劉春芳,林永祿,陳亮,李菁,黎宇盛,曾榮華,許文東

(廣州白云山漢方現(xiàn)代藥業(yè)有限公司,中藥制藥過(guò)程技術(shù)與新藥創(chuàng)制國(guó)家工程研究中心,廣東 廣州,510240)

睡眠是維持機(jī)體平衡的最基本條件,睡眠障礙不僅損害身體健康,還會(huì)降低生活及工作質(zhì)量[1-2]。存在睡眠障礙問(wèn)題的人群相當(dāng)龐大,據(jù)國(guó)外流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,15%～35%的成年人存在睡眠質(zhì)量問(wèn)題[3]。中國(guó)睡眠研究會(huì)發(fā)布的《2021運(yùn)動(dòng)與睡眠白皮書(shū)》亦顯示,我國(guó)超3億人存在睡眠障礙,約38%成年人有失眠困擾。然而,醫(yī)學(xué)上并不建議輕易使用安定等鎮(zhèn)靜催眠類藥物,因?yàn)榇嬖诔砂a性、停藥反跳等風(fēng)險(xiǎn)。含有特定功能因子的保健食品可有效地避免這些安全性問(wèn)題,為失眠人群的健康難題提供新的應(yīng)對(duì)方案。因此,面對(duì)免疫力低下或者睡眠障礙等亞健康問(wèn)題的困擾,人們對(duì)于傳統(tǒng)中醫(yī)藥的藥食產(chǎn)品或者天然產(chǎn)品的需求愈加強(qiáng)烈。

靈芝藥用歷史悠久,具有滋補(bǔ)強(qiáng)壯、扶正固本的功效,是用于治未病的“上品”,在民間為藥膳食療之佳品,安全無(wú)副作用。現(xiàn)代藥理研究表明,靈芝多糖是其關(guān)鍵功效成分,具有改善睡眠[4-5]、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫、護(hù)肝、抗輻射等作用[6-8]。國(guó)內(nèi)外對(duì)靈芝的研究已深入到免疫系統(tǒng)、中樞神經(jīng)系統(tǒng),但相關(guān)成果在產(chǎn)品開(kāi)發(fā)上的應(yīng)用卻十分有限,市場(chǎng)上除了靈芝飲片這類初加工產(chǎn)品,大多是由多種原料組成的大復(fù)方產(chǎn)品,靈芝特有的應(yīng)用價(jià)值并未得到充分發(fā)揮。γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)是一種天然存在的功能性氨基酸,是哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì),具備改善睡眠[9-11]、降血壓、抗焦慮、改善記憶力、抗癲癇、抗衰老等多種生理功能[12]。GABA在日本等國(guó)家作為一種功能食品因子已廣泛應(yīng)用于飲料、果醬以及其他功能食品中[13-14],在我國(guó)也是一種安全的新食品原料,可用于開(kāi)發(fā)普通食品和保健食品,目前仍具有較大的應(yīng)用前景。

結(jié)合現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)開(kāi)發(fā)傳統(tǒng)中藥材是保健食品研發(fā)的新路徑。本研究旨在開(kāi)發(fā)功能因子明確、質(zhì)量穩(wěn)定可控的靈芝新產(chǎn)品,充分發(fā)揮靈芝多糖在改善睡眠方面的優(yōu)勢(shì)。通過(guò)將γ-氨基丁酸與富含靈芝多糖的靈芝提取物進(jìn)行合理科學(xué)配伍,并制成易于服用、依從性好的片劑,使得二者產(chǎn)生出整體綜合效應(yīng),為睡眠保健市場(chǎng)提供安全可靠的優(yōu)質(zhì)選擇,也為藥食同源精深加工產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)提供發(fā)展模式借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

