寇靜,史琳娜,馬添翼

(陜西中醫(yī)藥大學 醫(yī)學技術學院,陜西 咸陽,712046)

隨著人們生活習慣和膳食結構的改變,肥胖和高脂血癥在全球范圍內的發(fā)病率日趨增高。高脂血癥是指因機體內脂肪代謝異常,使血漿中的一種或多種脂質高于正常指標的一種代謝紊亂綜合癥。其與冠心病、腦中風、高血壓等高致死率疾病的形成過程密切相關,同時,也是引起脂肪肝、動脈粥樣硬化和心腦血管疾病的罪魁禍首[1]。研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食會改變腸道微生物結構,增加腸胃炎癥性反應,進而對代謝及免疫系統(tǒng)造成不利影響[2]。近年來,國內外學者研究發(fā)現(xiàn),腸道微生物與脂質代謝之間存在著錯綜復雜的關系。腸道微生物能夠通過控制宿主從食物中攝取能量的效率,來調控脂肪代謝以及高脂血癥的發(fā)生[3],高脂血癥通過破壞腸道微生物賴以生存的環(huán)境來影響腸道菌群的構成[4]。目前臨床上對高脂血癥的治療主要以他汀類藥物為主,該類藥物在治療中常會伴隨如肝損害、肌肉毒性和出血性腦卒中等一些不良反應。因此,尋求安全、天然的降血脂藥是當前高脂血癥治療領域的迫切需求。

茯磚茶是中國地區(qū)特有的一類黑茶,其經過微生物后發(fā)酵過程,在茶葉表面和內部形成獨特的“金花”-冠突散囊菌(Eurotiumcristatum)。眾多研究報道了茯磚茶在降脂減肥、降糖降壓、抑制炎癥、保護肝臟、調節(jié)腸道菌群等方面的保健功效[5-6]。近期研究表明,茯磚茶具有多種生物活性,特別是抗肥胖和降脂活性為當前研究的熱點,同時,越來越多的研究表明其調節(jié)脂代謝的活性可能跟其調節(jié)腸道菌群活性相關[7-8]。甘薯(Dioscoreaesculenta(Lour.) Burkill)屬旋花科,又名白薯、番薯、紅薯等,莖葉含有大量的蛋白質、胡蘿卜素、類胡蘿卜素、維生素以及黃酮類、酚類和一些人體所需的必需氨基酸等。甘薯提取物具有較好的降血脂和降膽固醇、防止動脈硬化、抗衰老、增強機體免疫力等功效。其在飲食誘導的糖尿病[9]、高血脂[10]和腫瘤[11]等研究中均表現(xiàn)出了較好的調節(jié)和治療作用。甘薯莖葉生長茂盛,產量極高,但是大部分都廢棄在田地中自然凋零,造成極大的資源浪費。本研究以甘薯莖葉為原料,通過冠突散囊菌的固態(tài)發(fā)酵過程獲得發(fā)酵甘薯茶,同時建立SD大鼠高脂模型,探討其甘薯茶對高脂大鼠血脂以及腸道菌群的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

高脂飼料配方(豬油10%、膽固醇2%、蔗糖30%、蛋黃粉5%、膽酸鹽0.5%、基礎飼料52.5%,質量分數(shù)),基礎飼料購自北京華阜康生物科技股份有限公司?？偰懝檀?total cholesterol, TC)、甘油三酯(triglyceride, TG)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein- cholesterol, LDL-C)及高密度脂蛋白(high density lipoprotein-cholesterol, HDL-C)等測量試劑盒,南京建成生物科技有限公司。

孢子懸浮液制備:將冠突散囊菌保存菌種接種于制備好的PDA培養(yǎng)基上,在28 ℃下培養(yǎng)4 d后刮取菌絲,轉移到盛有100 mL無菌水的三角瓶中,28 ℃、120 r/min振蕩30 min,血球計數(shù)板計數(shù),并稀釋至細胞密度為4×106/mL。

