周飄，湯德元，曾智勇，陳旭，袁盛林，廖正波，毛茵茗，何松

（貴州大學動物科學學院，貴州 貴陽 550025）

最近幾年來葡萄球菌感染現(xiàn)象急劇升高引起人們的廣泛關注，自然環(huán)境中極為廣泛地分布著葡萄球菌，細菌能透過多個途徑傳染，裂開、受損皮膚，黏膜是主要的入侵途徑。嚴重時可造成菌血癥、敗血癥。在葡萄球菌屬中，金黃色葡萄球菌是一種最主要的病原體，它容易引起血管內(nèi)感染、壞死性肺炎、心內(nèi)膜感染等各內(nèi)臟器官的嚴重感染。而此例長頸鹿感染金黃色葡萄球菌后表現(xiàn)的癥狀不明顯，出現(xiàn)突發(fā)性死亡。

長頸鹿：一種非洲的反芻偶蹄動物，拉丁語的意思是“身上有豹子斑點的駱駝”。它是目前世界上最大的陸生動物，生活在非洲熱帶、亞熱帶稀樹大草地上。貴州野生動物園內(nèi)，一只長頸鹿在2022 年5 月中旬突然死亡，根據(jù)其臨床表現(xiàn)、病理組織學的改變，進行了實驗室診斷，明確長頸鹿死因可為長頸鹿的疾病預防和以后的繁殖提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

貴州省貴陽市扎佐野生動物園病死長頸鹿的肺、心、肝、腸道和腎臟等組織。

1.2 剖檢

對病死長頸鹿病理解剖，觀察肺、心、肝、腸道、胰腺、腎和其他組織的病理變化。

1.3 細菌分離純化及鏡檢

利用超凈臺，使用無菌接種環(huán)于病死長頸鹿的心、肝、肺、腸道、胰腺和腎臟等處取樣，樣品在TSA 固態(tài)培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司）上做“Z”字劃線培養(yǎng)，然后在37℃下?lián)u床，24 小時后把TSA 固態(tài)培養(yǎng)基中的單菌落移入FTG 固態(tài)培養(yǎng)基（可從廣東環(huán)凱微生物科技有限公司購買），把培養(yǎng)基放入37℃的水浴搖床中，在搖床上過夜，并每24 小時對其進行檢測，觀察并記錄金黃色葡萄球菌生長變化情況，之后吸取細菌菌液涂片，使用酒精燈外焰干燥固定，革蘭氏染色法染色鏡檢。

1.4 細菌培養(yǎng)及染色

使用無菌接種環(huán)采集肝、肺、胰腺、腎進行需氧和厭氧的血平板和LB 培養(yǎng)基培養(yǎng)24～48小時，可觀察到大量菌落生長，使用革蘭氏染色法對單菌落染色，觀察并記錄結(jié)果。

1.5 細菌分子生物學鑒定

利用超凈工作臺，參考說明書，使用細菌基因DNA 萃取試劑盒（可從北京天根生化科技有限公司購買），提出一種菌液DNA，可用于16S rDNA PCR 擴增的模板，依據(jù)相關參考文獻合成16S rDNA 基因序列引物。16S rDNA 引物27F:5′-3′AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R: 5′-3′GGTTACCTTGTTACGACTT，擴增的基因片段大約是1 500 bp。采用以下PCR 反應體系擴增16S rDNA 基因的目的片段，如下：分別為1 微升上游引物和1 微升下游引物，2 微升細菌DNA，21 微升mix 合成完整的整個25 微升體系。PCR 預變性反應溫度：98℃，時間：10 分鐘；98℃變性，時間：30秒；50℃退火，時間：30 秒；72℃延伸，時間：1 分鐘；完成35 個循環(huán)；在72℃下，最后再延伸10 分鐘。將PCR 產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，按照說明書上的步驟，用膠回收工具將PCR 產(chǎn)物中的目標條帶提取出來，并送往擎科生物進行序列測定。取5微升膠回收產(chǎn)物，經(jīng)1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，對提取的產(chǎn)物進行了初步的鑒定，并在-20℃冰箱保存。

圖1 血平板厭氧培養(yǎng)結(jié)果

圖2 LB培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)果

1.6 細菌的生化特性鑒定

參考細菌的生化鑒定管說明書按步驟操作（購買方式-青島海博生物技術有限公司），利用超凈工作臺，將經(jīng)過篩選和提純的細菌溶液接種在生化鑒定試管上，進行測定，分別有葡萄糖、麥芽糖、乳糖、蔗糖、蔗糖、木糖、蔗糖、山梨醇、鼠李糖、丙二酸鹽、肌醇、西蒙氏枸櫞酸鹽、尿素、β-半乳糖苷(ONPG)、七葉苷、水楊素、葡萄糖磷酸鹽胨水、鳥氨酸脫羧酶、葡萄糖銨、葡萄糖酸鹽、賴氨酸脫羧酶、綿子糖、苯丙氨酸、明膠、硫化氫、硝酸鹽、氰化鉀、半乳糖生長試驗管等，將其放置在37℃的培養(yǎng)箱中，24 小時后，對其進行觀察并將其結(jié)果記錄下來。