靈芝提取物,公司自制;γ-氨基丁酸,上海統(tǒng)園食品技術(shù)有限公司;麥芽糊精、玉米淀粉,中糧生化能源有限公司;微晶纖維素、硬脂酸鎂,湖州菱湖新望化學(xué)有限公司;交聯(lián)羧甲基纖維鈉、羧甲基淀粉鈉,曲阜市天利藥用輔料有限公司;乙醇,中山市華士達(dá)生物科技有限公司;以上物料均為食品級(jí)。聚維酮K30(藥品級(jí)),博愛(ài)新開(kāi)源醫(yī)療科技集團(tuán)股份有限公司。

靈芝多糖γ-氨基丁酸片,0.41 g/片(包衣),由實(shí)驗(yàn)室自制,推薦服用量為每日1次,每次2片,以成人體重60 kg計(jì),推薦量為0.013 7 g/kg。

SPF級(jí)KM雌性小白鼠,體重為18～22 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,生產(chǎn)許可證號(hào) SCXK(粵)2018-0002。在溫度為(22±2) ℃、相對(duì)濕度為(55±15)%的屏障環(huán)境中飼養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

DFY-500C萬(wàn)能高速粉碎機(jī),溫嶺市林大機(jī)械有限公司;BSA224S-CW電子分析天平,北京賽多利斯天平有限公司;BS210S型電子天平,德國(guó)賽多利斯;101C-3B型電熱鼓風(fēng)干燥箱,上海實(shí)驗(yàn)儀器廠有限公司;ZP-7旋轉(zhuǎn)式壓片機(jī),上海天峰制藥設(shè)備有限公司;YD-20智能片劑硬度儀、ZB-1E智能崩解儀,天大天發(fā)科技有限公司;篩網(wǎng)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 片劑工藝研究

1.3.1.1 制備工藝流程

本品設(shè)計(jì)為片劑,根據(jù)前期的初步研究結(jié)果,靈芝提取物黏度較大,輔料使用量需達(dá)到60%～65%時(shí)才能較好成型。綜合考慮片劑大小、服用次數(shù)、服用量等影響依從性的因素,本品規(guī)格設(shè)定為0.4 g/片(素片),每日服用2片。工藝路線設(shè)計(jì)為:

主料與輔料混合→制軟材→制粒(20目篩)→干燥(烘干至水分為3%～5%)→整粒(20目篩)→總混→壓片→包衣→包裝等。

1.3.1.2 質(zhì)量評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)

本試驗(yàn)選定制粒情況、壓片情況、片劑硬度和崩解時(shí)限作為評(píng)價(jià)指標(biāo),篩選輔料的種類及用量,以制備得到良好的片劑。

1.3.1.3 填充劑的篩選

本試驗(yàn)選擇片劑常用的填充劑玉米淀粉、麥芽糊精和微晶纖維素進(jìn)行篩選,通過(guò)加入不同種類及用量的填充劑進(jìn)行試驗(yàn),以制備1 000片為1次試驗(yàn),試驗(yàn)方案見(jiàn)表1,其他因素不變,根據(jù)制粒過(guò)程中顆粒的性狀和所得片劑的性能指標(biāo)來(lái)選擇適宜的填充劑用量。

表1 填充劑的種類和用量?jī)?yōu)化設(shè)計(jì) 單位:g

1.3.1.4 黏合劑的篩選

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,分別對(duì)100 g/L淀粉漿、400 g/L羥丙甲基纖維素水溶液、400 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液和650 g/L聚維酮K30乙醇溶液進(jìn)行篩選,添加量為處方量的10%,其他因素不變,以制粒過(guò)程中顆粒的性狀和所得片劑的性能指標(biāo)為依據(jù)來(lái)選擇適宜的黏合劑。

1.3.1.5 崩解劑的篩選

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分別對(duì)干淀粉、羧甲基淀粉鈉和交聯(lián)羧甲基纖維素鈉進(jìn)行篩選,添加量為處方量的5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù),下同),其他因素不變,以所得片劑的性能指標(biāo)為依據(jù)來(lái)選擇適宜的崩解劑。

1.3.1.6 潤(rùn)滑劑的篩選

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)分別對(duì)滑石粉、微粉硅膠和硬脂酸鎂進(jìn)行篩選,添加量為處方量的0.5%,其他因素不變,以所得片劑的性能指標(biāo)為依據(jù)來(lái)選擇適宜的潤(rùn)滑劑。

