張 歡，胡朝輝，王晨豫，勾耀鵬，王 亮，齊亞銀★

（1.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院 832003；2.新疆泰昆集團(tuán)有限責(zé)任公司 831100；3.新疆天潤乳業(yè)股份有限公司 830000）

牛呼吸道疾病（Bovine respiratory disease，BRD）是由多種病毒或細(xì)菌引起的牛肺炎、運(yùn)輸熱、支氣管炎等為主要癥狀的疾病。常發(fā)生于新引進(jìn)牛群及秋冬季節(jié)的牛群，疾病的嚴(yán)重程度與牛自身免疫力、應(yīng)激強(qiáng)度、飼養(yǎng)管理等有關(guān)，臨床表現(xiàn)為高熱、食欲下降、精神沉郁、呼吸困難、咳嗽、流涎等[1]。很少有呼吸道問題是由單一病原引起的，引起B(yǎng)RD 的原因有很多種，病毒、細(xì)菌和應(yīng)激因子三方面融合在一起往往會(huì)導(dǎo)致牛只發(fā)病[2]。牛病毒性腹瀉病（Bovine Viral Diarrhea，BVD）是由牛病毒性腹瀉病毒（Bovine viral diarrhea virus，BVDV）感染牛引起的以發(fā)熱、腹瀉、消化道黏膜糜爛、產(chǎn)奶量下降、流產(chǎn)和死胎等為主要臨床癥狀的一類急性、接觸性傳染病[3]。牛傳染性鼻氣管炎（infectious bovine rhinotracheitis，IBR）是由牛傳染性鼻氣管炎病毒（infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）引起的以鼻炎、支氣管炎等上呼吸道疾病以及母牛流產(chǎn)、胎兒畸形、生殖道感染為主要臨床特征的一種熱性、接觸性傳染病[4]。而BVD 和IBR 是BRD 的主要病原。這些病毒會(huì)引起牛持續(xù)的免疫力抑制，破壞牛呼吸道黏膜的防御系統(tǒng)，影響呼吸道的第一道防線抵御病原菌的功能。感染病毒之后會(huì)破壞呼吸道表層絨毛系統(tǒng)，使得巴氏桿菌、曼氏桿菌包括支原體內(nèi)的常在菌有機(jī)會(huì)順利地通過呼吸道進(jìn)入到肺臟、支氣管引發(fā)肺炎，進(jìn)而導(dǎo)致肺組織損傷，俗稱 “爛肺病”。有數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)牛送入屠宰場(chǎng)屠宰時(shí)，會(huì)發(fā)現(xiàn)爛肺和肺臟損傷的牛比牧場(chǎng)所記錄的發(fā)病肺炎的牛多了一倍，也就意味著在育肥過程中，有一半的BRD 發(fā)病牛并沒有發(fā)現(xiàn)，呈隱性發(fā)病或者獸醫(yī)并未及時(shí)發(fā)現(xiàn)[5,6]。

本實(shí)驗(yàn)對(duì)某個(gè)規(guī)?；翀?chǎng)牛群進(jìn)行BVD 和IBR 的感染情況進(jìn)行調(diào)查，本實(shí)驗(yàn)采集血液樣本共計(jì)194 份，患有呼吸道癥狀犢牛鼻拭子10 份，通過血清學(xué)檢測(cè)的方法結(jié)合實(shí)驗(yàn)室PCR 的方法進(jìn)行調(diào)查。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果給該牧場(chǎng)提供BVD、IBR 科學(xué)的防控依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2022 年5 月對(duì)新疆昌吉地區(qū)某規(guī)?；翀?chǎng)牛群采集血液樣本共計(jì)194 份，使用5 mL 采血器進(jìn)行采集并進(jìn)行標(biāo)號(hào)，將采集好的采血器裝入試管架略微傾斜置于37℃環(huán)境中靜置析出血清。將血清分裝在1.5 mL 的EP 管中編號(hào)-20℃保存?zhèn)溆?。采集臨床癥狀表現(xiàn)為流黏膿性鼻液、咳嗽的犢牛鼻拭子10 份。放于長離心管中，置于液氮中保存。

1.2 主要試劑

TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA 試劑盒購自寶日醫(yī)生物技術(shù)(北京)有限公司，BVD、IBR 抗體檢測(cè)測(cè)試卡購自北京標(biāo)馳澤惠生物科技股份有限公司；PrimeScript ? RT Master Mix購自TaKaRa 公司。

2 方法

2.1 血清學(xué)調(diào)查

將分裝好的樣品按照標(biāo)馳澤惠BVD、IBR 血清抗體測(cè)試卡說明書進(jìn)行步驟進(jìn)行。取70 μL 加入測(cè)試卡中，等待20 min 后，將測(cè)試卡插入讀卡機(jī)中讀取數(shù)值。

2.2 分子生物學(xué)調(diào)查

2.2.1 病毒DNA/RNA 提取

將鼻拭子樣品從超低溫冰箱-80℃取出，置4℃冰箱中融化。按照TaKaRa MiniBEST Viral RNA/DNA 試劑盒說明書提取。

2.2.2 引物設(shè)計(jì)

