曹 婧,戴忠良,徐迎春,劉春貴,徐 婷,孫春青,*

(1 江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇句容 212400;2 南京農(nóng)業(yè)大學(xué),南京 210095;3 江蘇里下河地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所,江蘇揚(yáng)州 225000)

睡蓮科(Nymphaeaceae)有8～9屬約100個(gè)種,其中睡蓮屬(Nymphaea)有50余種[1]。睡蓮屬植物根據(jù)心皮附屬物的有無可分為Nymphaea亞屬、Brachyceras亞屬、Anecphya亞屬、Lotos亞屬和Hydrocallis亞屬[2]。其中,Nymphaea亞屬包括8種,在北半球的溫帶地區(qū)分布;Brachyceras亞屬包括14～16個(gè)種,在熱帶和亞熱帶地區(qū)分布;Anecphya亞屬包括7～10個(gè)種,主要在澳大利亞和新幾內(nèi)亞分布;Lotos亞屬包括3～4個(gè)種,在熱帶地區(qū)分布;Hydrocallis亞屬包括14個(gè)種,在熱帶地區(qū)分布[3]。盡管有些睡蓮亞屬的種數(shù)量少,但是睡蓮屬植物在生活史、心皮形態(tài)、繁育系統(tǒng)、傳粉生物學(xué)等方面表現(xiàn)出顯著的多樣性[4-8]。

目前,從形態(tài)學(xué)[9]、解剖學(xué)[10]和分子生物學(xué)[3]已對(duì)睡蓮屬植物的系統(tǒng)分類和進(jìn)化關(guān)系進(jìn)行了相關(guān)研究,但仍存在互相矛盾的觀點(diǎn)[2],因此,有必要從孢粉學(xué)角度研究睡蓮屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系。更重要的是,睡蓮屬處于被子植物系統(tǒng)進(jìn)化的關(guān)鍵位置[11],并且睡蓮屬植物在生態(tài)和形態(tài)特征上具有多樣性,因此,睡蓮屬植物孢粉學(xué)的特征對(duì)于研究早期被子植物生殖特征進(jìn)化至關(guān)重要。但是先前的研究?jī)H對(duì)睡蓮屬植物的數(shù)種花粉特征開展研究。例如,楊梅花等僅對(duì)4種睡蓮的花粉形態(tài)進(jìn)行研究,結(jié)果表明雪白睡蓮(N.candida)的花粉形態(tài)特征在睡蓮屬植物中較原始[12]。

同樣地,Zini等僅對(duì)Hydrocallis亞屬的3個(gè)種花粉粒發(fā)育特征和超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)Hydrocallis亞屬花粉的花粉壁較光滑,花粉壁無顆粒、棒狀、疣狀等紋飾[10]?，F(xiàn)有睡蓮屬植物孢粉學(xué)研究缺乏多個(gè)亞屬關(guān)鍵的花粉形態(tài)特征資料,因此需要對(duì)睡蓮屬植物未報(bào)道的花粉形態(tài)特征進(jìn)行研究,并對(duì)其進(jìn)行全面比較分析。此外,耐寒睡蓮與熱帶睡蓮跨亞屬雜交的母本大多選擇香睡蓮塊莖類型的耐寒睡蓮[13],因此本研究對(duì)香睡蓮的花粉活力進(jìn)行評(píng)價(jià),因?yàn)樵谒忞s交組合中母本自交結(jié)實(shí)率高更易獲得跨亞屬雜交種[14],而花粉生活力可直接影響自交結(jié)實(shí)率,以期為耐寒睡蓮與熱帶睡蓮的跨亞屬雜交提供理論依據(jù)。

本研究利用掃描電鏡對(duì)4個(gè)亞屬的18種或品種睡蓮花粉進(jìn)行形態(tài)觀察,測(cè)量和分析了花粉的形態(tài)特征,采用離體萌發(fā)法對(duì)‘彼得’的花粉活力進(jìn)行測(cè)定,研究結(jié)果可為睡蓮屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化提供證據(jù),也可為睡蓮雜交育種親本的選擇提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試材料均保存在江蘇丘陵地區(qū)鎮(zhèn)江農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所水生植物資源保存圃。本試驗(yàn)選擇4個(gè)亞屬的18種或品種睡蓮的具體性狀特征見表1。2021年9月,待睡蓮陸續(xù)開放,收集供試睡蓮的成熟新鮮花粉。