新鮮甘薯葉經分撿,切碎,烘干后,按照接種量為培養(yǎng)基質量的5%將制備的孢子懸液接種到葉上,在28 ℃、相對濕度75%的環(huán)境下渥堆發(fā)酵4 d,以葉上布滿冠突散囊菌菌絲,生長旺盛,即為發(fā)酵結束。取茶餅200 g,加500 mL水文火煎煮30 min,過濾,二次煎煮20 min,過濾,合并2次濾液,冷凍干燥,獲得凍干粉,密封包裝,-20 ℃保存?zhèn)溆?。每次使用前充分溶? mL無菌水備用。

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物分組及模型建立

健康雄性SD大鼠體重(200±20) g,由北京華阜康生物科技股份有限公司提供,許可證號SCXK(京)2019-0008。在室溫22～26 ℃、相對濕度50%～70%的環(huán)境下飼養(yǎng)。本研究中涉及實驗動物的處理,符合陜西中醫(yī)藥大學實驗動物倫理委員會的相關規(guī)定(動物倫理審查備案編號SUCMDL為20220328001)。

實驗大鼠適應性基礎喂養(yǎng)1周后,分為對照組(NC,n=8)、模型組(HFD,n=8)、低劑量組(ZHL,n=8)和高劑量組(ZHH,n=8)。正常組和模型組每天各灌胃一次5 mL無菌水,劑量組每天灌胃一次5 mL 凍干粉水溶液。每次使用前根據(jù)各組大鼠體重調節(jié)所需凍干粉劑量,實驗期間,大鼠可自由進食和隨意飲水。每組所給飼料和實驗處理如表1所示。給藥劑量依據(jù)《藥理試驗方法學》中“標準體重動物劑量換算表”來確定。

1.2.2 組織樣品采集

實驗大鼠每周稱重1次。末次給藥后禁食不禁水12 h,收集新鮮糞便于無菌EP管中,置于-80 ℃冰箱保存待測。大鼠處死后,收集血清待測,并摘取肝臟組織,生理鹽水沖洗后,置于4%多聚甲醛溶液中,4 ℃冰箱保存。

1.2.3 血清生化指標的測定

將1.2.2節(jié)收集的血清,在4 ℃下低溫3 000 r/min離心15 min分離血清,依據(jù)測量試劑盒中的操作說明,檢測血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C含量。

1.2.4 大鼠肝臟組織形態(tài)學的觀察

取4%多聚甲醛溶液固定的大鼠肝臟組織,經過脫水、包埋,制備成石蠟切片,蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE) 染色后,光學顯微鏡下觀察肝臟組織的病理改變。

1.2.5 腸道微生物DNA的提取及測序

將-80 ℃冰箱保存的大鼠糞便,使用E.Z.N.A.? Soil DNA抽提試劑盒提取DNA。所有操作步驟均嚴格按照試劑盒說明書進行。提取后DNA樣品用Nano-drop超微量分光光度計檢測DNA樣品的濃度和純度。PCR擴增和測序工作由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司按照標準流程運用 Illumina MiSeq PE300 平臺完成。以338F(5′-ACTCCTACGGGAGCAG-3′)和806R(5′-GCACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)為引物,擴增大鼠糞便菌群16S rDNA的V3+V4可變區(qū)。

使用NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit構建MiSeq PE文庫,并利用QIIME v1.9.1對從Illumina MiSeq平臺獲取的原始數(shù)據(jù)進行特定過濾處理。用UPARSE(version 7.1)對篩選序列進行操作分類單元(operational taxonomic units, OTU)聚類分析,控制序列相似度為97%,按照各樣本OTUs最低數(shù)量,將原始數(shù)據(jù)抽平分析。用RDP classifier貝葉斯算法對97%相似的OTUs序列進行分類學分析。基于OTU水平,Wilcoxon秩和檢驗分析樣本內大鼠腸道菌群的Alpha多樣性;基于Bray-Curtis距離進行主坐標分析(principle coordinate analysis, PCoA)計算樣本間的Beta多樣性,并分析菌群間的組成差異性。

