鄭明朋,李亞軍,張眾,何曦,陳方圓,陳建勝,張軍翔

1(寧夏大學(xué) 農(nóng)學(xué)院,寧夏 銀川,750021)2(寧夏大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 3(寧夏君祥葡萄酒莊有限公司,寧夏 銀川,750021)4(寧夏大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院,寧夏 銀川,750021) 5(寧夏葡萄與葡萄酒研究院,寧夏 銀川,750021)

香氣是葡萄酒重要的感官特征,是評價葡萄酒品質(zhì)的核心指標(biāo)之一[1]。目前已經(jīng)在葡萄酒中檢測到了超過1 000余種揮發(fā)性物質(zhì),包括酯類、高級醇類、脂肪酸類、類異戊二烯類、醛酮類物質(zhì)和含硫化合物等,這些化合物的種類、濃度、感官閾值以及各種香氣物質(zhì)之間的相互作用,共同影響著葡萄酒的香氣品質(zhì)[2]。在酒精發(fā)酵過程中,釀酒酵母會產(chǎn)生許多揮發(fā)性香氣物質(zhì),包括酯、脂肪酸和高級醇等。酯類物質(zhì)是葡萄酒香氣物質(zhì)中最重要的香氣物質(zhì)之一,能夠給葡萄酒帶來花香和果香,葡萄酒中的酯類主要分為兩大類,分別是乙酸酯類和乙基酯類,乙酸酯由高級醇與乙酰-CoA通過酶促反應(yīng)形成[3],乙基酯由乙醇和短或中鏈脂肪酸在?；D(zhuǎn)移酶的催化作用下形成[4]。葡萄酒中的高級醇有兩種合成路徑,一種是氨基酸在轉(zhuǎn)氨酶的作用下生成酮酸,再在脫氫酶的作用下被還原成比氨基酸少一個碳原子的高級醇,即艾利希(Ebrlich)途徑[5];另一種合成路徑是酵母菌利用糖酵解過程產(chǎn)生的α-酮酸,在脫羧酶、脫氫酶等的作用下,逐步合成各種高級醇[6]。酵母菌通過糖酵解作用產(chǎn)生乙酰-CoA,在乙酰-CoA羧化酶(acetyl-CoA carboxylase,ACC)的作用下,將兩分子的乙酰-CoA催化形成一分子的丙二酰-CoA。丙二酰-CoA作為碳鏈延伸供體,在脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FAS)及?；d體蛋白(acylcarrier protein,ACP)的作用下,生成各種脂肪酸[7]。葡萄果實中的類異戊二烯以少量的游離態(tài)和大量結(jié)合態(tài)兩種形式存在,但只有游離態(tài)的類異戊二烯具有揮發(fā)性[8]。在葡萄酒釀造過程中,糖苷會在糖苷酶及酸性環(huán)境作用下水解,釋放出游離態(tài)的類異戊二烯[9]。

研究發(fā)酵過程中香氣成分及特征變化規(guī)律,對調(diào)控發(fā)酵過程中香氣成分及特征有重要意義。唐柯等[10]對威代爾冰葡萄酒發(fā)酵過程中香氣動態(tài)變化規(guī)律進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)醇類、芳香族類、酯類、酸類、萜烯類等化合物的含量隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸增加,并在發(fā)酵第14天時達(dá)到最高,隨后含量降低并趨于穩(wěn)定。陳明等[11]對蛇龍珠葡萄酒發(fā)酵過程中香氣變化進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)部分香氣物質(zhì)在發(fā)酵過程中始終存在,如乙酸乙酯、己酸乙酯和苯乙醇等;部分香氣物質(zhì)在葡萄漿果中存在,但在發(fā)酵過程中消失了,如1-己醇、反式-2-己烯醛等;還有部分香氣是在發(fā)酵過程中產(chǎn)生的,如異戊醇、辛酸乙酯和乙酸異戊酯等。MA等[12]對新疆小芒森甜白葡萄酒發(fā)酵過程中的香氣成分和特征進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)辛酸乙酯、乙酸異戊酯、丁酸乙酯、癸酸乙酯、異戊醇和辛酸等賦予了小芒森甜白葡萄酒果香和脂肪香氣。RAYMOND EDER等[13]對起泡酒瓶內(nèi)二次發(fā)酵過程中香氣成分和香氣特征進(jìn)行了研究,發(fā)現(xiàn)揮發(fā)性乙酯和萜烯類物質(zhì)與起泡酒的果香和花香有關(guān)。

