浩楠,唐雅利,邱子軒,趙雨竹,管雪強(qiáng),劉樹文,4,5,6,7*,石侃,4,5,6,7*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)2(山東省葡萄研究院,山東 濟(jì)南,250100) 3(山東省釀酒葡萄與葡萄酒技術(shù)創(chuàng)新中心,山東 濟(jì)南,250100) 4(陜西省葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌,712100) 5(國家林業(yè)和草原局葡萄與葡萄酒工程技術(shù)研究中心,陜西 楊凌,712100) 6(西北農(nóng)林科技大學(xué),合陽葡萄試驗(yàn)示范站,陜西 渭南,715300) 7(西北農(nóng)林科技大學(xué),寧夏賀蘭山東麓葡萄酒試驗(yàn)站,寧夏 永寧,750104)

蘋果酸-乳酸發(fā)酵(malolactic fermentation, MLF)是葡萄酒在酒精發(fā)酵(alcoholic fermentation, AF)結(jié)束后,利用乳酸菌(lactic acid bacteria, LAB)將L-蘋果酸降解為L-乳酸和CO2的過程[1]。不僅可以降低酸度、提高微生物穩(wěn)定性,還可以改善口感、增加風(fēng)味復(fù)雜性[2],是優(yōu)質(zhì)葡萄酒釀造中不可缺少的工藝技術(shù)。在自然條件下,啟動(dòng)和完成MLF依賴于葡萄酒中存在的釀酒乳酸菌,但這會(huì)導(dǎo)致MLF時(shí)間延長、無法預(yù)測(cè)發(fā)酵過程、葡萄酒變質(zhì)等一系列問題。因此,篩選具有優(yōu)良性能的乳酸菌對(duì)葡萄酒的釀造具有重要意義。

酒類酒球菌,因其對(duì)高乙醇體積分?jǐn)?shù)(>10%)、低pH值(pH<3.5)的葡萄酒環(huán)境有更好的耐受性而成為葡萄酒進(jìn)行MLF的主導(dǎo)菌[3],研究發(fā)現(xiàn)它在MLF過程中會(huì)釋放次級(jí)代謝產(chǎn)物,如酯類、高級(jí)醇、羰基化合物、揮發(fā)性脂肪酸和硫磺化合物[4]等,從而影響葡萄酒的香氣和口感。目前,國內(nèi)多數(shù)酒廠采用接種商業(yè)乳酸菌發(fā)酵劑以確保MLF正常、有效地完成。但這些商業(yè)發(fā)酵劑多來自國外,會(huì)造成國內(nèi)葡萄酒同質(zhì)化嚴(yán)重,不利于國產(chǎn)葡萄酒的發(fā)展[5]。此外,研究表明本土微生物菌株有助于展現(xiàn)葡萄酒獨(dú)特的風(fēng)土特色[6],本土微生物菌群、發(fā)酵性能和葡萄酒特征之間存在特定的聯(lián)系[7]。因此,篩選具有區(qū)域特色的本土蘋果酸乳酸發(fā)酵劑,能更好地適應(yīng)產(chǎn)區(qū)、特定產(chǎn)品和生產(chǎn)技術(shù),對(duì)呈現(xiàn)和塑造具有中國葡萄酒區(qū)域特色的葡萄酒有積極的影響。

寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)是我國釀酒葡萄的主要種植區(qū)之一,具有優(yōu)越的地理位置、獨(dú)特的氣候與豐富的本土微生物群落,有待科研人員與葡萄酒釀造師的開發(fā)與利用。本試驗(yàn)采用脅迫酸性番茄(acid tomato juice medium,ATB)培養(yǎng)基從寧夏賀蘭山東麓中部產(chǎn)區(qū)處于自然蘋乳發(fā)酵的葡萄酒中分離得到優(yōu)良抗逆葡萄酒乳酸菌,對(duì)其進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定、蘋果酸降解試驗(yàn)和菌株安全性分析,并以商業(yè)菌株酒類酒球菌(Oenococcusoeni)31-DH與優(yōu)良自篩菌株O.oeniSD-2a為對(duì)照進(jìn)行MLF,分析篩選菌株的蘋果酸代謝能力及對(duì)葡萄酒基本理化指標(biāo)和香氣成分等品質(zhì)的影響,進(jìn)而探討優(yōu)良抗逆葡萄酒乳酸菌在葡萄酒釀造中的應(yīng)用潛力,為寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)釀造具有本土特色的葡萄酒提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)所用葡萄酒樣采樣于2020年10月寧夏賀蘭山東麓中部子產(chǎn)區(qū),釀造實(shí)驗(yàn)所用葡萄采摘自張?jiān)Ｄθ麪柺迨谰魄f,2021年赤霞珠,含糖量約為25.4～25.8°Brix。

1.1.2 藥品與試劑

釀酒酵母(CECA),安琪酵母股份有限公司;對(duì)照乳酸菌2株:商業(yè)菌株O.oeni31-DH,中國食品工業(yè)研究院;優(yōu)良自篩菌株O.oeniSD-2a,西北農(nóng)林科技大學(xué)葡萄酒學(xué)院實(shí)驗(yàn)室保存;放線菌酮,北京Solarbio科技有限公司;萬古霉素,上海源葉生物公司;果膠酶(Cuvee Blanc),法國Lallemand公司;2-辛醇(色譜純),美國Sigma公司;L-蘋果酸測(cè)定試劑盒,阿拉丁試劑(上海)有限公司;蛋白胨、酵母浸粉等其他試劑,西隴科學(xué)股份有限公司;Gel signalTM Red核酸染料,上海勤翔科學(xué)儀器有限公司;2×TaqMaster Mix酶、Lysis Buffer、DL2000 DNA marker,大連TaKara公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Cary 60 UV-Vis紫外分光光度計(jì),美國Agilent Technologies公司;SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái),蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;pH計(jì),上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司;Bio-Rad C1000基因擴(kuò)增儀,美國Bio-Rad公司;MIKRO-200R臺(tái)式高速離心機(jī),德國Hettich科學(xué)儀器公司;ChampGel 500 plus全自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng),北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司;JY-300HC電泳儀,北京君意東方電泳設(shè)備有限公司;SX-500高壓蒸汽滅菌鍋,日本TOMY公司;Y15葡萄酒全自動(dòng)分析儀,西班牙BioSystems S.A.公司;QP2020氣象色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、色譜柱DB-WAX(60 m×0.25 mm×0.25 μm),日本島津公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 抗逆葡萄酒乳酸菌的分離篩選

1.3.1.1 培養(yǎng)基的配制

ATB液體培養(yǎng)基[8]:葡萄糖10 g/L,蛋白胨10 g/L,酵母浸粉5 g/L,蘋果酸1 g/L,硫酸鎂0.2 g/L,硫酸錳0.05 g/L,L-鹽酸半胱氨酸0.5 g/L,番茄汁25%(體積分?jǐn)?shù)),加水定容至1 L,用1 mol/L NaOH調(diào)pH值至4.8,115 ℃滅菌30 min。ATB固體培養(yǎng)基:在ATB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加入20 g/L瓊脂。ATB分離固體培養(yǎng)基:將滅菌后的ATB固體培養(yǎng)基放置至60 ℃左右,添加100 mg/L放線菌酮和50 mg/L萬古霉素,搖晃均勻。

1.3.1.2 葡萄酒乳酸菌的分離

將酒精發(fā)酵后的葡萄酒酒樣放置在20 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行MLF,同時(shí)利用紙層析法[9]監(jiān)測(cè)MLF過程。每3 d取酒樣10 mL,將酒樣以梯度10-1～10-7用生理鹽水稀釋后,吸取100 μL于ATB分離固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng),26 ℃條件下培養(yǎng)9～11 d。挑取白色、菌落直徑小于1 mm的單菌落進(jìn)行劃線純化培養(yǎng)[10]。將純化后的單菌落轉(zhuǎn)接至ATB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期,甘油管保存于-80 ℃冰箱備用。