1.2.6 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)均以“平均值±標準差”表示,采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計學分析,Graphpad Prism 8.0軟件繪圖。采用ANOVA及Dunnett’st檢驗進行組間差異性分析,P<0.05為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 甘薯茶飲對大鼠體重的影響

體重是判斷個體肥胖的直觀指標,如圖1-a所示,HFD組大鼠的體重相對穩(wěn)定上升,且保持組間最高,NC組大鼠體重明顯低于HFD組,表明高脂飲食增加了實驗大鼠的體重。在1～2周時大鼠體重變化幅度不穩(wěn)定,可能是由于不適應灌胃方式。從3周開始,各組大鼠體重相對平穩(wěn)上升,HFD組大鼠體重最高,ZHH組體重最低。Lee′s指數(shù)是評價肥胖程度的有效指數(shù),數(shù)值越大、表明動物肥胖程度越嚴重。如圖1-b所示,HFD組大鼠Lee′s指數(shù)最高,且顯著高于NC組(P<0.05),ZHH組Lee′s指數(shù)相比HFD組顯著降低(P<0.05)。綜上表明,甘薯茶可以降低肥胖大鼠體重和Lee′s指數(shù),減輕其肥胖程度。

a-體重變化;b-Lee′s指數(shù)

2.2 對大鼠血脂水平的影響

如圖2-a～圖2-c所示,與NC組相比較,HFD組大鼠血清中的TC、TG以及LCL-C含量顯著升高(P<0.05),表明高脂喂養(yǎng)導致大鼠血脂異常,動物模型建立成功。與HFD組相比較,ZHL組和ZHH組的TC、TG以及LCL-C含量均顯著降低(P<0.05),說明甘薯茶可以有效降低血清中的TG、TC以及LCL-C含量。圖2-d顯示,HFD組的HDL-C含量低于NC組,而ZHH組相比HFD組,血清中HDL-C含量升高,但無統(tǒng)計學差異。長期的高熱量飲食會導致血清中總膽固醇和甘油三酯含量的增高,從而引發(fā)高血脂癥、糖尿病等相關疾病。低密度脂蛋白可以促進動脈管壁形成動脈粥樣硬化,是動脈粥樣硬化一項非常危險的因素[12]。結果表明,甘薯茶具有較好的降脂效果,同時有助于減少宿主患動脈粥樣硬化幾率。

a-TC;b-TG;c-LDL-C;d-HDL-C

2.3 對大鼠肝臟結構的影響

灌胃8周后,鏡下觀察大鼠肝臟組織HE染色石蠟切片的病理顯微結構。如圖3所示,NC組肝細胞形態(tài)正常,細胞核染色清晰,肝組織結構清晰完整。HFD組大鼠的肝臟組織出現(xiàn)肝索結構紊亂,具有明顯的空泡樣變性,肝細胞壞死等現(xiàn)象。與HFD組相比較,ZHL組和ZHH組肝臟組織細胞結構趨于整齊,未見明顯空泡現(xiàn)象。ZHH組肝索排列更為整齊,細胞核清晰可見。以上信息表明甘薯茶對高脂大鼠肝損傷有一定保護作用。

a-NC;b-FHD;c-ZHL;d-ZHH

2.4 菌群多樣性分析

Alpha多樣性是對樣本中物種多樣性的分析,反映微生物群落的豐富度和多樣性。各組大鼠α多樣性指標如表2所示。

表2 腸道菌群Alpha多樣性統(tǒng)計表(n=8)

Coverage指數(shù)反映了樣本微生物群落的覆蓋度,如表2所示,樣本中的Coverage指數(shù)值均在0.997以上,表明測序數(shù)據(jù)覆蓋率達到99.7%以上,測序深度和廣度合理。Sobs指數(shù)和Chao1指數(shù)反映了微生物群落多樣性和豐富度。與NC組相比,HFD組Chao1指數(shù)和Sods指數(shù)均顯著性降低,表明經過高脂喂養(yǎng),大鼠腸道菌群的豐富度和均勻度均有所下降。與HFD組相比ZHH組指數(shù)呈上升趨勢。Simpson指數(shù)則反映了群落均勻度。ZHH組Simpson指數(shù)高于HFD組,無統(tǒng)計學差異。以上結果表明長期高脂飲食可以降低大鼠腸道菌群的物種豐富度和均勻度,而甘薯茶飲則能更好的改善大鼠腸道菌群的物種多樣性和豐富度,但未能顯著提高物種均勻度。