‘霞多麗’是世界上最古老、分布最廣泛的釀酒葡萄品種之一[14],用其釀造的干白葡萄酒深受消費者喜愛,并且在賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)也有廣泛種植。左俊偉等[15]對賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣成分進(jìn)行了研究,共檢測出了49種香氣物質(zhì),香氣特征以青蘋果、草莓為主。陶永勝等[16]對中國主要葡萄酒產(chǎn)區(qū)‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣特征與成分進(jìn)行了研究,并確定了6種香氣特征:柑橘、菠蘿、紫羅蘭、石灰水、青蘋果和檸檬。目前,對發(fā)酵完成后‘霞多麗’干白葡萄酒的香氣成分與特征研究較多,但對釀造過程中香氣成分與特征變化的研究還鮮有報道。因此,本實驗以賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)‘霞多麗’葡萄為實驗材料,通過檢測發(fā)酵過程中香氣成分的變化,并對發(fā)酵過程中的酒樣進(jìn)行香氣特征感官品評,來研究發(fā)酵過程中香氣成分與特征的變化規(guī)律,為‘霞多麗’干白葡萄酒香氣成分與特征的調(diào)控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

原料:‘霞多麗’釀酒葡萄于2021年9月1日采自賀蘭山東麓青銅峽產(chǎn)區(qū),葡萄樹為5～6年的自根苗,總糖含量(以葡萄糖計)為233 g/L,可滴定酸含量(以酒石酸計)為5.85 g/L,pH值為3.67。

釀酒輔料:Excellence TXL活性干酵母、Vinozym vintage FCE果膠酶、偏重亞硫酸鉀、PVPP等,法國Lamothe-Abiet公司。

試劑及標(biāo)準(zhǔn)品:氫氧化鈉、亞硫酸氫鈉、濃硫酸、氯化鈉等均為分析純,國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;C8～C20正構(gòu)烷烴(≥99.7%,GC);美國Sigma-Aldrich公司;香氣物質(zhì)標(biāo)品(≥98.0%,GC),日本TCI公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B氣相色譜-7000D質(zhì)譜聯(lián)用儀、DB-WAX色譜柱(60 m×250 μm,0.25 μm),美國Agilent公司;PAL3自動進(jìn)樣器,瑞士CTC公司;雷磁PHS-3CpH計,上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;ME104E電子天平,瑞士METTLE公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 葡萄酒釀造工藝

葡萄采收后經(jīng)除梗、破碎、壓榨取汁、澄清后,將葡萄汁裝入5 L玻璃發(fā)酵罐中,做3個重復(fù),以常規(guī)工藝進(jìn)行發(fā)酵。釀造參數(shù)為加入60 mg/L偏重亞硫酸鉀、30 mg/L果膠酶,4 ℃澄清24 h、分離后接種200 mg/L TXL活性干酵母,發(fā)酵溫度控制在19～21 ℃。每天在同一時間測量比重、溫度和二氧化碳散失量,當(dāng)比重降至0.994以下時,結(jié)束發(fā)酵。

1.3.2 發(fā)酵過程中的取樣

壓榨取汁澄清后采樣,記為發(fā)酵第0天。采樣結(jié)束后,接種酵母,之后每2 d在同一時間點進(jìn)行采樣,每次采樣量為650 mL,直到發(fā)酵結(jié)束。采樣結(jié)束后,迅速將需要香氣成分檢測的樣品用液氮淬滅,并將樣品放入-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 發(fā)酵過程中香氣特征感官品評

感官品評樣品與香氣檢測樣品同時采樣,每次采樣結(jié)束后,立即對樣品進(jìn)行香氣特征感官品評。感官品評小組由20名具有2年以上葡萄酒品嘗經(jīng)驗的專業(yè)人員(年齡22～30歲、男生8人、女生12人)組成,在標(biāo)準(zhǔn)品酒室(ISO 8589—1998)使用標(biāo)準(zhǔn)品酒杯(ISO 3591—1997)進(jìn)行品鑒。香氣特征感官評分采用0～10分制(0分:無此類香氣;1～2分:微弱且較難分辨:3～4分:能分辨但比較微弱;5～6分:能分辨但不夠強烈;7～8分:能分辨且強烈;9～10分:非常強烈)[17]。香氣特征詞匯根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)及品評小組成員共同討論得出[15-16]。