1.2 方 法

1.2.1 睡蓮花粉形態(tài)學(xué)研究將睡蓮花藥分別置于2.5%戊二醛(用pH 7.2的0.1 mol/L的磷酸緩沖液配制)溶液中4 ℃固定4 h固定8 h以上。

用生理鹽水進(jìn)行3次沖洗,每次10 min;再經(jīng)50%乙醇→60%乙醇→70%乙醇→80%乙醇→90%乙醇→100%乙醇梯度脫水,每個(gè)處理15～20 min,將樣品置于4 ℃過夜。

再將脫水過夜處理的花粉進(jìn)行乙酸異戊酯置換、二氧化碳臨界點(diǎn)干燥[15-17]。脫水和干燥后用雙面膠將花粉均勻地粘在金屬臺(tái)上,真空噴金、鍍膜后用Hitachi S-3000N型掃描電鏡(日本Hitachi公司)進(jìn)行觀察。

運(yùn)用系統(tǒng)聚類組間聯(lián)接的分析方法,根據(jù)平方歐氏距離測(cè)量,最終獲得18種或品種睡蓮屬植物花粉聚類分析圖,從而推斷其系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律以及它們的親緣關(guān)系[20]。

1.2.3 睡蓮花粉生活力研究采用離體培養(yǎng)法對(duì)睡蓮品種‘彼得’進(jìn)行花粉生活力測(cè)定。用吸管吸取2～3滴柱頭液于載玻片作為培養(yǎng)液,選擇第2天開放的耐寒睡蓮花朵,于上午9:00用鑷子沾取花粉播種于載玻片的柱頭液上,后將載玻片放入墊有濕潤(rùn)濾紙的培養(yǎng)皿中,置于恒溫光照培養(yǎng)箱,28 ℃培養(yǎng)4～6 h。

顯微鏡下觀察花粉萌發(fā)情況,以花粉管長(zhǎng)度大于或者等于花粉粒長(zhǎng)度作為花粉管成功萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)[21]。

隨機(jī)選擇3個(gè)視野,統(tǒng)計(jì)花粉粒數(shù)量及萌發(fā)數(shù)量,每個(gè)視野隨機(jī)抽取3粒萌發(fā)的花粉粒,測(cè)量花粉管長(zhǎng)度。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2003進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析,圖片處理采用Adobe Photoshop CS5。

2 結(jié)果與分析

2.1 花粉粒形態(tài)特征

利用掃描電鏡對(duì)18種或品種睡蓮屬植物的花粉形態(tài)進(jìn)行觀察,發(fā)現(xiàn)18種或品種睡蓮屬植物的花粉都是單?；ǚ邸?/p>

如圖版Ⅰ所示,18種或品種睡蓮屬植物花粉粒極軸/赤道軸比值范圍為:0.62～0.89,形態(tài)均為近球體或扁球體,極面觀為圓形或近圓形,赤道面觀為圓形、長(zhǎng)圓形或近圓形;其中,花粉粒極軸長(zhǎng)度范圍:15.1～27.9 μm,赤道軸長(zhǎng)度范圍:24.5～32.8 μm,巨花睡蓮花粉粒最大,體積指數(shù)為30.3;埃及白花粉粒最小,體積指數(shù)為19.2;其余花粉粒體積指數(shù)在26左右(表2)。此外,埃及白睡蓮、喀麥隆睡蓮、印度紅睡蓮、墨西哥黃睡蓮的花粉形態(tài)具有異極性。例如:墨西哥黃睡蓮花粉的遠(yuǎn)極面光滑,而近極面為瘤狀紋飾。

埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為單槽萌發(fā)溝,而其他17種睡蓮屬植物都為環(huán)槽萌發(fā)溝,且與赤道平行(圖版Ⅰ和Ⅱ)。

