張莉，王佳，豆思遠(yuǎn)，高軍軍，李勇生

（甘肅省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，甘肅 蘭州 730046）

仔豬水腫病是斷奶仔豬一種常發(fā)性細(xì)菌性疾病，近年來發(fā)病率逐年增高，發(fā)病率在10%～20%，死亡率極高，嚴(yán)重影響了經(jīng)濟(jì)效益。產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌（STEC）是引起豬水腫主要病原菌，其中以O(shè) 抗原群O139 最為常見，由于血清型眾多、致病因子復(fù)雜多變，導(dǎo)致缺乏有效治療藥物，疫苗研發(fā)也進(jìn)展緩慢。本實(shí)驗(yàn)以大腸桿菌O139 誘導(dǎo)小鼠細(xì)菌性腹瀉模型的構(gòu)建，探索大腸桿菌O139 在感染小鼠體內(nèi)的動(dòng)態(tài)分布，和各器官組織的病理學(xué)變化，為研究該菌的感染機(jī)制、建立病理學(xué)、病原學(xué)等診斷方法奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和菌種

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選用18～22 克，6～8 周齡C57BL/6小鼠280 只，雌雄各半。小鼠自由采食和飲水，飼養(yǎng)于蘭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF 屏障環(huán)境內(nèi)，飼喂SPF 鼠料購于北京科澳協(xié)力飼料有限公司；飲水經(jīng)杭州潔達(dá)凈化科技有限公司生產(chǎn)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飲用水處理器處理；所用墊料高壓滅菌，每周更換2 次，換完墊料后用84 消毒液等對飼養(yǎng)室進(jìn)行消毒，每周紫外線照射1 次。

C57BL/6 小鼠臟器系數(shù)

大腸桿菌(E.coli:O139)由甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 菌種活化及濃度測定

實(shí)驗(yàn)前將保存的E.coli:O139 接種于普通瓊脂斜面培養(yǎng)基上活化，然后接種于無菌新鮮肉湯2 毫升中，37 ℃24 小時(shí)后，取菌液2 毫升擴(kuò)培于無菌普通營養(yǎng)肉湯20 毫升中，37 ℃18 小時(shí)后，經(jīng)活菌計(jì)數(shù)和比濁法測定，使用時(shí)稀釋成不同濃度，計(jì)數(shù)后距感染時(shí)間不宜超過2 小時(shí)。

1.3 感染途徑和劑量確定

經(jīng)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定感染途徑和感染劑量。禁食不禁水12 小時(shí)后，小鼠隨機(jī)分5 組，每組12 只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。第1 組小鼠腹腔注射0.2毫升約1.5×108CFU；第2 組灌胃接種0.2 毫升菌液約1.5×108CFU；第3 組鼻腔滴注濃縮菌液1～2 滴約1.5×108CFU；第4 組尾靜脈注射0.2 毫升菌液約1.5×108CFU；第5 組設(shè)對照，腹腔注射0.2 毫升生理鹽水。定期觀察小鼠精神狀況、食欲、行為、糞便等臨床癥狀，剖解自然死亡和脫頸致死的小鼠從組織臟器中分離該菌。

在確定感染途徑后，禁食不禁水12 小時(shí)后，小鼠隨機(jī)分組，每組12 只，雌雄各半，分籠飼養(yǎng)。距籠底2～3 厘米處放置6 毫米×6 毫米鋁網(wǎng)，并在籠底層放置102 中速定性濾紙，每小時(shí)換一次濾紙。按每10 克體重0.2 毫升給菌，采用相同容積不同濃度感染。

1.3.1 最小致死量和半數(shù)致死量(LD50)的確定

按照1.1 倍梯度稀釋，設(shè)計(jì)劑量分組為1.79×108CFU/毫升、1.63×108CFU/毫升、1.48×108CFU/毫升、1.35×108CFU/毫升、1.23×108CFU/毫升、1.12×108CFU/毫升、1.02×108CFU/毫升、0.93×108CFU/毫升、0.85×108CFU/毫升，連續(xù)觀察10 小時(shí)。采用加權(quán)回歸法計(jì)算半數(shù)致死量(LD50)和最小致死量。

1.3.2 半數(shù)感染量和最小感染量確定

根據(jù)半數(shù)致死量(LD50)和最小致死量，以組距1.1 倍設(shè)計(jì)劑量分組，選擇實(shí)驗(yàn)小鼠生命安全的的最低菌液濃度即最小感染量為試驗(yàn)注射濃度。