1.3.4 揮發(fā)性成分測定

使用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(headspace-solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry,HS-SPME-GC-MS)技術(shù)對葡萄酒香氣成分進(jìn)行檢測,檢測方法參考張眾等[18]的研究,并做略作修改。

頂空固相微萃取:將1.5 g氯化鈉、5 mL酒樣、10 μL 4-甲基-2-戊醇內(nèi)標(biāo)(1.008 3 g/L)依次加入20 mL 的頂空瓶中,并加入磁子;將頂空瓶置于集熱式恒溫磁力攪拌器中,并將纖維萃取頭置入頂空瓶中,轉(zhuǎn)速250 r/min,40 ℃萃取30 min。

色譜條件:進(jìn)樣口溫度230 ℃;升溫程序:起始柱溫50 ℃,恒溫1 min,3 ℃/min 升到220 ℃,保持5 min;載氣高純氦氣(純度≥99.999%),流速1 mL/min,不分流進(jìn)樣。

質(zhì)譜條件:傳輸線溫度235 ℃,離子源溫度230 ℃,電子能量70 eV;質(zhì)量掃描范圍m/z29～350。

揮發(fā)性物質(zhì)定性定量分析:提取揮發(fā)性成分質(zhì)譜圖,通過NIST 17譜庫進(jìn)行檢索,并根據(jù)C8～C20烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品的保留時間,用保留指數(shù)法(retention index,RI)計算各香氣成分的保留指數(shù)從而進(jìn)行定性分析[19]。對有標(biāo)品的香氣成分用其標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量,沒有標(biāo)品的香氣成分以4-甲基-2-戊醇為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行半定量。對于用標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的香氣成分,對其香氣活度值(odor activity value,OAV)進(jìn)行計算,半定量的香氣成分不計算OAV。

(1)

式中:OAV,香氣活度值;香氣成分含量,μg/L;香氣閾值,μg/L。

1.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

使用Microsoft Office 2016和IBM SPSS Statistics 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計;使用Origin 2021軟件繪制堆積柱狀圖和雷達(dá)圖,并基于其中的Heat Map with Dendrogram APP繪制聚類熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵階段分析

為了將‘霞多麗’干白葡萄酒的發(fā)酵階段進(jìn)行劃分,對發(fā)酵時間進(jìn)行聚類,如圖1所示,根據(jù)香氣成分含量的變化,將發(fā)酵過程劃分為4個階段:發(fā)酵初期、發(fā)酵前中期、發(fā)酵中后期和發(fā)酵末期。發(fā)酵初期包括第0天和第2天,此階段大多數(shù)香氣成分含量最低,只有壬酸、正己醇、丙醇、α-松油醇和里那醇的含量較高。發(fā)酵前中期為發(fā)酵第4天,此階段大多數(shù)香氣成分的含量明顯升高。發(fā)酵中后期包括第6天和第8天,此階段大多數(shù)香氣成分的含量進(jìn)一步提高,但壬酸、正己醇和里那醇的含量降低。發(fā)酵末期包括第10天和第12天,此階段大多數(shù)香氣成分的含量進(jìn)一步升高,并達(dá)到最大值,但壬酸、己酸甲酯、正己醇、丙醇和己酸異戊酯的含量降低。正己醇和丙醇在在發(fā)酵前中期含量最高,在發(fā)酵末期含量降低,這是因為正己醇主要在發(fā)酵前中期,由來自葡萄皮的脂肪酸前體經(jīng)酶促和化學(xué)氧化形成,不在發(fā)酵過程中產(chǎn)生[20],并且不斷與乙酸發(fā)生反應(yīng),生成了乙酸己酯;丙醇只能由蘇氨酸通過轉(zhuǎn)氨作用產(chǎn)生,當(dāng)葡萄汁中的可同化氮耗盡時,丙醇便不再產(chǎn)生,且隨著發(fā)酵的進(jìn)行不斷散失[21]。