1.3.1.3 葡萄酒乳酸菌抗逆篩選

將篩選出的所有原始菌株活化兩次至對(duì)數(shù)生長期,并接種至ATB脅迫培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h并測(cè)定OD600值,篩選在脅迫條件中OD600≥0.3的菌株,即獲得具有一定抗逆性的葡萄酒乳酸菌,而OD600<0.3或無法在脅迫培養(yǎng)基中生長的菌株被視為無抗逆性乳酸菌。

ATB脅迫培養(yǎng)基:在ATB液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上調(diào)整pH值與乙醇體積分?jǐn)?shù),分別為:(1)pH 3.2,乙醇體積分?jǐn)?shù)10%;(2)pH 3.2,乙醇體積分?jǐn)?shù)11%;(3)pH 3.4,乙醇體積分?jǐn)?shù)10%;(4)pH 3.4,乙醇體積分?jǐn)?shù)11%。

1.3.2 分子生物學(xué)鑒定

抗逆優(yōu)良菌株的分子生物學(xué)鑒定采用種屬特異性聚合酶鏈反應(yīng)(sequence specific polymerase chain reaction,SSP)進(jìn)行擴(kuò)增[11],引物分別為:上游OE1(5′-TAATGTGGTTCTTGAGGAGAAAAT-3′),下游OE2(5′-ATCATCGTCAAACAAGAGGCCTT-3′),并使用單一引物3R(3′-ACGCAGGCAC-5′)進(jìn)行隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性(random amplified polymorphic DNA polymerase chain reaction, RAPD-PCR)分析[12]。

1.3.3 菌株安全性鑒定

抗逆優(yōu)良菌株的生物胺(biogenic amine,BA)功能性基因的鑒定:參考COTON等[13]和趙艷卓等[14]方法進(jìn)行擴(kuò)增,特異性引物分別為:組氨酸脫羧酶(hdc):上游(F-GATGGTATTGTTTCKTATGA),下游(R-CCAAACACCAGCATCTTC);鳥氨酸脫羧酶(odc):上游(F-GTNTTYAAYGCNGAYAARACNTAYTTYGT),下游(R-TACRCARAATACTCCNGGNGGRTANGG);酪氨酸脫羧酶(tdc):上游(F-CCRTARTCNGGNATAGCRAARTCNGTRTG),下游(R-GAYATNATNGGNATNGGNYTNGAYCARG)。

上述PCR產(chǎn)物送至北京奧克鼎盛生物公司進(jìn)行測(cè)序,測(cè)序后其結(jié)果提交https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi進(jìn)行比對(duì)分析以驗(yàn)證PCR產(chǎn)物的特異性。

1.3.4 低pH與高乙醇濃度模擬環(huán)境發(fā)酵試驗(yàn)

1.3.4.1 模擬酒的配制[15]

葡萄汁10 mL/L;D-葡萄糖2 g/L;D-果糖2 g/L;NaCl 0.2 g/L;(NH4)2SO41 g/L;K2HPO42 g/L;MnSO4·H2O 0.05 g/L;MgSO4·7H2O 0.2 g/L;酵母浸粉4 g/L;L-蘋果酸 3 g/L;用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)整pH值,115 ℃滅菌30 min,滅菌后加入無水乙醇。高乙醇體積分?jǐn)?shù)模擬酒:pH 3.8,乙醇體積分?jǐn)?shù)14%;低pH模擬酒:pH 3.2,乙醇體積分?jǐn)?shù)10%。