1.7 藥敏試驗

在TSA 平板上均勻涂覆分離純化的金葡菌，選擇一系列藥敏紙片：麥迪霉素、環(huán)丙沙星、萬古霉素、利福平、新霉素、大觀霉素、頭孢氨芐、林可霉素、阿莫西林、新生霉素、青霉素G、恩諾沙星、呋喃唑酮、卡那霉素、四環(huán)素、頭孢他啶、復方新諾明等藥物（購買方式--杭州微生物試劑有限公司），將藥物敏感紙附著在固態(tài)培養(yǎng)基上，并標注出藥物敏感的種類，具體的操作方法按照說明書進行，將含有藥物敏感紙片的培養(yǎng)基放入37℃的培養(yǎng)箱中進行無氧培養(yǎng)，24～48 小時后進行觀察。

2 結(jié)果

根據(jù)臨床癥狀及實驗室診斷結(jié)果表明，該長頸鹿感染金黃色葡萄球菌，癥狀疑似金黃色葡萄球菌產(chǎn)生的TSST （中毒性休克綜合征毒素）導致長頸鹿中毒性休克綜合征，該病毒因子可通過增加內(nèi)毒素的敏感性，引起心血管絮亂而休克死亡。

2.1 剖檢結(jié)果

病死長頸鹿皮下無出血點，胃膜正常，腸系膜無出血點，腹腔無積液，腸端無脹氣，脾臟無病變，肺部瘀血并伴出血點、出現(xiàn)間質(zhì)性水腫和肺泡性水腫，心臟存有心包積液，由于病鹿長期臥地不起，關節(jié)腫大，觸摸四肢有波動感，關節(jié)液增加，呈化膿性關節(jié)炎。

2.2 細菌形態(tài)觀察

培養(yǎng)24～48 小時后，LB 培養(yǎng)基大量菌落生長，用革蘭氏染色法對分離和提純的細菌進行染色，可見革蘭氏陽性菌呈球狀（見圖3），直徑約1微米，多個球菌不規(guī)則地堆在一起，形似葡萄串，初步鑒定為金黃色葡萄球菌。

圖3 菌落鏡檢染色結(jié)果

2.3 細菌分子生物學鑒定結(jié)果

以純化細菌基因組為模板，用16S rDNA 特異性引物對產(chǎn)物進行擴增后利用1.5%瓊脂糖凝膠電泳方法，得到大約1500 bp 的目標條帶（圖4），和目標片段的序列長度大致相同。將PCR 得到的產(chǎn)物進行測序后于NCBI 中，用BLAST 進行比較分析，測序得到的結(jié)果表明：此序列與GenBank 中的金黃色葡萄球菌16S DNA 基因序列同源性高達100% ，證實其為金黃色葡萄球菌。

圖4 PCR電泳結(jié)果

2.4 生化試驗結(jié)果

其結(jié)果是：該菌株對蔗糖、葡萄糖等反應呈陽性, 對明膠、棉子糖等反應呈陰性（表1）。

表1 生化試驗結(jié)果

2.5 藥敏試驗結(jié)果

藥敏結(jié)果表明：環(huán)丙沙星、麥迪霉素、利福平、萬古霉素抗菌區(qū)直徑普遍大于20 毫米（表2），說明上述藥物對金葡菌有很好的抑菌效果。

表2 藥敏試驗結(jié)果

3 討論

采用細菌分離鑒定，生化檢測，PCR 技術及藥物敏感性試驗對該病例進行了研究，分離純化得到一株金黃色葡萄球菌。葡萄球菌屬在自然界中分布廣泛，人和動物的帶菌率很高，污水、土壤、空氣、塵埃都有葡萄球菌存在，而且，這種細菌對環(huán)境沒有任何特殊的要求，很難清除。葡萄球菌屬共有28 個種，有些種能對人畜造成嚴重感染，是一種能引起食物傳播疾病的動物和人的共患病原。葡萄球菌共有兩種分型，分別為生物學分型和表型標記分型。金葡菌在葡萄球菌屬中是一種重要的致病菌，金葡菌引起的感染主要是由于其含有血漿凝固酶。通過該病例的臨床癥狀、解剖病理學改變及實驗室病原菌的分離培養(yǎng)，確診長頸鹿為金黃色葡萄球菌感染所致。因為這種菌株對β-內(nèi)酰胺類和頭孢類的藥物有廣泛的抗性，對氨基糖苷類的藥物有中等的敏感，也有部分的耐藥，因此，在治療時，應盡可能的少用這兩種藥物。

金黃色葡萄球菌是一種非常常見的人類致病菌，可以引起皮膚、軟組織的感染，以及致命性肺炎、骨髓炎、菌血癥、心內(nèi)膜炎等。另外，按照對抗生素藥物敏感程度，金葡菌可分為耐甲氧西林金葡菌（MSSA）與耐甲氧西林金葡菌（MRSA）兩種。近年來，隨著細菌的進化，抗生素的濫用，金葡菌的耐藥性一直在增強，全球范圍內(nèi)，MRSA感染率上升，MRSA 抗感染臨床治療難度加大。

本次野生動物園梅花鹿發(fā)生金黃色葡萄球菌感染，主要是該長頸鹿感染金黃色葡萄球菌。長頸鹿圈舍沒有定期進行殺菌消毒，導致長頸鹿自身免疫力有所下降，同時又食入了環(huán)境中污染的金黃色葡萄球菌，在其體內(nèi)從而導致發(fā)病。防制措施主要為立即將病死長頸鹿妥善處理，打掃圈舍衛(wèi)生，采取相應應急措施采取及時，長頸鹿群中并未再發(fā)生病例。