余恒毅，徐艷嬌，向 東，劉 璐，李喜平，劉 東，貢雪芃 （華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院藥學部，武漢 430030）

癲癇是神經系統常見疾病之一，影響著全球各年齡階段約5 000萬人群[1]。目前，癲癇的臨床治療包括藥物治療、手術治療、物理治療、心理治療及基因治療等。其中，藥物治療是臨床癲癇治療的首選，但仍約有1/3的患者癲癇發(fā)作時難以控制[2]，因此尋找新的抗癲癇藥備受學者關注。第三代抗癲癇藥主要為2008 年及以后獲批上市的癲癇治療藥物，包括拉考沙胺、吡侖帕奈、盧非酰胺、瑞替加濱、醋酸艾司利卡西平、布瓦西坦等，其中拉考沙胺、吡侖帕奈和盧非酰胺具有新的作用機制，如吡侖帕奈對α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體具有獨特的作用模式，拉考沙胺可通過選擇性地增強電壓門控鈉通道的慢失活來發(fā)揮作用[3]。目前，在我國獲批上市的僅有拉考沙胺和吡侖帕奈。

拉考沙胺于2008 年獲美國FDA 批準上市，現被美國FDA和歐盟藥品管理局（European Medicines Agency，EMA）批準用于1 個月以上患者的部分性癲癇發(fā)作和4歲及以上患者的全面性強直-陣攣性癲癇發(fā)作的輔助治療；該藥于2018 年11 月在我國上市[4]，現被國家藥品監(jiān)督管理局（National Medical Products Administration，NMPA）批準用于4 歲及以上癲癇患者部分性發(fā)作的聯合治療。吡侖帕奈于2012 年在美國上市，現被美國FDA批準用于治療4歲及以上患者的部分性癲癇發(fā)作；該藥于2021 年9 月在我國上市[5]，現被NMPA 批準用于成人、青少年和4歲及以上兒童的部分性癲癇發(fā)作。

研究指出，不同抗癲癇藥的藥動學特征各有不同，且即使相同劑量的同種抗癲癇藥在不同患者體內的血漿濃度也存在較大差異，因此治療藥物監(jiān)測（therapeutic drug monitoring，TDM）在癲癇個體化治療中具有重要意義[6]。液相色譜-串聯質譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術結合了液相色譜良好的分離性能和串聯質譜高靈敏、高特異性的檢測優(yōu)勢，已成為生物樣本分析實驗室的標準配置。考慮到目前關于拉考沙胺、吡侖帕奈等第三代抗癲癇藥的TDM臨床證據和有效濃度范圍研究相對不足，同時結合醫(yī)療機構臨床研究和個體化治療的需要，本研究擬開發(fā)同時測定拉考沙胺和吡侖帕奈血漿藥物濃度的LCMS/MS法，并應用于臨床樣本檢測，旨在為個體化用藥提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用的主要儀器有Qtrap 5500 型質譜儀（上海愛博才思分析儀器貿易有限公司）、LC-20AD 型高效液相色譜儀（日本Shimadzu 公司）、MS105DU 型半微量分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）、Purelab Felx 3型超純水機（英國Elga公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

拉考沙胺片（國藥準字H20223128，批號23030010，規(guī)格50 mg）由山東百諾醫(yī)藥股份有限公司生產；吡侖帕奈片（國藥準字HJ20210062，批號220185，規(guī)格2 mg）由日本Eisai Co.，Ltd.生產；拉考沙胺對照品（批號171323-202101，純度99.7%）購自中國食品藥品檢定研究院；吡侖帕奈對照品（批號C12625539，純度98%）購自上海麥克林生化科技有限公司；氯氮平對照品（內標，批號A1805046，純度96%）購自上海阿拉丁試劑有限公司；甲酸銨、甲醇、乙腈均為色譜純，水為超純水。