圖1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵時間聚類熱圖

2.2 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣成分總量變化

本研究共檢測出47種香氣成分,可分為酯、高級醇、脂肪酸、類異戊二烯和醛酮類5個類別。為研究‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣成分總量變化,將所有香氣成分的含量相加,做成堆積柱狀圖,如圖2-a所示,香氣成分總量在發(fā)酵初期最低,在發(fā)酵前中期和中后期迅速增加,在發(fā)酵末期達(dá)到最大值,與MORAKUL等[22]的研究結(jié)果一致。

a-香氣成分總量;b-香氣成分比例

在‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中,不同種類香氣成分的含量比例在不斷變化,如圖2-b所示,發(fā)酵第0天,高級醇比例最高,為79%;從發(fā)酵第2天至發(fā)酵結(jié)束,高級醇比例降低,且趨于穩(wěn)定;酯類比例呈先增加后降低的趨勢;脂肪酸比例呈遞增趨勢,在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最高;醛酮類和類異戊二烯的占比較低,都低于1%。

2.3 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中不同種類香氣成分含量變化

為進(jìn)一步研究‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中不同種類香氣成分含量變化,繼續(xù)將酯、高級醇、脂肪酸、類異戊二烯和醛酮類物質(zhì)的含量做成堆積柱狀圖。

如圖3-a所示,發(fā)酵第0天,酒樣中酯類物質(zhì)含量最低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,酯類物質(zhì)的總量遞增,發(fā)酵第10天時,達(dá)到最大值,發(fā)酵結(jié)束時降低,與胡博然[23]的研究結(jié)果一致。月桂酸乙酯、癸酸乙酯等大多數(shù)乙酯的含量遞增,并在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值,但辛酸乙酯、己酸乙酯的含量在發(fā)酵結(jié)束時降低;同時乙酸異戊酯、乙酸苯乙酯等乙酸酯的含量均在發(fā)酵結(jié)束時降低。酯類物質(zhì)中含量最高的是乙酸異戊酯。

a-酯類總量;b-高級醇類總量;c-脂肪酸類總量;d-類異戊二烯類總量;e-醛酮類總量

葡萄酒中酯類物質(zhì)的釋放與平衡分配系數(shù)(Ki值)呈正相關(guān)性,Ki值主要受溫度和葡萄汁成分的影響[24]。發(fā)酵末期,酯類物質(zhì)生產(chǎn)速率降低,生成量減少;并且在發(fā)酵末期,酒液中酯類物質(zhì)濃度逐漸積累到一個最大值,使Ki值不斷增大,增強了香氣物質(zhì)的揮發(fā)性,最終致使散失量大于生成量,導(dǎo)致發(fā)酵結(jié)束時酯類物質(zhì)總量降低。

如圖3-b所示,發(fā)酵第0天,酒樣中高級醇類物質(zhì)的總量最低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,其總量遞增,發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值,與MOURET等[21]的研究結(jié)果一致。正己醇、丙醇的含量在發(fā)酵前期含量最高,隨后逐漸降低;正丁醇的含量在從第2天開始保持相對穩(wěn)定;2,3-丁二醇和異丁醇的含量一直遞增,并在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值;異戊醇、苯乙醇的含量在發(fā)酵第8天達(dá)到最大值,發(fā)酵結(jié)束時略有降低。高級醇類物質(zhì)中含量最高的是異戊醇。

如圖3-c所示,在發(fā)酵第0天,脂肪酸類物質(zhì)的總量最低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,逐漸升高,發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值,與KONG等[25]研究結(jié)果一致。在脂肪酸類物質(zhì)中,只有乙酸的含量遞增,其余脂肪酸的含量在發(fā)酵第8天達(dá)到最大值后,均在發(fā)酵結(jié)束時降低。脂肪酸類物質(zhì)中含量最高的是乙酸。

葡萄酒中游離態(tài)的類異戊二烯來自糖苷態(tài)類異戊二烯的水解。糖苷態(tài)類異戊二烯的水解有兩種方式,一是由釀酒酵母產(chǎn)生的糖苷酶的酶解作用,二是在釀造環(huán)境下的酸水解。在發(fā)酵過程中,葡萄糖的濃度逐漸降低,糖苷酶受到葡萄糖的抑制作用逐漸減弱,活性增強[26];并且隨著酒精發(fā)酵的進(jìn)行,整個發(fā)酵體系的pH不斷降低,酸水解的作用也不斷增強[27],最終使類異戊二烯物質(zhì)的總量在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值。

