)揮著監(jiān)視、防御、抗原識(shí)別和呈遞、調(diào)節(jié)和清除凋亡細(xì)胞等功能,是免疫反應(yīng)的第一道防線(xiàn)[28]。S131可以提升巨噬細(xì)胞的增殖和吞噬能力,其中增殖率和吞噬率作為巨噬細(xì)胞的活化能力最顯著的特征,具有增強(qiáng)宿主防御和自身免疫的能力[29]。說(shuō)明S131可以活化巨噬細(xì)胞,并提升機(jī)體的免疫力系統(tǒng)的免疫能力。

綜上,嗜熱鏈球菌S131可以定殖于腸道,并且可以高產(chǎn)胞外多糖,為之后繼續(xù)研究S131的功能方向提供良好的基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)依據(jù)。同時(shí)通過(guò)免疫細(xì)胞實(shí)驗(yàn),S131不僅可以激活正常狀態(tài)下的免疫細(xì)胞,增加其增殖和吞噬能力,還可促其分泌相關(guān)細(xì)胞因子;此外,S131還可降低炎癥狀態(tài)下促炎因子的分泌量,提升抗炎因子的分泌量,進(jìn)而緩解細(xì)胞的炎癥狀態(tài),S131可雙向調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞,改善不同狀態(tài)下免疫細(xì)胞的相關(guān)指標(biāo)。因此,認(rèn)為嗜熱鏈球菌S131具有調(diào)節(jié)免疫的功能,對(duì)于應(yīng)用于保健食品和提升機(jī)體免疫力益生菌產(chǎn)品開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。