1.3 空白血漿

健康受試者空白血漿由我院Ⅰ期臨床試驗研究中心提供。

2 方法和結果

2.1 色譜條件

以Welch Ultimate XB-C18（50 mm×2.1 mm，5.0 μm）為色譜柱，以10 mmol/L甲酸銨溶液為流動相A、甲醇-乙腈-異丙醇（0.2%甲酸）混合溶液（7∶1.5∶1.5，V/V/V）為流動相B 進行梯度洗脫（0～0.2 min，20%B；0.2～1.3 min，20%B→88%B；1.3～1.8 min，88%B→98%B；1.8～2.4 min，98%B；2.4～2.5 min，98%B→20%B；2.5～3.5 min，20%B）；流速為0.4 mL/min；柱溫為40 ℃；自動進樣器溫度為4 ℃；進樣量為5 μL。

2.2 質譜條件

采用電噴霧離子源以多反應監(jiān)測模式（multireaction monitoring，MRM）進行正離子掃描；離子源電壓為4.5 kV，離子源溫度為500 ℃；霧化氣壓力為276 kPa，輔助氣壓力為276 kPa，氣簾氣壓力為69 kPa，碰撞氣壓力為41 kPa。各待測成分和內標的質譜參數見表1。

表1 各待測成分和內標的質譜參數

2.3 標準溶液、質控溶液和內標溶液的配制

分別精密稱取拉考沙胺、吡侖帕奈對照品12.7、13.3 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL 容量瓶中，得質量濃度分別為1.27、1.33 mg/mL 的單一對照品儲備液，于—80 ℃下保存。取上述單一儲備液適量，混合，用甲醇稀釋，得拉考沙胺質量濃度依次為50、40、25、12.5、5、2、1、0.5 μg/mL，吡侖帕奈質量濃度依次為1 500、1 200、750、375、150、60、30、15 ng/mL 的混合標準溶液。參照上述方法，配制拉考沙胺質量濃度分別為1.5、10、37.5 μg/mL，吡侖帕奈質量濃度分別為45、300、1 125 ng/mL的低、中、高質量濃度質控溶液。

精密稱取內標對照品15.1 mg，用甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶中，得質量濃度為1.51 mg/mL的內標儲備液，于—80 ℃下保存。取上述內標儲備液適量，用甲醇稀釋，得質量濃度為10 μg/mL的內標工作液。

2.4 患者血漿樣品的采集及前處理

待患者體內血藥濃度達穩(wěn)態(tài)后，于下次給藥前30 min 抽取其靜脈血1～2 mL，置于乙二胺四乙酸抗凝采血管中，于4 ℃下以2 000 r/min 離心10 min，取上層血漿，即得待測血漿樣品。取上述待測血漿樣品40 μL，置于1.5 mL離心管中，加入內標工作液20 μL，以乙腈740 μL 沉淀蛋白，渦旋混勻1 min，于4 ℃下以12 000 r/min離心10 min；取上清液50 μL 至另一1.5 mL 離心管中，加入乙腈-水（20∶80，V/V）950 μL稀釋，渦旋混勻后進樣分析。

2.5 分析方法的驗證

依據2020年版《中國藥典》（四部）“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”進行方法學驗證[7]。

2.5.1 專屬性試驗

取6 份不同來源的健康受試者空白血漿，以等體積乙腈代替內標工作液，其余按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析。取健康受試者空白血漿40 μL 至1.5 mL 離心管中，加入內標工作液20 μL 和拉考沙胺、吡侖帕奈混合標準溶液（質量濃度分別為0.5 μg/mL、15 ng/mL）40 μL，以乙腈700 μL沉淀蛋白后，其余按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析。取患者（編號1、6）血漿樣品，按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析。結果（圖1）顯示，拉考沙胺、吡侖帕奈和內標的保留時間分別約為1.8、2.4、2.2 min，其色譜峰峰形和分離度均良好，血漿中的內源性物質對各待測成分的檢測均無干擾。