1.3.4.2L-蘋果酸含量的測(cè)定

分別使用優(yōu)良抗逆菌株和對(duì)照菌株31-DH與SD-2a在上述兩種模擬酒中進(jìn)行MLF,同時(shí)采用紙層析法[9]監(jiān)測(cè)L-蘋果酸分解情況。每隔2 d取樣,然后將樣品置于80 ℃水浴鍋中15 min后10 000 r/min離心3 min,取上清液用于后續(xù)L-蘋果酸測(cè)定。根據(jù)L-蘋果酸試劑盒說明書,使用Y15葡萄酒全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.3.4.3 乳酸菌生物量監(jiān)測(cè)

分別將優(yōu)良抗逆菌株和對(duì)照菌株31-DH與SD-2a以107CFU/mL接種至上述兩種模擬酒中,采用平板計(jì)數(shù)法[10]進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。每隔2 d取樣,用生理鹽水稀釋為10-1～10-7菌懸液,吸取100 μL 10-4～10-7菌液涂布于ATB固體培養(yǎng)基上,26 ℃培養(yǎng)5～7 d后進(jìn)行菌落總數(shù)計(jì)數(shù),以菌落形成單位(CFU/mL)表示。

1.3.5 釀造試驗(yàn)

將上述篩選的優(yōu)良抗逆菌株和對(duì)照菌株31-DH與SD-2a以108CFU/mL、5%的接種量接種至酒精發(fā)酵結(jié)束的赤霞珠葡萄酒中進(jìn)行MLF,發(fā)酵溫度 20 ℃,同時(shí)采用紙層析法對(duì)發(fā)酵過程中L-蘋果酸代謝情況進(jìn)行監(jiān)測(cè),待層析紙上L-蘋果酸斑點(diǎn)消失表明MLF完畢。

1.3.5.1L-蘋果酸代謝能力的測(cè)定

在赤霞珠葡萄酒中接種優(yōu)良抗逆菌株和對(duì)照菌株進(jìn)行MLF的過程中,每隔1 d取酒樣直至MLF發(fā)酵結(jié)束。然后將樣品按照1.3.4.2節(jié)的方法進(jìn)行處理后,根據(jù)L-蘋果酸試劑盒說明書,使用Y15葡萄酒全自動(dòng)分析儀檢測(cè)。

1.3.5.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)的測(cè)定

葡萄酒的酒精度、殘?zhí)?、總酸、揮發(fā)酸、pH值等基本理化指標(biāo)采用GB/T 15038—2006 《葡萄酒、果酒通用分析方法方法》。

1.3.5.3 葡萄酒香氣成分的測(cè)定

參照余東亮[8]的方法稍作修改測(cè)定葡萄酒香氣成分。

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)香氣富集:取8 mL酒樣于頂空瓶,加2.0 g的NaCl和20 μL 2-辛醇(質(zhì)量濃度為0.016 g/L),在恒溫磁力攪拌器40 ℃條件下攪拌30 min,然后將萃取頭插入玻璃瓶進(jìn)行30 min頂空萃取,進(jìn)入GC-MS分析儀進(jìn)行揮發(fā)性化合物檢測(cè)。

定性分析:采用NIST17質(zhì)譜庫檢索、標(biāo)準(zhǔn)香氣成分保留時(shí)間比對(duì)與手動(dòng)檢索矯正相結(jié)合,進(jìn)行定性分析。

定量分析:將2-辛醇作為內(nèi)標(biāo),采用內(nèi)標(biāo)-標(biāo)準(zhǔn)曲線法進(jìn)行定量。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2019進(jìn)行計(jì)算,GraphPad Prism 9進(jìn)行相關(guān)圖表繪制,SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析、單因素方差分析、主成分分析(principal component analysis, PCA)等。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗逆葡萄酒乳酸菌的分離篩選

利用涂布法將稀釋后的葡萄酒樣品涂布于ATB分離固體培養(yǎng)基上,經(jīng)劃線純化后最終從酒樣中分離出了388個(gè)菌株,并根據(jù)不同葡萄品種和酒莊進(jìn)行編號(hào),見表1。菌株形態(tài)為白色表面光滑且直徑小于1 mm 的菌落,符合文獻(xiàn)[16]描述。