基于Bray-Curtis距離進行PCoA比較各組大鼠菌群結構的差異。經基于置換的多元方差分析(permutational multivariate analysis of variance, Per MANOVA) (置換次數(shù)999,P=0.001 0),如圖4所示,沿著PC1水平,高脂飲食大鼠菌群與NC組分布較遠,說明其群落結構的分布明顯不同。同時ZHH組與HFD組很好的區(qū)分開,并且與正常組在PC1水平有接近的趨勢。表明甘薯茶使得ZHH組大鼠腸道菌群結構與HFD組相比發(fā)生了改變,部分恢復了大鼠腸道菌群的結構。PC1的貢獻度是30.25%,PC2的貢獻度是15.12%。

圖4 β多樣性分析:PCoA分析

2.5 大鼠腸道菌群門水平的分析

如圖5-a所示,在門水平上,厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidota)、放線菌門(Actinobacteriota)、變形菌門(Proteobacteria)等菌門的豐度相對較高,其中厚壁菌門和擬桿菌門的豐度之和占總細菌的80%以上,是各組中的絕對優(yōu)勢菌門。由圖5-b、圖5-c可知,與NC組相比,經高脂喂養(yǎng),大鼠體內Firmicutes豐度顯著降低,Bacteroidota豐度被升高,其中厚/擬比值也顯著降低,這一結果與ZHANG等[13]、LIN等[14]研究一致,高脂模型組內擬桿菌門相對更豐富。經干預后大鼠腸道菌群的厚/擬比值升高。上述結果表明經冠突散囊菌發(fā)酵后的甘薯茶能夠減輕高脂飲食引起的腸道菌群門水平紊亂。

a-門水平相對豐度;b-厚壁菌門的相對豐度;c-擬桿菌門的相對豐度;d-厚/擬比

2.6 大鼠腸道菌群屬水平的分析

如圖6-a所示,長期高脂飲食導致各組大鼠菌屬相對豐度不同。研究發(fā)現(xiàn),瘤胃球菌屬與代謝紊亂存在關聯(lián),其在高脂膳食宿主腸道內的相對豐度較低[14]。Christensenellaceae屬于厚壁菌門,是人類和動物腸道及黏膜中廣泛存在的潛在益生菌,對宿主健康非常重要,與脂肪沉積和炎癥等代謝疾病呈負相關[15]。如圖6-b 所示,與NC組相比較,HFD組NK4A214 group、Christensenellaceae_R-7 group的含量顯著降低,經過甘薯茶飲干預后,在ZHH組二者含量均升高。

a-屬水平相對豐度;b-部分菌群的相對豐度

有研究表明,布勞特氏菌(Blautia)含量的增加響應于高脂飲食的攝入[16-17]。Lachnoclostridium相對豐度與血清脂肪酶水平呈正相關,可促使機體發(fā)生炎癥反應[18]。擬桿菌屬(Bacteroides)可通過促進對植物多糖的消化吸收及抑制FIAF基因(fasting-induced adipocyte factor,禁食引起的脂肪細胞因子)的表達,來促使脂肪的積累及肥胖的形成[19]。如圖6-b所示,HFD組Blautia、Lachnoclostridium和Bacteroides含量相比NC組顯著升高,而經過甘薯茶飲干預后,ZHH組的含量均明顯降低。