參考參照文獻(xiàn)[7,8]設(shè)計(jì)引物。見表1，表2。

表1 BVDV 5'-UTR 基因引物序列

表2 IBRVgD 基因的引物序列

按照參考文獻(xiàn)中反應(yīng)體系進(jìn)行，反應(yīng)結(jié)束后使用反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠實(shí)驗(yàn)。

3 結(jié)果與分析

3.1 血清學(xué)檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果見表3。

表3 BVDV 感染的ELISA 檢測(cè)結(jié)果

3.2 分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果

結(jié)果10 份患有呼吸道癥狀鼻拭子提取樣中BVD 抗原陽性率0%，IBR 抗原陽性率30%。見圖1。

圖1 BVD、IBR 核酸檢測(cè)結(jié)果

4 討論

BVD、IBR 對(duì)牧場(chǎng)威脅非常大且該病研究至今并無特效藥品。僅能使用疫苗來進(jìn)行免疫防控[9,10]。但現(xiàn)在很多牧場(chǎng)存有僥幸心理，僅考慮本牧場(chǎng)從未暴發(fā)過該病，并不考慮整體大環(huán)境，新疆各個(gè)地區(qū)均有BVD、IBR 發(fā)病。自1980 年從新西蘭通過引進(jìn)肉牛傳入我國，該病在我國各個(gè)地區(qū)廣泛流行。未免疫牧場(chǎng)依舊存在很大的感染壓力。有野毒感染的風(fēng)險(xiǎn)。董坤對(duì)吉林部分地區(qū)牧場(chǎng)牛群796 份糞便樣品進(jìn)行抗原檢測(cè)，其檢出率為3.45%～42.65%[11]。杞艷萍對(duì)西北四省包括陜西、寧夏、新疆和西藏17 個(gè)牛場(chǎng)采集1234 份牛群血清樣本進(jìn)行抗原檢測(cè)，BVDV 陽性率為7.2%（89/1234）[12]。李天增于2019 年～2020年對(duì)國內(nèi)7 個(gè)奶牛重點(diǎn)養(yǎng)殖區(qū)域的98 家規(guī)模牛場(chǎng)2 831 份血清樣本進(jìn)行BVD 抗體調(diào)查，出現(xiàn)BVDV 抗體陽性牛場(chǎng)的比例為99.47%[13]。2011 年～2013 年羅玉江在新疆四個(gè)不同地區(qū)規(guī)模化奶牛場(chǎng)檢測(cè)IBRV 血清抗體陽性率為87.4%[9]。2017 年宋健發(fā)現(xiàn)新疆部分地區(qū)規(guī)模化養(yǎng)殖場(chǎng)IBRV 抗原陽性率為70%[8]。2018 年王標(biāo)發(fā)現(xiàn)新疆某規(guī)?；翀?chǎng)犢牛IBR 的診斷發(fā)病率為38.36%[10]。李欣宇等發(fā)現(xiàn)新疆兩家牛場(chǎng)引進(jìn)的安格斯牛IBRV抗體陽性率為100.00%[14]。研究結(jié)果表明全國各地BVD、IBR廣泛流行于全國各地牧場(chǎng)。世界各國流行情況也是如此，目前IBR 只在丹麥和瑞典及其他少數(shù)國家徹底凈化[15]。從特定區(qū)域徹底根除BVDV 和IBR 對(duì)牧場(chǎng)和監(jiān)管機(jī)構(gòu)有利，但邊境控制和持續(xù)監(jiān)測(cè)對(duì)防止病毒重新進(jìn)入對(duì)已免疫的牛群至關(guān)重要[16]。牧場(chǎng)對(duì)BVD、IBR 進(jìn)行凈化是最終目的，現(xiàn)階段防控策略建議全群檢測(cè)，淘汰陽性PI 牛是牧場(chǎng)主要措施。檢測(cè)、監(jiān)測(cè)、淘汰陽性牛，消滅傳染源，加強(qiáng)牧場(chǎng)圈舍消毒，引種時(shí)加強(qiáng)檢測(cè)力度。避免外界病毒傳入牛群，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，提高牛群免疫力，避免外界野毒感染牛群[17]。

本場(chǎng)牛群為經(jīng)免場(chǎng)。成母牛均有較高的抗體水平，對(duì)BVD和IBR 兩種疾病有較高的抵抗能力。小牛未免疫，母牛在妊娠兩月前加強(qiáng)免疫，犢牛通過吃初乳來獲得母源抗體。而分子生物學(xué)檢測(cè)結(jié)果，10 份鼻拭子BVD、IBR 抗原陽性率分別為0 和30%。建議給犢牛加強(qiáng)免疫IBR 疫苗和泰拉霉素。可能在飼養(yǎng)管理中初乳喂養(yǎng)量不足，或者其他原因?qū)е聽倥３霈F(xiàn)呼吸道癥狀，有可能是巴氏桿菌、支原體、環(huán)境因素等其他原因。本實(shí)驗(yàn)給該規(guī)模化牧場(chǎng)防控、凈化BVD 和IBR 提供了科學(xué)的依據(jù)。