表1 酒樣來源及菌株編號(hào)

將上述初步分離篩選的388株菌株接種至4種ATB脅迫培養(yǎng)基中進(jìn)行菌株抗逆性篩選,結(jié)果發(fā)現(xiàn),培養(yǎng)72 h后僅有8株菌株的OD600≥0.3,分別是XMN18、XM12、XM16、BM43、BM68、BM79、XC22-N-3、XC22-N-19(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 菌株的分子生物學(xué)鑒定

對(duì)上述篩選獲得的8株優(yōu)良抗逆乳酸菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定。

2.2.1 SSP鑒定

凝膠電泳檢測(cè)8株菌株的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物,結(jié)果如圖1所示,所有乳酸菌均能擴(kuò)增出單一條帶(1 025 bp),初步鑒定8株抗逆乳酸菌均為酒類酒球菌。

1-XMN18;2-XM12;3-XM16;4-BM43;5-BM68;6-BM79;7-XC22-N-3;8-XC22-N-19;M-DL2000 DNA Marker

2.2.2 RAPD-PCR分析

選用3R引物,對(duì)8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌和2株對(duì)照菌株進(jìn)行了RAPD-PCR分析,如圖2所示,菌株的擴(kuò)增片段數(shù)量各不相同,BM79與XC22-N-3擴(kuò)增到5條片段,XMN18與XM16擴(kuò)增得到4條片段,XC22-N-19擴(kuò)增到3條片段,XM12與BM68擴(kuò)增到2條片段,BM43擴(kuò)增到1條片段。所有菌株擴(kuò)增得到的片段長度在500～2 000 bp,且10株菌株之間擴(kuò)增片段大小各不相同,XMN18和XM16雖然均擴(kuò)增出4條片段,但XMN18其中的3條集中在750～1 000 bp,而XM16集中在500～750 bp,說明這些菌株的基因組DNA具有多態(tài)性。

1-SD-2a;2-31-DH;3-XMN18;4-XM12;5-XM16;6-BM43;7-BM68;8-BM79;9-XC22-N-3;10-XC22-N-19;M-DL2000 DNA Marker

2.3 菌株產(chǎn)生物胺風(fēng)險(xiǎn)分析

葡萄酒中最常見的生物胺是腐胺、組胺和酪胺,這些化合物主要由它們各自的氨基酸前體(鳥氨酸、組氨酸和酪氨酸)經(jīng)特異性脫羧酶作用而形成[17]。研究發(fā)現(xiàn),乳酸菌的生長代謝是葡萄酒中生物胺的主要來源,產(chǎn)生生物胺的能力可能與菌株相關(guān),而不是某種物種特有的[18]。優(yōu)良抗逆菌株的生物胺相關(guān)基因分析結(jié)果如圖3所示,通過檢測(cè)合成組胺、酪胺和腐胺的功能性基因(hdc、tdc、odc)結(jié)果如圖3所示,優(yōu)良抗逆酒類酒球菌均未擴(kuò)增出生物胺相關(guān)功能性基因條帶,表明菌株不具有產(chǎn)生生物胺的能力。