1.3.1.7 片劑制備工藝驗(yàn)證

根據(jù)以上考察結(jié)果,優(yōu)選最佳工藝,進(jìn)行五批制劑工藝驗(yàn)證試驗(yàn),每批壓制1 000片。使用60 g/L透明薄膜包衣預(yù)混液進(jìn)行包衣,控制增重2%～2.5%,包衣溫度40～45 ℃,霧化壓力約0.4 MPa。記錄制粒情況,檢查片劑的外觀、硬度和崩解時(shí)限,并進(jìn)行標(biāo)志性成分含量測(cè)定。

1.3.2 改善睡眠功能學(xué)實(shí)驗(yàn)

本研究中的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均依據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》(2003年版)進(jìn)行,實(shí)施方案通過(guò)了倫理委員會(huì)審核和批準(zhǔn)(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究倫理審查申請(qǐng)書(shū):W96-027C)。將SPF小鼠在實(shí)驗(yàn)室條件下喂養(yǎng)適應(yīng)3 d,以下每個(gè)實(shí)驗(yàn)均隨機(jī)將48只小鼠分為4組,每組12只,每日灌胃給予受試物,給藥量根據(jù)每周體重增減調(diào)整,實(shí)驗(yàn)時(shí)間為4周。

1.3.2.1 樣品配制及給藥途徑

實(shí)驗(yàn)時(shí)稱取樣品0.35、0.7、2.05 g,分別用純凈水制成50 mL的藥液,形成低(0.07 g/kg BW)、中(0.14 g/kg BW)、高(0.41 g/kg BW)3個(gè)劑量組,相當(dāng)于人推薦日服量的5、10、30倍。每日按0.1 mL/10 g BW經(jīng)口灌胃受試物,陰性對(duì)照組給予同等體積的純凈水。

1.3.2.2 直接睡眠實(shí)驗(yàn)

觀察受試組動(dòng)物給予3個(gè)劑量的受試樣品、陰性對(duì)照組給予同等體積溶媒后,是否出現(xiàn)睡眠現(xiàn)象。當(dāng)小鼠置于背臥位時(shí),能立即翻正身位,如超過(guò)30～60 s不能翻正者,即認(rèn)為翻正反射消失,進(jìn)入睡眠。翻正反射恢復(fù)即為動(dòng)物覺(jué)醒,翻正反射消失至恢復(fù)這段時(shí)間為動(dòng)物睡眠時(shí)間,記錄陰性對(duì)照組與受試樣品組入睡動(dòng)物數(shù)及睡眠時(shí)間。

1.3.2.3 延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉55 mg/kg BW,注射量為0.1 mL/10 g BW,以翻正反射消失為指標(biāo),觀察受試樣品是否延長(zhǎng)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠時(shí)間。

1.3.2.4 戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動(dòng)物腹腔注射戊巴比妥鈉30 mg/kg BW,記錄30 min內(nèi)入睡動(dòng)物數(shù)。

1.3.2.5 巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)

動(dòng)物末次給予溶劑及不同濃度受試樣品后15 min,給各組動(dòng)物腹腔注射巴比妥鈉300 mg/kg BW,注射量為0.1 mL/10 g BW,以翻正反射消失為指標(biāo),觀察受試樣品對(duì)巴比妥鈉誘導(dǎo)睡眠潛伏期的影響。

1.4 數(shù)據(jù)處理

用SPSS軟件包對(duì)各實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中,入睡動(dòng)物數(shù)為計(jì)數(shù)資料,用X2檢驗(yàn),若四格表總例數(shù)<40,或總例數(shù)≥40但理論數(shù)≤1時(shí),改用確切概率法。動(dòng)物體重和睡眠時(shí)間為計(jì)量資料,采用方差分析,對(duì)非正態(tài)或方差不齊的數(shù)據(jù)進(jìn)行變量轉(zhuǎn)換后再統(tǒng)計(jì);若變量轉(zhuǎn)換后仍未滿足正態(tài)或方差齊性,則改用秩和檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果中的動(dòng)物體重和睡眠時(shí)間是各實(shí)驗(yàn)組的平均值,用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 片劑工藝研究

