張祖麗,徐歡,李歆,覃平,張國棟*,莫洪

1(西華大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院,四川 成都,610039)2(雅途生物技術(shù)(成都)有限公司,四川 成都,610041)

納他霉素(natamycin),又名海松霉素或游鏈霉素,主要是由納他霉素鏈霉菌生產(chǎn)的天然抗菌劑,兼具適用范圍廣、抗真菌性強(qiáng)、熱穩(wěn)定性好、安全性高等諸多優(yōu)勢[1]。納他霉素對細(xì)胞膜含甾醇類物質(zhì)的真菌有極強(qiáng)的抑菌和殺菌作用,例如酵母、霉菌等[2]。在最新版的食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)中,將納他霉素歸屬于天然食品防腐劑之一,在糕點(diǎn)類食品中的最大允許使用量為0.3 g/kg,殘留量應(yīng)小于10 mg/kg。迄今為止,納他霉素在食品工業(yè)中已被廣泛使用,例如肉制品、乳制品、果蔬、飲料以及烘焙食品等[3-6]。此外,在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域,納他霉素也可作為一種高效抗菌物質(zhì),治療由真菌感染引起的多種眼部疾病,如真菌性角膜炎、結(jié)膜等[7-8]。

納他霉素作為一種純天然多烯類抗生素,分子式為C33H47NO13,其抗真菌活性與多烯抗生素家族其他成員相似,主要是通過與真菌細(xì)胞中麥角甾醇的特異性功能發(fā)揮作用。研究表明,納他霉素能夠以甾醇依賴性的方式干預(yù)液泡的融合和裂變過程,進(jìn)而阻斷真菌的正常生長代謝過程,達(dá)到抗菌的目的[9-12]。此外,納他霉素中的特殊結(jié)構(gòu)也能與甾醇形成復(fù)合物,改變質(zhì)膜的選擇性滲透能力,使細(xì)胞營養(yǎng)成分外滲,最終死亡[13]。研究發(fā)現(xiàn),0.5～6.0 mg/kg納他霉素處理液能夠抑制引起食品腐敗變質(zhì)的主要霉菌;而酵母類真菌一般在1.0～5.0 mg/kg的納他霉素濃度下會被抑制[14]。納他霉素在水和油脂中的溶解度極低,即使人體攝入了少量的納他霉素也會隨糞便排除體外,不會對人體造成任何有害影響[15]。在食品中,納他霉素即使存在部分殘留,也非常容易檢出,最新的相關(guān)檢測方法包括高效液相色譜法[16]、超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜[17],液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜法[18]以及免疫測定[19]等。蛋糕是以面粉、油脂、白砂糖、蛋和水為原料,適當(dāng)添加其他輔料,經(jīng)調(diào)制、灌模、烘烤而成的糕點(diǎn)類食品[20]。蛋糕因其造型優(yōu)美,口感香甜以及色彩艷麗,受到男女老幼的喜愛。然而因?yàn)槠錉I養(yǎng)豐富,水分含量高,易導(dǎo)致以霉菌為主的微生物生長繁殖,不易保存。霉菌作為需氧菌,所以由其引起的污染和腐敗,總是發(fā)生在蛋糕表面,故本實(shí)驗(yàn)采用噴灑的方式,對蛋糕進(jìn)行表面防腐處理,探究納他霉素在蛋糕貯藏過程中的抑菌作用,并通過與糕點(diǎn)類食品中使用最廣泛的3類防腐劑的抑菌效果和成本進(jìn)行對比分析,為納他霉素在糕點(diǎn)類食品中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

納他霉素(食品級),成都雅途生物技術(shù)有限公司;丙酸鈣、山梨酸鉀、脫氫乙酸鈉(食品級)、乙醇(95%,體積分?jǐn)?shù))、氯霉素、牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖(分析純),成都科龍化工試劑廠。

LDZX-75KB立式壓力蒸汽滅菌器,上海申安醫(yī)療器械廠;DUP-9082電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海齊欣科學(xué)儀器有限公司;PT2531烤箱,美的電器有限公司;HH-2型恒溫水浴鍋、SW-CI-2F蘇州安泰雙人雙面凈化工作臺,常州國華電器有限公司;pHS-3C酸度計(jì),成都世紀(jì)方舟科技有限公司等。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋糕制作

先將雞蛋和白糖攪拌至原體積的3倍,按照一定比例添加過篩后的低筋面粉,攪拌均勻,灌入模具中定型。隨后將模具放入烘箱中烘烤(108 ℃,30 min),出爐冷卻后即可倒出模具。最后裝入無菌密封袋中備用。