M-DL5000 DNA Marker;1-XMN18;2-XM12;3-XM16;4-BM43;5-BM68;6-BM79;7-XC22-N-3;8-XC22-N-19

2.4 低pH與高乙醇濃度模擬環(huán)境MLF能力分析

葡萄酒中乙醇的濃度是抑制乳酸菌生長主要因素,研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)大于10%時(shí)對(duì)菌株有抑制作用[19]。優(yōu)良抗逆菌株在pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)14%模擬酒中的L-蘋果酸代謝能力和活菌數(shù)變化如圖4-A、圖4-C所示,與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第6天)比較,XMN18和BM68在發(fā)酵的第4天均完成MLF,且活菌數(shù)維持在107CFU/mL。前期L-蘋果酸代謝速度最快的是XMN18,在0～2 d時(shí)降解了1.76 g/L,其次BM68降解了1.48 g/L,兩者發(fā)酵速度較SD-2a(1.33 g/L)和31-DH(0.99 g/L)顯著快。另外,XM12和XM16表現(xiàn)相似,在0～2 d時(shí)降解了0.85 g/L,但在發(fā)酵的第6天L-蘋果酸含量仍維持在1 g/L,且活菌數(shù)僅維持在104CFU/mL。BM43、BM79、XC22-N-3、XC22-N-9對(duì)酒精的耐受性較差,在發(fā)酵第6天菌株的活菌數(shù)均低于105CFU/mL,特別是BM43,在發(fā)酵的第6天L-蘋果酸含量?jī)H減少了1.07 g/L。說明菌株對(duì)乙醇的耐受能力有所不同,這與學(xué)者研究一致,研究?jī)?nèi)容表明高乙醇濃度對(duì)菌株的生長有一定的抑制作用[19]。除此之外,優(yōu)良抗逆菌株在pH 3.2、乙醇體積分?jǐn)?shù)10%模擬酒中的L-蘋果酸代謝能力和活菌數(shù)變化如圖4-B、圖4-D所示,與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第4天)比較,所有優(yōu)良抗逆菌株均能完成MLF,且活菌數(shù)維持在106～107CFU/mL。其中,XM12發(fā)酵速度最快,其次是BM68,在發(fā)酵的第2天均完全代謝L-蘋果酸。除XC22-N-3之外,其余優(yōu)良抗逆菌株在發(fā)酵的第2天可代謝L-蘋果酸至0.4 g/L以下。另外,在發(fā)酵初期只有XMN18和BM68活菌數(shù)升高,說明相比于其他菌株,XMN18和BM68更耐低酸環(huán)境?？傊?篩選獲得的優(yōu)良抗逆菌株均能在低酸脅迫環(huán)境中快速代謝L-蘋果酸完成MLF,而只有XMN18和BM68才能較好的適應(yīng)高乙醇濃度的脅迫環(huán)境。

A-pH 3.8、14%(乙醇體積分?jǐn)?shù))下菌株的L-蘋果酸代謝;B- pH 3.2、10%(乙醇體積分?jǐn)?shù))下菌株的L-蘋果酸代謝;C-pH 3.8、14%(乙醇體積分?jǐn)?shù))下菌株的活菌數(shù)變化;D-pH 3.2、10%(乙醇體積分?jǐn)?shù))下菌株的活菌數(shù)變化

2.5 優(yōu)良菌株釀造試驗(yàn)分析

2.5.1L-蘋果酸代謝能力

將8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌接種至葡萄酒(L-蘋果酸含量為1.34 g/L)中,在整個(gè)MLF過程中對(duì)菌株代謝L-蘋果酸的能力進(jìn)行監(jiān)測(cè)。由圖5可知,葡萄酒中L-蘋果酸的含量隨著發(fā)酵時(shí)間的延長而逐漸減少,8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌均可以完全代謝L-蘋果酸(<0.2 g/L)完成MLF。與優(yōu)良自篩菌株SD-2a(第4天)和商業(yè)菌株31-DH(第4天)比較,XMN18和BM68代謝L-蘋果酸最快,在發(fā)酵的第3天完成MLF,其次是XM12在發(fā)酵的第4天完成MLF,接著是XM16在發(fā)酵的第5天完成MLF,剩余菌株則是在發(fā)酵的第6天完成MLF。結(jié)果表明,優(yōu)良抗逆酒類酒球菌在葡萄酒中具有較好的L-蘋果酸代謝能力。此外,與上述pH 3.8、乙醇體積分?jǐn)?shù)14%模擬酒中優(yōu)良抗逆菌株的L-蘋果酸代謝能力比較,雖然模擬酒和葡萄酒的pH值與乙醇濃度相同,但在模擬酒中XM12、XM16、BM43、BM79、XC22-N-3、XC22-N-9沒有完全代謝L-蘋果酸而在葡萄酒中均完成了MLF,可能是由于葡萄酒中存在酵母產(chǎn)生的多糖等次級(jí)代謝物及葡萄自身含有的微量元素和能量物質(zhì)等增強(qiáng)了乳酸菌的生長能力,進(jìn)而提升了其對(duì)脅迫環(huán)境的耐受能力[20]。