2.1.1 填充劑種類的篩選結(jié)果

填充劑考察試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2,從處方1～處方3的結(jié)果來(lái)看,單用一種填充劑,制粒情況和片劑的指標(biāo)均不理想,但是對(duì)比之下,單用微晶纖維素較單用玉米淀粉或麥芽糊精的效果要好。2種填充劑組合使用效果遜于3種填充劑組合使用效果。根據(jù)各指標(biāo)的結(jié)果綜合評(píng)判,處方10的填充劑種類及用量制得的顆粒均勻適宜,所壓的片劑片面光潔,硬度和崩解時(shí)限符合片劑質(zhì)量要求。

表2 填充劑考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.2 黏合劑種類的篩選結(jié)果

黏合劑考察試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,用100 g/L淀粉漿、400 g/L羥丙甲基纖維素水溶液、400 g/L羧甲基纖維素鈉水溶液作為黏合劑時(shí),制粒過(guò)程困難,軟材黏性大,過(guò)篩粘篩網(wǎng),且可能由于黏度過(guò)大造成片劑崩解時(shí)限延長(zhǎng)。而使用650 g/L聚維酮K30乙醇溶液作為黏合劑時(shí),黏合效果最好,容易制粒,壓制后片面光潔,片劑硬度和崩解時(shí)限均符合片劑質(zhì)量要求。因此,應(yīng)選用650 g/L聚維酮K30乙醇溶液作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的黏合劑。

表3 黏合劑考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.3 崩解劑種類的篩選結(jié)果

崩解劑考察試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,用干淀粉、羧甲基淀粉鈉作為崩解劑時(shí),制備所得的片劑外觀不夠光潔,且崩解時(shí)限過(guò)長(zhǎng)。而使用交聯(lián)羧甲基纖維素鈉作為崩解劑時(shí),制得的片劑外觀和崩解性能均較好。因此,應(yīng)選用交聯(lián)羧甲基纖維素鈉作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的崩解劑。

表4 崩解劑考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.4 潤(rùn)滑劑種類的篩選結(jié)果

潤(rùn)滑劑考察試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5,用滑石粉、微粉硅膠和硬脂酸鎂作為潤(rùn)滑劑時(shí),制備所得的片劑硬度和崩解時(shí)限區(qū)別不大,主要區(qū)別在于片劑的片面光潔程度,滑石粉和微粉硅膠潤(rùn)滑效果一般,片劑外觀表現(xiàn)為較光潔,而使用硬脂酸鎂潤(rùn)滑劑制得的片劑外觀完整光潔,說(shuō)明硬脂酸鎂可有效減小顆粒間及顆粒與模具間摩擦力,能顯示出良好的潤(rùn)滑效果。因此,應(yīng)選用硬脂酸鎂作為制備靈芝多糖γ-氨基丁酸片劑的潤(rùn)滑劑。

表5 潤(rùn)滑劑考察試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5 片劑制備工藝驗(yàn)證結(jié)果與分析

采用最佳工藝條件制備5批靈芝多糖γ-氨基丁酸片,結(jié)果見(jiàn)表6。制粒方便,顆粒均勻,過(guò)篩容易,所壓片劑片面光潔,包衣后片面均勻光滑,片芯呈棕褐色。各項(xiàng)指標(biāo)良好,且符合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定,表明此制備工藝穩(wěn)定可靠。

表6 五批片劑工藝驗(yàn)證結(jié)果

2.2 靈芝多糖γ-氨基丁酸片改善睡眠功能學(xué)實(shí)驗(yàn)

2.2.1 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠體重的影響

記錄各實(shí)驗(yàn)中小鼠的不同時(shí)期的體重,進(jìn)行增重分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果如表7所示。各劑量組增重與陰性對(duì)照組比較,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠體重?zé)o明顯影響。