1.2.2 防腐劑配制和添加

1.2.2.1 納他霉素處理液的配制

準(zhǔn)確稱取一定量的納他霉素,配制成質(zhì)量濃度依次為100、200、300、400、500 mg/L的懸浮液,即本實(shí)驗(yàn)用于噴灑蛋糕表面的防腐劑處理液。

1.2.2.2 蛋糕表面防腐處理

將烘烤好的蛋糕置于室溫下冷卻至脫模,在蛋糕表面按0.013 mL/g噴灑不同濃度的納他霉素處理液,同時(shí)以噴灑等量的蒸餾水為空白對照,在室溫下晾干,使用無菌保鮮袋密封包裝后置于室溫下貯藏。同時(shí)配制3種蛋糕中最常用使用的防腐劑(丙酸鈣、山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉)處理液,作為蛋糕防腐效果研究的對照。各實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次,取平均值為最終試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.3 微生物檢測

1.2.3.1 培養(yǎng)基的配制

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基:按照培養(yǎng)基所要求的比例,調(diào)節(jié)pH值為7.4,添加適量的瓊脂,分裝于錐形瓶中高壓蒸汽滅菌。

PDA培養(yǎng)基:選取大小適中的馬鈴薯,清洗,去皮切塊,稱取200 g,添加適量的蒸餾水,加熱煮沸10～20 min,使用雙層紗布過濾出濾液,隨后向?yàn)V液中添加適量的蒸餾水稀釋至1 000 mL,稱取20 g葡萄糖、15 g左右瓊脂和0.1 g的氯霉素(預(yù)先用少量95%的乙醇溶液溶解),在0.07 MPa(115 ℃)滅菌20 min。

1.2.3.2 霉菌與細(xì)菌檢測

使用平板菌落計(jì)數(shù)法測定蛋糕表面的微生物菌落,PDA培養(yǎng)基用于霉菌檢測,牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基用于細(xì)菌檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 納他霉素應(yīng)用于蛋糕表面的防腐作用與效果

如圖1所示,隨著蛋糕保藏時(shí)間的延長,霉菌菌落數(shù)呈現(xiàn)不斷上升的趨勢。使用不同濃度的納他霉素懸浮液處理的蛋糕,其表面的霉菌增長速率明顯慢于空白組,且納他霉素濃度越大,霉菌增長速率越慢。結(jié)果表明,納他霉素濃度與霉菌的抑菌能力之間存在一定正相關(guān)性。100 mg/kg納他霉素濃度處理的蛋糕和空白組蛋糕表面霉菌菌落數(shù)均于第4天超標(biāo)(GB 7099—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 糕點(diǎn)、面包》中規(guī)定糕點(diǎn)霉菌菌落數(shù)≤150 CFU/g),而納他霉素濃度為300 mg/kg時(shí),蛋糕霉菌菌落數(shù)于第6天才超標(biāo),其霉菌菌落數(shù)約為空白組的一半。

圖1 納他霉素濃度對蛋糕表面霉菌菌落數(shù)的影響

從圖2可以更清楚地看出,不同濃度納他霉素抑菌效果的差異?？傮w來說,納他霉素對霉菌的抑制能力隨濃度的增加而增強(qiáng),但當(dāng)增加到300 mg/kg時(shí),繼續(xù)增加納他霉素處理濃度,對蛋糕表面的防腐效果提升并不明顯,其霉菌指標(biāo)均低于食品安全標(biāo)準(zhǔn)的限定值。因此,在有效延長蛋糕貨架期、減少防腐劑使用成本的同時(shí),為提高安全性,應(yīng)盡可能降低其在蛋糕中的殘留量。故選擇噴灑300～400 mg/kg的納他霉素濃度,對蛋糕進(jìn)行表面防腐處理,不僅可有效抑制霉菌生長,又能保證足夠的安全性。

圖2 納他霉素濃度對蛋糕表面霉菌的抑菌效果

由圖3可知,在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi),蛋糕表面噴灑不同濃度的納他霉素懸浮液后,對細(xì)菌的抑制作用差異都不明顯。這也與目前廣泛認(rèn)同的納他霉素抑菌機(jī)理相符[21],即納他霉素主要是抑制真菌類微生物的生長繁殖,而對細(xì)胞膜不含甾醇類物質(zhì)的細(xì)菌并無抑制效果。在第6天時(shí),噴灑納他霉素的蛋糕表面細(xì)菌菌落總數(shù)甚至略大于空白組,可能是因?yàn)榭瞻捉M蛋糕表面霉菌的大量生長繁殖進(jìn)而抑制了細(xì)菌的生長[22]。