栽培品種‘達(dá)爾文’和‘佛羅里達(dá)’為遠(yuǎn)級(jí)環(huán)槽類型,其他15個(gè)種或品種屬于赤道環(huán)槽或者近赤道環(huán)槽。

香睡蓮、‘達(dá)爾文’、‘火冠’、‘亞克’、‘佛羅里達(dá)’和‘征服者’的花粉萌發(fā)溝較淺。Brachyceras亞屬的藍(lán)星睡蓮萌發(fā)溝內(nèi)有環(huán)形嵴。

18種或品種睡蓮屬植物花粉外壁紋飾存在一定差異,類型也比較豐富(表3),大部分為小顆粒狀、瘤狀和小柱狀,少數(shù)具有長(zhǎng)條狀、微波紋起伏狀和網(wǎng)紋狀(圖版Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ)。Lotos亞屬喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮的花粉外壁表面均較為平滑,附屬物少;而印度紅睡蓮的花粉外壁表面可觀察到顆粒狀紋飾。巨花睡蓮、小花睡蓮和睡蓮子午蓮的花粉外壁為顆粒狀凸起紋飾。

藍(lán)星睡蓮和一些具有香睡蓮塊莖的種和品種(香睡蓮、‘亞克’、‘火冠’)花粉外壁具有顆粒狀凸起、棒狀和刺狀紋飾,只是紋飾的密度和高度有差異。

2.2 聚類分析

聚類分析結(jié)果如圖1所示,18種或品種睡蓮屬植物可分為4個(gè)類群。第1類群有香睡蓮、白睡蓮、墨西哥黃睡蓮和睡蓮子午蓮4個(gè)原生種以及‘寬瓣白睡蓮’、‘達(dá)爾文’、‘火冠’、‘亞克’、‘佛羅里達(dá)’、‘征服者’和‘彼得’7個(gè)栽培種,其花粉主要為圓球形,幾乎每個(gè)品種都有多個(gè)外壁紋飾類型,P/E值在0.70～0.84之間。第2類群有藍(lán)星睡蓮、小花睡蓮和埃及藍(lán)睡蓮3個(gè)原生種,花粉為扁球形,其P/E值在0.70～0.73之間,體積指數(shù)相近(22.0～23.0),均有瘤狀附屬物。第3類群僅有巨花睡蓮,花粉形態(tài)為圓球形,P/E值為0.85,外壁紋飾為微波紋起伏狀,極軸、赤道軸等各項(xiàng)指標(biāo)數(shù)據(jù)均較大。第4類群有印度紅睡蓮、喀麥隆睡蓮和埃及白睡蓮3個(gè)原生種,其P/E值在0.62～0.89之間,這3個(gè)原生種的體積指數(shù)、溝長(zhǎng)遠(yuǎn)小于其他種(品種),表面紋飾單一,與其他3個(gè)類群又明顯區(qū)別。

2.3 花粉生活力

‘彼得’花粉在28 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱生長(zhǎng)6 h后,花粉萌發(fā)比例高達(dá)95%,如圖2所示,睡蓮花粉粒生長(zhǎng)出花粉管,平均長(zhǎng)度約為260 μm,花粉管生長(zhǎng)狀態(tài)好。因?yàn)樗徥诜酆蠡ǚ凼锹涞街^液中,經(jīng)過長(zhǎng)期進(jìn)化選擇,柱頭液內(nèi)含豐富的氨基酸、微量元素[21],為睡蓮花粉發(fā)育提供了最有利的條件,使得花粉具有較好的育性。