表7 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠體重的影響

2.2.2 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠直接睡眠作用的影響

實(shí)驗(yàn)中觀察發(fā)現(xiàn),各劑量組入睡動(dòng)物數(shù)均為0,與陰性對(duì)照組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表8),說(shuō)明靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠無(wú)明顯的直接睡眠作用。

表8 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)小鼠直接睡眠作用觀察結(jié)果

2.2.3 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

中、高劑量組動(dòng)物入睡時(shí)間縮短、睡眠時(shí)間延長(zhǎng),與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表9),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片延長(zhǎng)戊巴比妥鈉睡眠時(shí)間實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

表9 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)戊巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠時(shí)間的影響

2.2.4 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

各劑量組入睡動(dòng)物數(shù)與陰性對(duì)照組比較,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表10),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片的戊巴比妥鈉閾下劑量催眠實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性。

表10 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)戊巴比妥鈉閾下劑量催眠作用的影響

2.2.5 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

高劑量組動(dòng)物睡眠潛伏期縮短,與陰性對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(表11),表明靈芝多糖γ-氨基丁酸片的巴比妥鈉睡眠潛伏期實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陽(yáng)性。

表11 靈芝多糖γ-氨基丁酸片對(duì)巴比妥鈉誘導(dǎo)小鼠睡眠潛伏期的影響

綜合上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果,根據(jù)《保健食品檢驗(yàn)與評(píng)價(jià)技術(shù)規(guī)范》中的改善睡眠功能評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)判斷,靈芝多糖γ-氨基丁酸片具有改善睡眠功能作用。

3 討論

片劑是保健食品的常用劑型,不僅服用方便,且適宜于工業(yè)化大生產(chǎn),但在實(shí)際開(kāi)發(fā)時(shí),原料本身的特性對(duì)于片劑成型性與穩(wěn)定性具有較大影響。靈芝提取物黏性大,可能影響制劑時(shí)的物料均勻性、硬度、崩解時(shí)限等。本研究利用多種輔料進(jìn)行制粒、壓片,獲得功效成分均一的靈芝多糖γ-氨基丁酸片,加上包衣工序則有利于片劑的穩(wěn)定保存。

將此靈芝多糖γ-氨基丁酸片作為樣品,進(jìn)行功能學(xué)實(shí)驗(yàn),結(jié)果表明其具有改善睡眠的作用。靈芝多糖和GABA是處方中的2種主要功能因子,靈芝多糖可通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)影響松果體對(duì)褪黑素的分泌,γ-氨基丁酸在非快動(dòng)眼期引導(dǎo)入睡,并延長(zhǎng)深睡眠時(shí)間,二者可協(xié)同增效,發(fā)揮改善睡眠的保健功能。引起睡眠障礙的因素較多,在壓力等不良情緒刺激時(shí),人體下丘腦-垂體-腎上腺(hypothalamic-pituitary-adrenal,HPA)軸異常興奮,容易誘發(fā)失眠癥狀。靈芝多糖和GABA在抑制HPA軸時(shí)起到的協(xié)同作用可能與抑制氯離子通路和清除自由基有關(guān),具體分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

靈芝是傳統(tǒng)的補(bǔ)益類藥材,安全有效,適宜于開(kāi)發(fā)成滿足現(xiàn)代人需求的健康產(chǎn)品。結(jié)合現(xiàn)代營(yíng)養(yǎng)學(xué)研究成果,與新食品原料γ-氨基丁酸復(fù)配并制成服用方便的劑型,得到一款幫助亞健康人群改善睡眠障礙的新興產(chǎn)品,可充分發(fā)揮二者的健康價(jià)值,實(shí)現(xiàn)從初級(jí)農(nóng)產(chǎn)品到保健食品的轉(zhuǎn)變,引發(fā)靈芝下游經(jīng)濟(jì)新的增長(zhǎng)點(diǎn),有利于促進(jìn)靈芝產(chǎn)業(yè)鏈的延伸發(fā)展,并促進(jìn)產(chǎn)業(yè)轉(zhuǎn)型升級(jí)。