2.7 腸道菌群功能預測的差異分析

為了進一步探討甘薯茶飲對大鼠腸道菌群代謝的影響,將通過16S rDNA測序獲得的物種構成與KEGG PATHWAY數(shù)據(jù)庫比對,應用STAMP差異分析對各組樣品進行功能預測分析,結果如圖7所示,HFD組大鼠半胱氨酸和蛋氨酸代謝顯著低于NC組,蛋氨酸可通過轉硫途徑生成半胱氨酸,進而促進谷胱甘肽合成,參與體內抗氧化反應,抑制脂質過氧化,減少肝內脂肪蓄積[20]。結果顯示高脂飲食可抑制該代謝水平導致紊亂,引起機體肝細胞脂肪變性,促進脂肪肝形成。通過干預后,ZHH組半胱氨酸和蛋氨酸代謝得以恢復。亞油酸是脂肪酸代謝的關鍵物質,也是花生四烯酸合成的前體物質,體內亞油酸和花生四烯酸含量升高會導致機體炎癥加強[21]。結果顯示高脂飲食可導致大鼠體內亞油酸代謝及花生四烯酸代謝通路紊亂,甘薯茶可以顯著下調該代謝通路,降低炎癥幾率。

a-FHD組與NC組比較;b-FHD組與ZHH組比較

3 討論

有研究表明,長期高脂飲食可誘發(fā)如肥胖、非酒精性脂肪肝和高脂血癥等多種慢性疾病的發(fā)生[13-14]。本研究通過高脂飼料喂養(yǎng)來建立高脂血癥大鼠模型,并觀察冠突散囊菌固態(tài)發(fā)酵的甘薯茶對高脂血癥大鼠肥胖及腸道菌群紊亂的影響。研究中發(fā)現(xiàn),高脂飲食不但能夠引起大鼠肥胖,還會導致大鼠血脂代謝異常的發(fā)生。血脂代謝異常是指血漿中的一種或多種脂質高于正常指標。本實驗中,模型組大鼠血清TC、TG以及LDL-C含量均顯著升高,這表明高脂血癥大鼠模型建立成功。LDL-C攜帶的膽固醇積存在動脈壁上,可以促進動脈管壁形成動脈粥樣硬化,是動脈粥樣硬化一項非常危險的因素[22]。實驗結果顯示,甘薯茶飲在有效改善高脂飲食引起的血脂異常的同時,也可以顯著降低宿主患動脈粥樣硬化的幾率。很多流行病學研究和臨床實驗均表明茶葉具有很好的抗肥胖活性[23]。其中發(fā)酵茶更是具有優(yōu)異的減肥降脂活性,茯磚茶中茶多酚[24]、多糖[25]、茶褐素[26]等不同組分均具有其特異性。

肝臟是脂類代謝的關鍵場所,人體內血脂的相對恒定主要靠肝細胞來調節(jié),肝細胞能夠將膽固醇轉化成膽汁酸,促進脂肪在腸道內的消化吸收。而高脂飲食可導致宿主的氧化應激增加,從而引發(fā)肝臟脂肪變性,肝功能受損,膽汁的生成和排泄受阻,進而導致血脂代謝發(fā)生異常。研究表明,茯磚茶及其活性成分可以顯著提高實驗動物血清及肝臟中谷胱甘肽過氧化物酶、過氧化氫酶和超氧化物歧化酶等的活性從而降低對肝臟的氧化損傷[27]。本研究結果也顯示,甘薯茶飲不但能夠明顯抑制高脂大鼠體重增長,降低肥胖指數(shù),還可以改善高脂大鼠肝臟病理狀況,緩解高脂飲食引起的肝臟功能損傷。

眾多研究均表明,高脂飲食可誘導機體腸道菌群發(fā)生紊亂,引起宿主生理功能的改變,從而導致如肥胖等各類疾病的發(fā)生。本研究發(fā)現(xiàn),高脂飲食可導致大鼠腸道菌群Alpha多樣性顯著降低,經過甘薯茶飲的調節(jié),高脂大鼠腸道菌群的豐度和多樣性均得到提升。高通量測序結果還顯示,經過高脂喂養(yǎng),大鼠腸道中厚壁菌門細菌數(shù)量減少,擬桿菌門細菌數(shù)量增加,這一結果與LIN等[14]、ZHANG等[13]研究結果一致,腸道內厚/擬菌門的相對比例具有飲食依賴性。厚壁菌門和擬桿菌門的比值在脂肪代謝中發(fā)揮著重要作用,厚/擬比值的降低,有助于促進宿主的肥胖[28]。經甘薯茶飲干預后,厚/擬比值得到上調,有效改善了因脂肪攝入而造成的菌群結構改變和宿主肥胖。有研究表明[29-31],發(fā)酵茶中的茶多糖、金花菌胞內和胞外多糖均可通過調節(jié)腸道菌群、改善腸道屏障來增加機體的免疫功能,具有良好的降脂減肥功效。