3 討 論

3.1 睡蓮屬植物花粉形態(tài)多樣性及分類學(xué)意義

18種或品種睡蓮屬植物的花粉形態(tài)具有豐富的多樣性。花粉形態(tài)的聚類分析結(jié)果可將18種或品種睡蓮屬植物分為4個(gè)類群,這一結(jié)果與基于核糖體DNA的ITS序列[3]和葉綠體基因[2]所建立的系統(tǒng)分類一致。18種或品種睡蓮屬植物的花粉萌發(fā)溝除了埃及藍(lán)睡蓮是單槽的,其余均為環(huán)槽形的,并且環(huán)槽形花粉溝的位置在花粉遠(yuǎn)極端和赤道間變化,而以前的研究結(jié)果都認(rèn)為睡蓮屬植物的花粉萌發(fā)溝都是環(huán)槽類型的[22-23]。Brachyceras亞屬的3個(gè)種都有明顯區(qū)別于其他種的花粉形態(tài)特征,這為這些種的鑒定提供了依據(jù)。Anecphya亞屬的澳大利亞巨睡蓮的花粉體積最大,可能由于其所處的生態(tài)環(huán)境影響所致,這些特征也是鑒定這些種的可靠依據(jù)。Lotos亞屬的花粉外壁紋飾較光滑,且花粉形態(tài)差異小,這與前人的研究結(jié)果[24]一致,可以利用花粉形態(tài)特征從睡蓮屬植物中將Lotos亞屬區(qū)分開來。Nymphaea亞屬中具有香睡蓮塊莖的種和品種的花粉外壁紋飾相似度較高,一般都具有棒狀、刺狀和顆粒狀紋飾,只是紋飾的密度和高度有差異,這一特征可以區(qū)分大多數(shù)睡蓮屬植物中具有香睡蓮血統(tǒng)的種和品種。根據(jù)上述特征,我們推斷Nymphaea亞屬的栽培品種‘亞克’、‘火冠’、‘佛羅里達(dá)’和‘征服者’都可能是香睡蓮的雜交品系。此外,以Brachyceras亞屬藍(lán)星睡蓮、Nymphaea亞屬香睡蓮為代表,其花粉粒表面小顆粒突出且數(shù)量多,且都具有棒狀、刺狀紋飾,這些特征可對(duì)花粉起到較好的保護(hù)作用,有利于結(jié)實(shí)和發(fā)育,因此這些種作為親本雜交成功率大。

3.2 睡蓮屬植物花粉形態(tài)特征的系統(tǒng)進(jìn)化趨勢(shì)

花粉的形態(tài)特征,特別是花粉外壁紋飾、萌發(fā)溝等特征,對(duì)于了解睡蓮屬植物系統(tǒng)演化、親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類均有重要意義?；ǚ弁獗诒砻婕y飾特點(diǎn)可以反映植物進(jìn)化的一般規(guī)律[25],花粉外壁表面較光滑的較為原始,其次為顆粒狀凸起,再到棒狀、刺狀,最終演化為條紋狀及網(wǎng)狀[26]。本研究中,Lotos亞屬中喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮和印度紅睡蓮的花粉形態(tài)相似,但三者的花粉外壁紋飾不同,其中喀麥隆睡蓮、埃及白睡蓮的花粉外壁表面均較為平滑,附屬物少,說明它們?cè)谒弻僦参镏休^為原始、進(jìn)化程度較淺,而印度紅睡蓮的花粉外壁表面可觀察到有顆粒狀附屬物存在,說明有進(jìn)化發(fā)展的趨勢(shì);Zini等[23]發(fā)現(xiàn)Hydrocallis亞屬的3個(gè)種花粉壁較光滑,表明Hydrocallis亞屬和Lotos亞屬的種在睡蓮屬植物中最原始,并且這2個(gè)亞屬的種可能有共同的起源[24]。Anecphya亞屬巨花睡蓮、Brachyceras亞屬的小花睡蓮、Nymphaea亞屬的睡蓮子午蓮的花粉外壁都有顆粒狀凸起,Brachyceras亞屬的藍(lán)星睡蓮、Nymphaea亞屬的香睡蓮花粉外壁的顆粒狀凸起更加明顯,且藍(lán)星睡蓮和香睡蓮粉外壁在顆粒狀凸起的基礎(chǔ)上演變出棒狀和刺狀紋飾,說明睡蓮屬植物是不斷進(jìn)化的,其中Nymphaea亞屬的香睡蓮在睡蓮屬植物中進(jìn)化程度較高。此外,Nymphaea亞屬中的墨西哥黃睡蓮花粉的遠(yuǎn)極面是光滑的,而近極面具有顆粒狀凸起,說明墨西哥黃睡蓮可能是睡蓮屬植物進(jìn)化中的過渡類型。