如圖3-e所示,醛酮類物質(zhì)在發(fā)酵第0天含量最低,隨著發(fā)酵的進(jìn)行逐漸升高,在第6天達(dá)到最大值,隨后呈遞減趨勢,與胡博然[23]的研究結(jié)果類似。

2.4 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣特征變化

在發(fā)酵過程中,會產(chǎn)生大量的香氣物質(zhì),當(dāng)香氣物質(zhì)的OAV>1時,便會對葡萄酒的香氣特征產(chǎn)生影響[28]。表1是‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣物質(zhì)OVA表,圖4是‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣特征雷達(dá)圖,可以看到,葡萄汁的香氣特征以甜香為主。葡萄汁中只有己酸、α-大馬士酮和癸醛的OAV>1,葡萄汁的甜香香氣特征可能與與α-大馬士酮和癸醛有關(guān)。

表1 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中OAV

圖4 ‘霞多麗’干白葡萄酒發(fā)酵過程中香氣特征雷達(dá)圖

發(fā)酵第2天,乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、丙醇、苯乙醇、己酸、辛酸的OAV>1,使酒樣出現(xiàn)香蕉、蘋果、梨、菠蘿、蜂蜜的香氣特征,柑橘香氣特征的出現(xiàn)可能與癸醛有關(guān)。發(fā)酵第4天,除上述香氣成分外,新增OAV>1的有丁酸乙酯、乙酸己酯、乙酸苯乙酯和異丁醇,使酒樣的蘋果、桃子的香氣特征增強,并且上述其他香氣特征也隨著香氣成分含量的增加進(jìn)一步增強。酒樣的柑橘、檸檬香氣特征增強,可能與香葉醇和香茅醇的生成有關(guān)。發(fā)酵第4天,琥珀酸二乙酯的OAV>0.5,雖然<1,但可能與其他香氣成分共同起作用,使酒樣的甜瓜香氣特征增強。

從發(fā)酵第6天到第10天,除上述香氣成分外,2,3-丁二醇和癸酸從第8天開始OAV>1,分別給酒樣帶來果香和脂肪味,堅果香氣特征增強可能與癸酸有關(guān)。酒樣的蘋果、香蕉、梨、菠蘿、甜瓜、柑橘、檸檬、蜂蜜的香氣特征評分隨著丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、琥珀酸二乙酯、乙酸苯乙酯、異戊醇、苯乙醇、香茅醇的含量在發(fā)酵第8天或第10天達(dá)到最大值。

發(fā)酵第12天,2,3-丁二醇、癸酸乙酯的OAV繼續(xù)增加,上述酯、高級醇和脂肪酸類物質(zhì)的OAV均降低,導(dǎo)致蘋果、香蕉、梨、菠蘿、甜瓜、蜂蜜、柑橘、檸檬、堅果的香氣特征評分降低。月桂酸乙酯的OAV>1,可給酒樣帶來花香,洋槐花香氣特征評分在第12天到達(dá)最大值,可能與月桂酸乙酯有關(guān)。

3 結(jié)論

在‘霞多麗’干白葡萄酒的發(fā)酵過程中,根據(jù)香氣成分含量的變化,可將發(fā)酵過程分為發(fā)酵初期、發(fā)酵前中期、發(fā)酵中后期和發(fā)酵末期4個階段。隨著發(fā)酵的進(jìn)行,香氣成分總量呈遞增趨勢,并在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值;高級醇、脂肪酸、類異戊二烯類物質(zhì)的總量呈遞增趨勢,在發(fā)酵結(jié)束時達(dá)到最大值;酯類物質(zhì)總量在第10天達(dá)到最大值,在發(fā)酵結(jié)束時略有降低;醛酮類物質(zhì)總量在第6天達(dá)到最大值,隨后逐漸降低。葡萄汁的香氣特征以甜香為主,隨著發(fā)酵的進(jìn)行,出現(xiàn)了梨、蘋果、桃子、甜瓜、菠蘿、香蕉、柑橘、檸檬、蜂蜜、堅果和洋槐花的香氣特征并逐漸增強;桃子、甜瓜、蜂蜜、堅果、柑橘的香氣特征在發(fā)酵第8天到達(dá)最大值,梨、蘋果、菠蘿、香蕉、檸檬的香氣特征在發(fā)酵第10天到達(dá)最大值,洋槐花的香氣特征在發(fā)酵結(jié)束時到達(dá)最大值。