圖3 納他霉素濃度對蛋糕表面細(xì)菌菌落數(shù)的影響

2.2 納他霉素和丙酸鈣在蛋糕表面防腐效果的比較

從圖4中可以發(fā)現(xiàn),與空白對照相比,蛋糕表面噴灑納他霉素和丙酸鈣懸浮液都能起到抑制霉菌生長的作用。在相同條件下,用500 mg/kg的丙酸鈣與300 mg/kg的納他霉素處理后的蛋糕,保藏6 d后,霉菌菌落數(shù)均為(122±1) CFU/g,可以看出,要達(dá)到同樣的效果,丙酸鈣需要遠(yuǎn)遠(yuǎn)更高的濃度,表明納他霉素對蛋糕的防腐能力比丙酸鈣更好。在實(shí)驗(yàn)時(shí)間內(nèi),未經(jīng)防腐劑處理的蛋糕在第3天時(shí)霉菌菌落超標(biāo),而蛋糕表面噴灑300 mg/kg和400 mg/kg的丙酸鈣后,保質(zhì)期能延長2 d,在第6天霉菌菌落數(shù)超標(biāo)。納他霉素處理后的蛋糕則可將蛋糕保質(zhì)期延長4 d左右,說明納他霉素比目前市面上在糕點(diǎn)中使用廣泛的丙酸鈣的抑菌防腐效果更好[23]。

圖4 納他霉素和丙酸鈣對蛋糕表面霉菌抑制效果

2.3 納他霉素與脫氫乙酸鈉和山梨酸鉀在蛋糕表面防腐效果的比較

對比圖1和圖5、圖6可以發(fā)現(xiàn),不同濃度的納他霉素、山梨酸鉀以及脫氫乙酸鈉對蛋糕表面霉菌的生長繁殖具有抑制作用。0.3 g/kg的納他霉素處理濃度,可使蛋糕保質(zhì)期延長4 d,而3 g/kg的山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉處理后的蛋糕保質(zhì)期僅能延長2 d,這表明,納他霉素對蛋糕霉菌的抑制效果明顯優(yōu)于山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉。納他霉素對細(xì)菌不發(fā)揮作用,只對霉菌有專一性抑制能力[24-25]。結(jié)合兩張圖分析發(fā)現(xiàn),蛋糕表面分別噴灑9 g/kg的山梨酸鉀和脫氫乙酸鈉后,前者第4天時(shí)的霉菌菌落數(shù)大于后者第5天時(shí)的霉菌菌落數(shù),說明山梨酸鉀對蛋糕霉菌的抑制能力弱于脫氫乙酸鈉。但有很多資料表明,山梨酸鉀對細(xì)菌的抑菌能力大于脫氫乙酸鈉[26-27],而且山梨酸鉀是公認(rèn)毒性最小的防腐劑之一,所以選擇山梨酸鉀與納他霉素進(jìn)行復(fù)配,既具有很高的安全性,又能彌補(bǔ)彼此抑菌譜的不足,形成能夠同時(shí)抑制霉菌和細(xì)菌的復(fù)合防腐劑。

圖5 山梨酸鉀對蛋糕表面霉菌的抑制效果

圖6 脫氫乙酸鈉對蛋糕表面霉菌的抑制效果

2.4 納他霉素與山梨酸鉀復(fù)配在蛋糕中防腐效果

在烘焙食品中,引起腐敗變質(zhì)的微生物除了霉菌外,細(xì)菌也是導(dǎo)致其變質(zhì)的原因之一。常見的枯草芽孢桿菌孢子具有極強(qiáng)的耐熱性,通常存在于面粉、糖和酵母等原材料中[28]。從上述實(shí)驗(yàn)可以看出,納他霉素對霉菌類的真菌有很強(qiáng)的防腐效果,而山梨酸鉀不僅對霉菌有一定的抑制能力,同時(shí)對細(xì)菌的抑制作用也優(yōu)于丙酸鈣和脫氫乙酸鈉。因此,為了更好地延長蛋糕的保質(zhì)期,實(shí)驗(yàn)選擇納他霉素和山梨酸鉀進(jìn)行復(fù)配,通過單因素正交試驗(yàn),探究復(fù)配防腐劑在蛋糕中的最佳配比,為納他霉素在蛋糕類焙烤食品中的應(yīng)用提供理論參考。表1為正交試驗(yàn)結(jié)果的評分標(biāo)準(zhǔn)。