關(guān)于睡蓮屬植物環(huán)槽萌發(fā)溝的起源一直有爭(zhēng)議,現(xiàn)有兩種假說。第一種假說認(rèn)為環(huán)槽萌發(fā)溝起源于萍蓬草屬(Nuphar)的單槽萌發(fā)溝[27]。本研究中埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為單槽萌發(fā)溝,而其他17種睡蓮屬植物都為環(huán)槽萌發(fā)溝,根據(jù)第一種假說,筆者推斷埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝為睡蓮屬植物的原始形態(tài),而環(huán)槽萌發(fā)溝是睡蓮屬植物的進(jìn)化形式。第二種假說認(rèn)為睡蓮屬植物環(huán)槽萌發(fā)溝是單孔形式的,環(huán)槽是單孔結(jié)構(gòu)的擴(kuò)展,花粉粒的整個(gè)遠(yuǎn)極端半球可看作是單孔的修飾部分[27]。根據(jù)第二種假說,如果遠(yuǎn)極端半球可以看作是修飾蓋,那遠(yuǎn)極端與近極端的超微結(jié)構(gòu)不同[28]。在本研究中,Nymphaea亞屬的白睡蓮和墨西哥黃睡蓮的遠(yuǎn)極面和近極面的超微結(jié)構(gòu)不同,這一結(jié)果支持了第二種假說,但本研究其他睡蓮屬植物不存在這種現(xiàn)象。睡蓮屬植物萌發(fā)溝的進(jìn)化歷程可能為:遠(yuǎn)極單槽→遠(yuǎn)極環(huán)槽→赤道環(huán)槽[24]。根據(jù)這一進(jìn)化歷程,本研究中埃及藍(lán)睡蓮的萌發(fā)溝屬于最原始類型,Nymphaea亞屬白睡蓮和睡蓮子午蓮屬于較原始類型,其余原生種萌發(fā)溝都是較進(jìn)化類型(赤道環(huán)槽)。此外,栽培品種中‘佛羅里達(dá)’和‘達(dá)爾文’屬于遠(yuǎn)極環(huán)槽,可能是由于品種間雜交的原因。

3.3 睡蓮屬植物花粉形態(tài)特征的親緣關(guān)系分析

花粉形態(tài)特征的穩(wěn)定性強(qiáng),可用于植物種間親緣關(guān)系分析[29]。18種或品種睡蓮屬植物的聚類分析結(jié)果表明:Nymphaea亞屬和Brachyceras亞屬中的種和栽培種間的親緣關(guān)系較近;Lotos亞屬中印度紅睡蓮和喀麥隆睡蓮親緣關(guān)系較近,而它們與埃及白睡蓮的親緣關(guān)系較遠(yuǎn);Nymphaea亞屬和Brachyceras亞屬間親緣關(guān)系較近,許多育種者已經(jīng)獲得了這2個(gè)亞屬的雜交種[13,30];Brachyceras亞屬和Anecphya亞屬親緣關(guān)系較遠(yuǎn),但是我們已經(jīng)得到了這2個(gè)亞屬的雜交種,說明利用花粉形態(tài)特征分析睡蓮屬植物的親緣關(guān)系有一定的誤差。Nymphaea亞屬和Anecphya亞屬、Lotos亞屬與其他3個(gè)亞屬間的親緣關(guān)系遠(yuǎn),至今無育種者獲得這些亞屬間的雜交種。

綜上所述,花粉形態(tài)特征,特別是花粉萌發(fā)溝類型、外壁紋飾等特征可為睡蓮屬植物種間分類、亞屬間以及種間親緣關(guān)系、系統(tǒng)進(jìn)化規(guī)律提供關(guān)鍵的證據(jù)。但孢粉學(xué)的研究對(duì)分析睡蓮屬演化、親緣關(guān)系及系統(tǒng)分類具有一定的局限性,仍需通過形態(tài)學(xué)、解剖學(xué)和分子生物學(xué)等手段深入探討和分析,以便更深層次地了解睡蓮屬植物系統(tǒng)演化過程。