圖1 空白血漿、空白血漿+混合標準溶液和患者血漿樣品的典型色譜圖

2.5.2 標準曲線繪制與定量下限考察

取健康受試者空白血漿40 μL至1.5 mL離心管中，加入內標工作液20 μL和“2.3”項下拉考沙胺、吡侖帕奈不同質量濃度的混合標準溶液40 μL，以乙腈700 μL沉淀蛋白后，其余按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積。分別以拉考沙胺、吡侖帕奈與內標的峰面積比值為縱坐標（y1、y2），上述待測成分的質量濃度為橫坐標（x1、x2），采用加權最小二乘法（ω＝1/x2）進行線性回歸，得回歸方程分別為y1＝0.319 77x1+0.043 52（r＝0.996 9）、y2＝0.001 17x2+0.002 19（r＝0.999 1），檢測質量濃度的線性范圍分別為0.001 25～0.125 μg/mL、0.037 5～3.75 ng/mL，定量下限分別為0.001 25 μg/mL、0.037 5 ng/mL。

2.5.3 精密度與準確度試驗

取健康受試者空白血漿40 μL，按“2.5.2”項下方法制備拉考沙胺、吡侖帕奈的定量下限、低、中、高質量濃度（拉考沙胺：0.001 25、0.003 75、0.025、0.093 75 μg/mL；吡侖帕奈：0.037 5、0.112 5、0.75、2.812 5 ng/mL，下同）的質控血漿樣品，按“2.4”項下方法處理（每質量濃度平行6份），再按“2.1”“2.2”項下條件，連續(xù)3 d完成3次檢測，考察批內、批間精密度（以變異系數表示）和準確度（以標示值為參照）。結果顯示，定量下限和低、中、高質量濃度質控血漿樣品的批內、批間變異系數為1.0%～6.9%（n＝6或n＝3），準確度均值為標示值的87.3%～110.9%（n＝6 或n＝3），符合“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[7]。

2.5.4 提取回收率與基質效應試驗

取“2.3”項下低、中、高質量濃度的質控溶液，按“2.5.2”項下方法制備低、中、高質量濃度的質控血漿樣品（每質量濃度平行6 份），按“2.4”項下方法處理，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄各待測成分與內標的峰面積比值（A1）。取6份不同來源的健康受試者空白血漿，按“2.4”項下方法處理（不加內標）后，取上清液，加入低、中、高質量濃度的質控溶液和內標工作液，使最終質量濃度與低、中、高質量濃度質控血漿樣品對應（每質量濃度平行6份），按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄各待測成分與內標的峰面積比值（A2）。取乙腈740 μL，加入低、中、高質量濃度質控溶液40 μL 和內標工作液20 μL，渦旋后取50 μL，用乙腈-水（20∶80，V/V）950 μL稀釋（每質量濃度平行6份），按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄各待測成分與內標的峰面積比值（A3）。A1/A2為提取回收率，A2/A3為內標歸一化的基質效應。結果顯示，拉考沙胺、吡侖帕奈的平均提取回收率分別為99.7%～100.9%、98.6%～99.8%（RSD 均小于3%，n＝6），其內標歸一化的基質效應分別為96.4%～99.5%、95.7%～99.0%（RSD 均小于3%，n＝6），符合“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[7]。

2.5.5 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下單一對照品儲備液，考察其—80 ℃下放置90 d 的穩(wěn)定性；取“2.3”項下低、高質量濃度的質控溶液，按“2.5.2”項下方法制備低、高質量濃度的質控血漿樣品（每質量濃度平行3份），考察其處理前常溫放置4 h、4 ℃下放置24 h、凍融（—80 ℃～室溫）3次、—80 ℃下放置30 d 和處理后進樣器中放置24 h 的穩(wěn)定性。結果顯示，各樣品實測質量濃度的平均值與標示值的偏差均在±15%內，符合“生物樣品定量分析方法驗證指導原則”的要求[7]。

2.6 臨床應用

本研究共納入患者10 例。納入標準包括：（1）年齡18～60歲；（2）臨床確診癲癇；（3）服用過拉考沙胺和/或吡侖帕奈；（4）連續(xù)規(guī)律服用抗癲癇藥并達穩(wěn)態(tài)。排除標準包括：（1）采血困難者；（2）研究人員認為其他原因所致的不適合臨床試驗者。本研究方案通過華中科技大學同濟醫(yī)學院附屬同濟醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準（倫理批件號TJ-IRB20220833），所有患者均簽署知情同意書。