圖5 優(yōu)良抗逆菌株在葡萄酒中進(jìn)行MLF的L-蘋果酸代謝能力

2.5.2 葡萄酒基本理化指標(biāo)分析

表2顯示了MLF后葡萄酒的基本理化指標(biāo)的變化。與未MLF的葡萄酒比較,MLF后的葡萄酒的pH值隨著總酸的下降而升高0.4～0.6個(gè)單位,殘?zhí)橇烤邢陆?揮發(fā)酸含量低于1.20 g/L,符合國家標(biāo)準(zhǔn)。綜上,表明采用8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌進(jìn)行MLF后的葡萄酒的基本理化指標(biāo)符合國家標(biāo)準(zhǔn),菌株在釀造本土特色葡萄酒中具有十分廣闊的應(yīng)用潛力。

表2 葡萄酒的基本理化指標(biāo)

2.5.3 菌株對(duì)葡萄酒香氣成分的影響

2.5.3.1 葡萄酒的香氣成分分析

采用GC-MS對(duì)篩選得到的優(yōu)良抗逆酒類酒球菌MLF后的葡萄酒進(jìn)行了檢測(cè)分析。結(jié)果見附表1(https://doi.org/10.13995/j.cnki.11-1802/ts.034093),共檢出45種香氣化合物,包括乙酸酯類(5種)、乙酯類(12種)、其他酯類(3種)、高級(jí)醇類(8種)、脂肪酸類(5種)、萜烯類(5種)、醛類(4種)、揮發(fā)性酚(2種)、呋喃類(1種),并將對(duì)葡萄酒香氣具有貢獻(xiàn)的香氣成分即氣味活性值(odor activity values,OAV)大于0.1的香氣成分進(jìn)行分析,見表3。結(jié)果表明,不同優(yōu)良抗逆菌株發(fā)酵酒樣的香氣物質(zhì)含量有所差異,與未MLF(酯類66 605.62 μg/L;醛類70.65 μg/L)相比,經(jīng)MLF后酯類物質(zhì)總含量(88 259.86～143 642.88 μg/L)顯著升高,但醛類物質(zhì)總含量(15.61～42.56 μg/L)顯著降低,尤其是乳酸乙酯(乳香,黃油;0.11)α-松油醇(百合花香;0.11)和癸酸乙酯、乳酸乙酯(0.1

表3 葡萄酒的OAV(>0.1)及香氣物質(zhì)描述

2.5.3.2 主成分分析

為了進(jìn)一步探究?jī)?yōu)良抗逆菌株與香氣化合物之間關(guān)系及對(duì)葡萄酒香氣成分的整體差異,將上述OAV>0.1的香氣物質(zhì)進(jìn)行PCA,如圖6所示,其中PC1占53.69%,PC2占21.97%,兩個(gè)主成分的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為75.66%,基本可以解釋原變量大多數(shù)的變異信息。優(yōu)良抗逆酒類酒球菌發(fā)酵酒樣香氣成分與未MLF酒樣和對(duì)照菌株發(fā)酵酒樣很好的分離開,未MLF酒樣處于PC2的負(fù)向端,這個(gè)區(qū)域沒有呈現(xiàn)相關(guān)物質(zhì)。對(duì)照菌株31-DH和SD-2處于PC1的負(fù)向端,主要與乙酸乙酯、丁酸乙酯、苯乙醇、異戊醇、D-檸檬烯的香氣相關(guān),呈現(xiàn)更多香蕉、柑橘、玫瑰花香、溶劑的香氣。而XMN18、XM12、XM16、BM79、XC22-N-3、XC22-N-19分布于PC1和PC2的正向端,主要為酯類(乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯)和萜烯類(α-松油醇和芳樟醇),使葡萄酒表現(xiàn)更多草莓、香蕉、菠蘿、柑橘、黃油等果香和奶香。此外,BM43和BM68的香氣表現(xiàn)相似,分布于PC1的正向端和PC2的負(fù)向端,與香葉醇、癸酸和糠醛相關(guān)性較大,主要使葡萄酒呈現(xiàn)更多烘烤味和酸奶酪味,香氣表現(xiàn)單一。