1.4 腹瀉模型的復(fù)制

選擇實(shí)驗(yàn)小鼠生命安全的的最低菌液濃度即最小感染量為試驗(yàn)注射濃度，選取20 只小鼠復(fù)制腹瀉模型，并設(shè)立健康對照組。連續(xù)觀察5天，觀察感染后小鼠臨床癥狀、體重變化、血液生化指標(biāo)、病理變化、臟器重量、臟器系數(shù)等。記錄總便數(shù)、稀便數(shù)、腹瀉指數(shù)（DI）和稀便級。分別稱取模型組和對照組小鼠體重后，從眶后靜脈竇采血分離血清，檢測ALT（谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、AST（谷草轉(zhuǎn)氨酶）、AST/ALT （谷草轉(zhuǎn)氨酶/谷丙轉(zhuǎn)氨酶）、TP（總蛋白）、ALB（白蛋白）、GLO（球蛋白）、A/G（白蛋白／球蛋白）、ALP（堿性磷酸酶）、GLU（葡萄糖）、BUN（尿素）、CREA（肌酐）、BUN/CR（尿素/肌酐）、CHO（膽固醇）、TG（甘油三酯）、IBIL（間接膽紅素）等15 項(xiàng)指標(biāo)。解剖觀察病理變化，依次取出心、肝、脾、肺、腎，用濾紙吸去各臟器表面的血液后稱取濕重，計(jì)算臟器系數(shù)。并涂片鏡檢，進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)分離和生化鑒定。統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)描述以x±s 表示；品系間用單因素方差分析；兩樣本用t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同感染途徑的比較

灌胃感染組和鼻腔滴注感染組在預(yù)試中最高劑量1.5×108CFU/毫升，仍未致病，大便培養(yǎng)也未見該菌生長；尾靜脈接種在預(yù)試中臨床表現(xiàn)不顯著，大便培養(yǎng)不穩(wěn)定。腹腔注射組在所設(shè)計(jì)的劑量范圍內(nèi)呈梯度發(fā)病和死亡，大便細(xì)菌培養(yǎng)均呈陽性。結(jié)果表明，腹腔注射誘導(dǎo)動(dòng)物腹瀉模型是比較可行的方法，感染小鼠的各個(gè)臟器發(fā)生了病理變化。

2.1.1 腹腔感染途徑

在接種2 小時(shí)后，小鼠都出現(xiàn)扎堆，被毛粗亂，精神萎靡，行動(dòng)遲緩，喪失正常的跳躍、爬籠行為。部分小鼠在接種3～4 小時(shí)后表現(xiàn)出腹瀉癥狀，持續(xù)4～5 小時(shí)；6 小時(shí)后眼角出現(xiàn)粘性分泌物，9 小時(shí)后，呼吸減弱，不停抽搐；10 小時(shí)后，睫毛反應(yīng)消失，但仍不停抽搐。在接種后的4 小時(shí)出現(xiàn)小鼠死亡，18～24 小時(shí)達(dá)到死亡高峰期，72 小時(shí)后不再出現(xiàn)小鼠死亡。

剖解可見：皮下呈彌漫性出血；脾臟明顯腫大，膽囊充盈；肝臟腫大，質(zhì)地變脆；腸道內(nèi)充滿黃色液體，部分小腸腸系膜腫大。有的小鼠胸腔積液，腦部有出血點(diǎn)。剖解自然死亡和脫頸致死的小鼠，可從小鼠的心、肝和脾中分離出該菌，并且這種情形可持續(xù)3 天，5 天后心、肝中很難再分離出該菌，脾臟中仍可分離出該菌。

2.1.2 灌胃感染途徑

接種后，28～32 小時(shí)后小鼠出現(xiàn)精神萎靡，食欲減退，活動(dòng)減少，扎堆，大部分小鼠尿液顏色加深。死亡多發(fā)生在40～72 小時(shí)。剖解發(fā)現(xiàn)，死亡小鼠腹腔內(nèi)有漿液性滲出，脾臟壞死，肝臟邊緣壞死，肺臟無明顯病變，腸道內(nèi)充滿黃色液體。剖解死亡小鼠，可從小鼠的肝臟和脾臟中分離出接種菌，但5 天后肝臟和脾臟中很難分離出細(xì)菌，十二指腸中則可分離出該菌。