10 例癲癇患者口服拉考沙胺片或吡侖帕奈片恒定劑量超過1個月（已達穩(wěn)態(tài)），于服藥前30 min采集靜脈血1～2 mL，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進樣分析，記錄峰面積并代入隨行標準曲線計算其血漿樣品中拉考沙胺或吡侖帕奈的質量濃度，再通過樣品處理過程中的稀釋倍數換算得谷濃度。結果（表2）顯示，1～5 號患者體內拉考沙胺的谷濃度為5.3～12.2 μg/mL，6～10 號患者體內吡侖帕奈的谷濃度為208～510 ng/mL。

表2 癲癇患者基本情況及藥物谷濃度測定結果

3 討論

本研究的樣品前處理選擇了簡單、快速的蛋白沉淀法，與甲醇相比，使用乙腈作為蛋白沉淀劑能夠獲得更好的色譜峰峰形。在內標的選擇上，筆者前期比較了幾種常用的內標物質，由于氯氮平價廉易得，且保留時間與吡侖帕奈、拉考沙胺接近，故最終選擇了氯氮平作為內標。在色譜柱的選擇上，筆者前期比較了Welch Ultimate XB-C18（50 mm×2.1 mm，5.0 μm）、Welch Xtimate C18（50 mm×2.1 mm，5.0 μm）和Phenomenex Synergi Fusion-RP（50 mm×2.0 mm，4.0 μm）等市售C18色譜柱的分離效果，結果顯示，以Welch Ultimate XB-C18（50 mm×2.1 mm，5.0 μm）為色譜柱時，待測成分的色譜峰峰形好、峰寬窄，且該色譜柱較進口色譜柱的成本更低，故最終選擇Welch Ultimate XB-C18。在流動相的選擇上，筆者前期考察了多種流動相系統，包括以10 mmol/L甲酸銨溶液為水相，以乙腈、甲醇為有機相，以甲酸、乙酸、甲酸銨、乙酸銨為改性劑，最終確定以甲醇-乙腈-異丙醇（0.2%甲酸）混合溶液（7∶1.5∶1.5，V/V/V）為有機相，并確定了總時間為3.5 min的梯度洗脫條件。

經查詢，在現有方法的檢測時間方面，拉考沙胺的最快檢測時間為2.2 min[8]，吡侖帕奈的最快檢測時間為2 min[9]，但上述方法均采用了價格昂貴的同位素內標；在定量范圍方面，雖有方法的拉考沙胺定量下限為0.005～0.02 μg/mL，但上述方法適用于大鼠、癲癇患者或健康受試者拉考沙胺單次給藥后的藥動學研究[8，10—11]。而本方法立足于臨床癲癇患者的TDM，依照《神經精神藥理學治療藥物監(jiān)測共識指南：2017版》推薦的拉考沙胺治療濃度參考范圍（1～10 μg/mL）和吡侖帕奈治療濃度參考范圍（180～980 ng/mL）進行定量范圍設計[6]。同時，本方法采用了價格低廉的氯氮平作為內標，定量方法經專屬性、線性關系、精密度、準確度、回收率、基質效應和穩(wěn)定性等嚴格驗證，能在3.5 min內同時測定人血漿中拉考沙胺和吡侖帕奈的質量濃度，可滿足臨床高通量檢測的需求。

本方法經驗證后成功用于10 例癲癇患者的血漿藥物濃度檢測，結果顯示，雖然大部分患者的藥物谷濃度在治療濃度參考范圍內，但仍有部分患者超過治療濃度范圍上限，可能與拉考沙胺在不同個體內的藥動學差異有關。該方法后續(xù)將用于我院更多臨床樣本的檢測，為拉考沙胺和吡侖帕奈的個體化治療提供參考。