表1 正交試驗(yàn)結(jié)果評分表

通過對前期實(shí)驗(yàn)的分析可知,山梨酸鉀含量7 g/kg時(shí)對蛋糕的抑菌效果最佳。所以,根據(jù)單因素試驗(yàn)中兩種防腐劑的最佳處理濃度選取L9(34)正交試驗(yàn),其中,納他霉素含量為0.2～0.4 g/kg,山梨酸鉀含量為6～8 g/kg,如表2所示。

表2 復(fù)配防腐劑正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)表 單位:g/kg

從表3中可以看出,經(jīng)過復(fù)配防腐劑處理的蛋糕保藏5 d后,在直觀分析中的最優(yōu)水平組合為A3B3(納他霉素最佳噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.4 g/kg,山梨酸鉀最佳噴灑質(zhì)量分?jǐn)?shù)為8 g/kg),其次是A3B2。由表4可知,納他霉素對蛋糕表面防腐效果的影響極顯著,山梨酸鉀對蛋糕表面防腐效果的影響不顯著。

表3 復(fù)配防腐劑的正交試驗(yàn)結(jié)果分析

表4 復(fù)配防腐劑的正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析(第5天)

結(jié)合圖1、圖5的結(jié)果,從圖7中可以發(fā)現(xiàn),復(fù)配防腐劑對蛋糕表面細(xì)菌與霉菌的抑菌能力更強(qiáng),這表明納他霉素與山梨酸鉀復(fù)配液在蛋糕表面可以發(fā)揮抑菌防腐的協(xié)同作用。使用最佳配比防腐劑復(fù)配液噴灑蛋糕表面后,可以使蛋糕的保質(zhì)期延長至10 d以上,且兩項(xiàng)微生物指標(biāo)均符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求(細(xì)菌菌落總數(shù)≤104CFU/g,霉菌菌落數(shù)≤150 CFU/g),而未使用防腐劑的蛋糕只有2 d的保質(zhì)期。同時(shí)對蛋糕表面殘留量的檢測發(fā)現(xiàn),納他霉素殘留量為5.4 mg/kg,山梨酸鉀為0.107 7 g/kg,均遠(yuǎn)小于GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》所規(guī)定的最大殘留量10 mg/kg和1 g/kg。

圖7 最佳配比防腐劑對蛋糕表面霉菌和細(xì)菌的抑菌效果

2.5 納他霉素在蛋糕中應(yīng)用的成本分析以及與其他防腐劑的比較

蛋糕作為廣受男女老幼喜愛的糕點(diǎn)食品,雖然納他霉素對蛋糕表面的霉菌有較好的抑制作用,但考慮到食品加工中蛋糕的生產(chǎn)量大、適用人群廣,因此也需要綜合考慮防腐劑的使用成本。因此,在達(dá)到同樣抑菌效果的條件下,各防腐劑在蛋糕中的使用成本,結(jié)果如表6所示。

由表5、表6可知,納他霉素的市場價(jià)格雖遠(yuǎn)高于其他3種防腐劑的價(jià)格,但由于在蛋糕中的實(shí)際使用量最小,并且對霉菌的抑菌效果最好,從綜合角度考慮,在蛋糕類糕點(diǎn)食品中,納他霉素具有低成本,安全性高等優(yōu)勢?？傊?可以認(rèn)為納他霉素是作為蛋糕防腐保鮮的最佳防腐劑之一。

表5 常見防腐劑的市場銷售價(jià)格

表6 常見防腐劑在蛋糕中的使用殘留量及成本分析

3 結(jié)論與討論

納他霉素作為一種天然食品生物防腐劑,具有較高的安全性,可應(yīng)用于蛋糕類的焙烤食品防腐保鮮。在低成本和低劑量的條件下,既可以保證食品的原有風(fēng)味,又能發(fā)揮較強(qiáng)的抑菌作用,延長蛋糕的保質(zhì)期。綜合考慮,將納他霉素噴灑于蛋糕表面進(jìn)行防腐保鮮,具有非常好的應(yīng)用前景。納他霉素最佳使用濃度為300～400 mg/kg,與安全性高的山梨酸鉀進(jìn)行復(fù)配,可產(chǎn)生協(xié)同作用,使蛋糕保質(zhì)期延長至10 d以上。其最優(yōu)復(fù)配液的使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為納他霉素0.4 g/kg,山梨酸鉀8 g/kg,此時(shí)既能保證蛋糕的品質(zhì),又具有很高的安全性。