除了對門水平的調控,高脂飲食對機體某些菌屬也有影響。經過高脂飼料喂養(yǎng),模型組大鼠腸道內瘤胃球菌NK4A214 group、ChristensenellaceaeR-7 group菌屬的豐度顯著降低,而Blautia、Lachnoclostridium和bacteroides菌屬的豐度顯著升高。其中Ruminococcaceae_NK4A214 group為厚壁菌門的一種有益菌,其可以通過代謝產生丁酸類物質,來調節(jié)腸上皮細胞的代謝和免疫應答功能[14]。該菌屬豐度下降,提示高脂血癥會在一定程度上減少腸道內抗菌肽類物質的釋放,降低腸道的防御保護功能,增加炎癥發(fā)生的概率[32]。ChristensenellaceaeR-7 group為一類具有抗炎特性的產丁酸菌,可下調促炎細胞因子,改善腸道黏膜屏障功能[33]。本實驗結果顯示,甘薯茶飲可以提高大鼠腸道中Ruminococcaceae_NK4A214 group和ChristensenellaceaeR-7 group菌屬的含量,進而調節(jié)脂質代謝,降低機體肥胖及炎癥的發(fā)生。WANG等[16]在腸道微生物群個性化治療高脂血癥實驗中發(fā)現(xiàn),高脂血癥患者的糞便樣本中Blautia含量明顯增加。SHEN等[17]亦發(fā)現(xiàn)非酒精性脂肪性肝炎患者體內Blautia的豐度顯著高于健康人群,表明肝臟形態(tài)結構的損傷可能與該菌屬豐度的升高有關。動物研究發(fā)現(xiàn),Lachnoclostridium不但與體重增長呈正相關,還可以影響血清脂肪酶水平的升高,通過降低腸道中Lachnoclostridium的含量,可減輕機體炎癥反應,改善肥胖[18]。也有研究表明,擬桿菌屬Bacteroides不僅可通過抑制控制脂肪進出脂肪細胞的FIAF基因的表達來增加脂肪積累,同時,該菌屬中也含有大量可產生乙酸的致病菌,該菌屬豐度增加,不僅會導致脂肪進一步堆積,還增加了宿主感染的風險[34]。本實驗結果表明,甘薯茶飲可以降低Blautia、Lachnoclostridium和bacteroides等菌屬的豐度,有效減輕其對肝臟的損傷,降低機體炎癥反應以及患相關代謝綜合征的幾率。

綜上所述,飲用發(fā)酵甘薯茶可顯著抑制高脂模型大鼠的體重增加及血清中TC、TG以及LDL-C的積累。同時,高脂飲食所導致的腸道內厚/擬菌門比值和瘤胃球菌、Christensenellaceae等有益菌屬豐度的下降、以及與脂肪積累和機體炎癥有關菌屬豐度的增加,在甘薯茶飲干預后均得到調整和改善。

4 結論

高脂飲食是高脂血癥最主要的誘因。高脂飲食中的大量脂質會引發(fā)血脂代謝異常和血脂水平增高,進而誘發(fā)高脂血癥。本研究結果顯示,補充甘薯茶飲后,有效改善了大鼠肥胖狀態(tài)和脂質代謝紊亂。同時也降低與促進脂肪積累及機體炎癥有關的菌屬豐度,增加了部分有益菌的豐度。但高脂飲食造成的肥胖及脂質代謝紊亂和肝臟結構的損傷是否與這些菌屬豐度的變化有關,仍有待進一步研究。