2.1.3 鼻腔感染途徑

接種后，小鼠出現(xiàn)一過性食欲降低，行動(dòng)減少。數(shù)小時(shí)后，采食和行動(dòng)恢復(fù)正常。未出現(xiàn)死亡，脫頸致死后，剖解可見個(gè)別小鼠脾臟腫大，其它器官組織未發(fā)生明顯病變。各內(nèi)臟器官中未分離到該菌。

2.1.4 尾靜脈感染途徑

僅有1 只小鼠死亡，剖解出現(xiàn)敗血癥狀。同組其它小鼠各器官組織未發(fā)生明顯病變。從死亡小鼠的組織臟器中分離到該菌，其他小鼠各組織器官未發(fā)現(xiàn)該菌。

2.1.5 對照組

對照組小鼠無異常，正常采食、飲水，并有正常的跳躍和爬籠行為。

2.2 感染劑量的確定

2.2.1 最小致死量和半數(shù)致死量（LD50）的確定

使用加權(quán)回歸法計(jì)算半數(shù)致死量 （LD50）為0.93×108CFU/毫升。

2.2.2 半數(shù)感染量和最小感染量確定

選擇實(shí)驗(yàn)小鼠生命安全的最低菌液濃度即最小感染量為最佳試驗(yàn)注射濃度即0.58×108CFU/毫升，每10 克體重0.2 毫升腹腔注射。

2.3 腹瀉模型的復(fù)制

2.3.1 臨床癥狀

在接種30～60 分鐘后，所有小鼠均出現(xiàn)被毛粗亂，扎堆，精神沉郁，食欲減退，眼睛半瞇，行動(dòng)遲緩，喪失正常的清理、跳躍、爬籠行為。3～4小時(shí)后開始出現(xiàn)腹瀉癥狀，持續(xù)4～5 小時(shí)，四肢和尾根處有糞便粘連，食欲廢絕；6 小時(shí)后眼角出現(xiàn)分泌物，初為無色稀薄粘性分泌物，后逐漸轉(zhuǎn)為白色粘稠分泌物，在18～24 小時(shí)白色粘稠分泌物可糊住眼睛四周，小鼠眨眼反應(yīng)或?qū)ν饨鐟?yīng)激反應(yīng)遲緩甚至消失；9 小時(shí)后，呼吸減弱，不停抽搐；10 小時(shí)后，睫毛反應(yīng)消失，但仍不停抽搐，有個(gè)別小鼠出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，四肢呈游走狀，有的小鼠不停向一側(cè)轉(zhuǎn)圈。個(gè)別小鼠出現(xiàn)漸進(jìn)性消瘦，被毛直立，毛色光澤降低。10～16 小時(shí)排便量和尿量減少，甚至幾乎無排泄物。小鼠牙關(guān)緊閉，身體重量明顯減輕，眼角有大量粘稠分泌物，尾巴和四肢末梢發(fā)紺，肛門周圍也沾有排泄物和墊料。

2.3.2 剖解觀察

剖解后，皮下呈彌漫性出血；肝臟腫大，質(zhì)地變脆，肝臟表面有點(diǎn)狀出血點(diǎn)；膽囊充盈；脾臟腫大；腸道內(nèi)充滿黃色液體，腸粘膜潮紅、腫脹，粘膜表面有大量的炎性滲出物。滲出物因病程發(fā)展有所不同，初期滲出物多呈水樣、雞蛋清樣的漿液狀，后因黏膜上皮細(xì)胞中的杯狀細(xì)胞分泌粘液增多從而導(dǎo)致滲出物粘稠，最終由于炎性細(xì)胞的侵潤和黏膜上皮細(xì)胞剝落導(dǎo)致滲出物變?yōu)槟撘簶?。腸壁淋巴小結(jié)呈堤壩樣隆起，嚴(yán)重時(shí)腸道粘膜面呈糜爛樣。

2.3.4 臟器重量和臟器系數(shù)變化（見下表）

測定小鼠(心、肝、脾、肺、腎)臟器系數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，模型組與對照組小鼠臟器系數(shù)相比差異顯著（P＜0.05），同時(shí)模型組各臟器相比對照組有明顯眼觀變化。結(jié)果表明，各臟器呈現(xiàn)不同程度的細(xì)胞腫脹、水腫、充血、出血、增生、肥大、腫大等病理變化時(shí)，導(dǎo)致該臟器的重量增加，各臟器未見脫水、萎縮、萎陷、壞死和腐離等病理變化，食欲下降或消化功能減弱等引起體重增長減慢和伴隨器官系數(shù)的相對增大。