圖6 優(yōu)良抗逆菌株MLF后葡萄酒香氣化合物主成分分析

本試驗(yàn)通過ATB脅迫培養(yǎng)基篩選的優(yōu)良抗逆菌株均為酒類酒球菌,這與目前的研究結(jié)果一致,酒類酒球菌是在葡萄酒進(jìn)行MLF過程中存在的主要菌株,它具有優(yōu)良的抗脅迫能力,如抗低pH值,高乙醇體積分?jǐn)?shù),高SO2等[8]。另外,本試驗(yàn)針對(duì)寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)葡萄原料面臨的問題:高糖度(即高酒精度)和高酸度(即低pH值)分別設(shè)計(jì)兩種模擬酒脅迫環(huán)境以篩選適合寧夏賀蘭山東麓不同子產(chǎn)區(qū)葡萄原料的本土優(yōu)良抗逆乳酸菌,其中XMN18和BM68表現(xiàn)出較好的抗高乙醇體積分?jǐn)?shù)的能力,而XM12表現(xiàn)出較好的抗低pH能力。酒類酒球菌除了可以代謝L-蘋果酸使葡萄酒的酸澀口感變得柔和,而且在MLF過程中可以產(chǎn)生次級(jí)代謝物來提升葡萄酒香氣的復(fù)雜性,賦予葡萄酒烘烤味、奶油味和蜂蜜味等香氣[23]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,篩選獲得的優(yōu)良抗逆酒類酒球菌發(fā)酵酒樣的香氣物質(zhì)總含量均高于未MLF酒樣,主要是乙酸異戊酯、癸酸乙酯、己酸乙酯、乳酸乙酯、丁二酸二乙酯、α-松油醇和芳樟醇等香氣物質(zhì),可賦予葡萄酒更多草莓、香蕉、菠蘿、柑橘、黃油等果香和奶香香氣。綜上所述,8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌具有良好的抗脅迫能力、L-蘋果酸代謝能力和產(chǎn)香能力,為建立寧夏賀蘭山東麓產(chǎn)區(qū)菌種資源及遺傳多樣性提供了菌株樣本,同時(shí)為發(fā)展我國本土優(yōu)良乳酸菌、呈現(xiàn)和塑造特色葡萄酒具有重要意義。

3 結(jié)論

采用ATB分離培養(yǎng)基從寧夏賀蘭山東麓葡萄酒產(chǎn)區(qū)分離篩選獲得388株乳酸菌,經(jīng)抗逆篩選、分子生物學(xué)、菌株安全性等鑒定,得到其中8株具有優(yōu)良抗逆性能的酒類酒球菌。

8株優(yōu)良抗逆酒類酒球菌對(duì)高乙醇體積分?jǐn)?shù)(14%)、低pH值(3.2)環(huán)境具有良好的耐受性,可快速代謝L-蘋果酸完成葡萄酒的蘋乳發(fā)酵。

優(yōu)良抗逆酒類酒球菌在葡萄酒中進(jìn)行MLF,表現(xiàn)出L-蘋果酸代謝速度快,發(fā)酵酒樣香氣含量高,酒香豐盈,有助于本土優(yōu)良乳酸菌的發(fā)展和產(chǎn)區(qū)特色葡萄酒的釀造。