2.3.5 血清生理指標(biāo)

血液生理指標(biāo)常作為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中的測評指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)中ALT、AST、AST/ALT、TP、ALB、GLO、A/G、ALP 都反映肝功能受損情況的指標(biāo)。ALT 和AST 的升高反映肝細(xì)胞受損程度嚴(yán)重；TP 下降，ALB、GLO、A/G 減少表明肝臟炎癥嚴(yán)重；ALP 增加表明肝臟有炎癥或肝內(nèi)膽汁淤積導(dǎo)致ALP 活力增加；BUN、CREA、BUN/CR 是衡量腎功能的指標(biāo)。BUN 和CREA 的數(shù)值增加代表腎功能發(fā)生障礙；GLU 是血液中血糖濃度的一項(xiàng)指標(biāo)，GLU 降低；CHO 和TG 是衡量血液中血脂水平的指標(biāo)，CHO 和TG 升高，同對照組相比，上述相應(yīng)指標(biāo)差異顯著（P＜0.05），表明對小鼠血液生理指標(biāo)產(chǎn)生影響。

2.3.6 病理組織學(xué)變化

小鼠的心、肝、脾、肺、腎、腸組織在顯微鏡下均見異常。小鼠心肌纖維橫紋可見，間質(zhì)無水腫和炎性細(xì)胞浸潤，但呈現(xiàn)出血現(xiàn)象；肝臟肝小葉結(jié)構(gòu)不完整，肝細(xì)胞廣泛變性、水腫，肝臟充血、出血，表層部分肝細(xì)胞變性、壞死，可見廣泛性壞死灶(見圖A)；脾臟充血、出血，白髓受到紅細(xì)胞擠壓，發(fā)育不良，淋巴小結(jié)萎縮，白髓、紅髓及邊緣區(qū)結(jié)構(gòu)不太清晰(見圖B)；腎臟表層腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎臟充血、出血，腎小囊腔內(nèi)有滲出物，腎曲小管上皮腫脹(圖C)；小腸粘膜組織學(xué)形態(tài)異常，固有層見炎性反應(yīng)，腸粘膜腫脹，導(dǎo)致膽管開口處變得狹窄或閉鎖，膽汁排入腸管的量減少或缺乏，導(dǎo)致腸內(nèi)細(xì)菌繁殖較快，引起病變，十二指腸腸絨毛脫落，溶解，腸道固有層有大量淋巴細(xì)胞侵潤(見圖D)；空腸的微絨毛脫落，局部腸絨毛斷裂，腸管充血，出血(見圖E)；回腸腸絨毛嚴(yán)重脫落，固有層嚴(yán)重充血(見圖F)；回腸HE×400：固有層嚴(yán)重充血，淋巴小結(jié)腫大(見圖G)；盲腸腸絨毛脫落嚴(yán)重，淋巴小結(jié)增大，固有層淋巴細(xì)胞增生(見圖H)；結(jié)腸腸絨毛幾乎全部脫落(見圖I)。

3 討論

A 肝臟HE×100：肝細(xì)胞廣泛變性、水腫，肝臟充血、出血，表層部分肝細(xì)胞變性、壞死，可見廣泛性壞死灶；B 脾臟HE×100：充血、出血，白髓受到紅細(xì)胞擠壓，發(fā)育不良，淋巴小結(jié)萎縮；C 腎臟HE×100：表層腎小管上皮細(xì)胞變性壞死，腎臟充血、出血；D 十二指腸HE×100：腸絨毛脫落，溶解，腸道固有層有大量淋巴細(xì)胞侵潤；E 空腸HE×100：微絨毛脫落，局部腸絨毛斷裂，腸管充血，出血；F 回腸HE×100：腸絨毛嚴(yán)重脫落，固有層嚴(yán)重充血；G.回腸HE×400：固有層嚴(yán)重充血，淋巴小結(jié)腫大；H 盲腸HE×100：腸絨毛脫落嚴(yán)重，淋巴小結(jié)增大，固有層淋巴細(xì)胞增生；I 結(jié)腸HE×100：腸絨毛幾乎全部脫落。

3.1 不同感染途徑的比較

鼻腔接種后，小鼠未出現(xiàn)臨床癥狀，組織臟器也未分離該菌，而且血清學(xué)檢測也未發(fā)現(xiàn)抗體，說明小鼠對鼻腔接種不易感。這與文獻(xiàn)報(bào)道的腸道菌不易通過呼吸道感染相一致。灌胃接種，要求接種劑量一定準(zhǔn)確，存在傷及食管和誤入氣管的可能性，而且接種前未對胃酸進(jìn)行預(yù)處理，這導(dǎo)致部分小鼠造模效果不理想。尾靜脈注射后，接種劑量偏小，細(xì)菌會(huì)被白細(xì)胞吞噬，小鼠不表現(xiàn)臨床癥狀；但如果接種劑量偏大，又會(huì)迅速造成小鼠死亡。腹腔注射，選擇劑量范圍相對廣泛而且易于操作。腹腔注射組在設(shè)計(jì)的劑量范圍內(nèi)呈梯度發(fā)病和死亡，死亡時(shí)間都在注射后4～72 小時(shí)內(nèi)，表現(xiàn)出急性死亡、神經(jīng)癥狀和敗血癥狀，與自然發(fā)病仔豬、犢牛、雞等臨床癥狀和病理變化相同。本研究觀察發(fā)現(xiàn)小鼠發(fā)生最后死亡的時(shí)間為接種后3 天。未死亡小鼠并不表現(xiàn)出明顯的臨床癥狀，但剖解可見脾臟腫大。在腹腔注射相同接種劑量，小鼠出現(xiàn)的神經(jīng)癥狀存在一定差異。這與文獻(xiàn)報(bào)道的腸道菌引起動(dòng)物神經(jīng)癥狀不穩(wěn)定相一致，證實(shí)本研究采用的腹腔注射0.58×108CFU/毫升，可成功構(gòu)建大腸桿菌O139 誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型。

3.2 腹瀉模型的復(fù)制

豬水腫病是STEC 產(chǎn)生的F18 菌毛和Stx-2e 毒素等引起，通過菌毛介導(dǎo)的黏附作用，定植于腸上皮細(xì)胞并產(chǎn)生毒素，主要血清型為O139，該病發(fā)病率較低，但死亡率可高達(dá)90%以上。在不同條件下O139 定居于小腸上皮細(xì)胞有時(shí)既可引起斷奶仔豬腹瀉也可引起水腫病(PWECD/ED)，但目前對于該病的防控主要側(cè)重養(yǎng)殖場的生物安全管理和預(yù)后治療上，尚無理想的疫苗，尤其是2020 年國家全面禁止，對于替抗藥物的研發(fā)迫在眉睫。但目前國內(nèi)外多數(shù)研究僅將菌毛和毒素抗原納入，缺乏有效的動(dòng)物模型也是疫苗和藥物研發(fā)的一個(gè)阻力。

本實(shí)驗(yàn)選用C57BL/6 鼠相比BALB/c 小鼠不易發(fā)生呼吸道感染及肺炎。大腸桿菌O139 誘導(dǎo)的腸粘膜充血和炎性刺激物的作用，使腸管的運(yùn)動(dòng)和分泌機(jī)能增強(qiáng)，引起腹瀉，排出水樣帶腥臭的糞便，導(dǎo)致大量水分和消化液中的鉀鈉離子或重碳酸鹽隨糞便流失，從而使機(jī)體脫水和代謝性酸中毒，使得動(dòng)物的食欲下降或消化功能減弱等引起動(dòng)物的體重增長減慢和伴隨器官系數(shù)的相對增大。大腸桿菌O139 構(gòu)建的腹瀉模型空腸、回腸段腸絨毛嚴(yán)重脫落、溶解，本研究結(jié)果與上述文獻(xiàn)報(bào)道一致。感染O139 后，該菌的F18a、F18b 菌毛和小腸上皮細(xì)胞相應(yīng)的受體結(jié)合，黏附于小腸絨毛并大量繁殖，并產(chǎn)成大量Stx2e 毒素被腸道吸收。Stx2e 作為一種血管毒素，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血管通透性發(fā)生變化，出現(xiàn)水腫，有時(shí)壓迫腦部神經(jīng)組織，臨床出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。

本試驗(yàn)成功構(gòu)建大腸桿菌O139 誘導(dǎo)小鼠腹瀉模型，研究結(jié)果為該病的診斷、預(yù)防和治療奠定了科學(xué)的理論基礎(chǔ)，并為相關(guān)藥物和疫苗研發(fā)提供了動(dòng)物模型。