2023 年7 月25 日，由河北農(nóng)業(yè)大學(xué)陳輝教授主持的河北省自然科學(xué)基金項(xiàng)目 “褪黑素通過FoxO1 信號(hào)通路調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋雞卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制”（編號(hào)：C2020204163）的驗(yàn)收材料通過河北省基金辦審核通過，完成驗(yàn)收。

隨著我國(guó)家禽業(yè)迅速發(fā)展，集約化養(yǎng)殖程度大大提高，密集養(yǎng)殖環(huán)境中存在大量刺激會(huì)造成機(jī)體與組織中的活性氧的增加，導(dǎo)致機(jī)體產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致家禽的生產(chǎn)性能下降。卵泡發(fā)育全過程都伴隨著卵巢顆粒細(xì)胞（OGC）的生長(zhǎng)，OGC 在調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育、成熟和閉鎖等過程中有重要作用。氧化應(yīng)激會(huì)造成OGC凋亡，引起家禽卵泡閉鎖而最終導(dǎo)致產(chǎn)蛋率下降，因此改善卵巢的氧化應(yīng)激，減少機(jī)體內(nèi)活性氧（ROS）水平，對(duì)于提高蛋雞生產(chǎn)性能非常重要。本項(xiàng)目基于體內(nèi)外氧化應(yīng)激模型解析了FoxO1 信號(hào)通路參與褪黑素介導(dǎo)的蛋雞卵巢顆粒細(xì)胞抗凋亡保護(hù)機(jī)制，為深入研究保護(hù)卵泡發(fā)育和延長(zhǎng)蛋雞利用周期奠定良好的理論基礎(chǔ)。主要完成內(nèi)容如下：

1 褪黑素通過抑制FoxO1 基因緩解蛋雞體內(nèi)卵巢氧化損傷研究

褪黑素具有直接清除ROS 的能力，也可以通過激活體內(nèi)其他抗氧化酶，如谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶和過氧化氫酶等，來保護(hù)生物膜和DNA 分子，提升機(jī)體抗氧化水平。此外，褪黑素在調(diào)控卵泡發(fā)育、排卵、卵母細(xì)胞成熟和黃體功能方面發(fā)揮重要作用。因此，褪黑素及其代謝產(chǎn)物作為內(nèi)源性的自由基清除劑和廣譜抗氧化劑，可以有效對(duì)抗氧化應(yīng)激引起的功能紊亂。在我們的結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，利用地塞米松處理建立體內(nèi)氧化應(yīng)激模型，外源褪黑素處理后可顯著提高了氧化應(yīng)激模型下的CAT、SOD1、GPX3 和PRDX3 等抗氧化基因的mRNA 表達(dá)，顯著提高Caspase-3、Bim 和Bax 抗凋亡基因的mRNA 表達(dá)，并顯著抑制FoxO1 基因的mRNA表達(dá)，證明了FoxO1 基因參與了褪黑素調(diào)控蛋雞卵巢氧化損傷的過程。

2 構(gòu)建顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型

正常的情況下，動(dòng)物機(jī)體內(nèi)的氧化與抗氧化系統(tǒng)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，在外界不良因素的刺激下對(duì)ROS 極為敏感，易受ROS 的攻擊而形成氧化應(yīng)激損傷。H2O2對(duì)細(xì)胞膜更具滲透性，極易在細(xì)胞間或者細(xì)胞內(nèi)擴(kuò)散，穩(wěn)定且易獲得，因此，本研究選取產(chǎn)蛋高峰期蛋雞的顆粒細(xì)胞，分別用0、12.5、25、50、100、200 微摩爾/升H2O2處理3、6、9 小時(shí)，用CCK8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖活性，并利用抗氧化標(biāo)志產(chǎn)物（丙二醛、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶）驗(yàn)證顆粒細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的建立。研究結(jié)果顯示，在50 微摩爾/升濃度H2O2刺激6 小時(shí)，與對(duì)照組相比，其相對(duì)存活率約為60%，細(xì)胞存活率顯著下降，細(xì)胞丙二醛水平顯著增加，超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性顯著降低，因此，可以以該條件來建立蛋雞OGC氧化應(yīng)激模型。

3 FoxO1 通路介導(dǎo)褪黑素調(diào)控氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋雞卵巢顆粒細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制研究

氧化應(yīng)激可以導(dǎo)致家禽ROS 大量積累，進(jìn)而引起OGC 凋亡，引起卵泡閉鎖，影響機(jī)體繁殖性能。通過H2O2處理建立體外氧化應(yīng)激模型，H2O2顯著提升了促凋亡相關(guān)基因Bim、Bax和Caspase-3 的表達(dá)量，顯著抑制了抗凋亡基因Bcl-2的表達(dá)，而M+H2O2共同處理組后Bim、Bax 和 Caspase -3的表達(dá)量顯著低于H2O2組，而Bcl-2 的表達(dá)量顯著高于H2O2組，表明褪黑素顯著緩解了H2O2帶來的對(duì)顆粒細(xì)胞的凋亡效應(yīng)。H2O2顯著提升了FoxO1 基因的表達(dá)，而M+H2O2共同處理組FoxO1 的表達(dá)量顯著低于H2O2組，表明褪黑素通過抑制FoxO1 基因的表達(dá)顯著緩解了H2O2帶來的對(duì)顆粒細(xì)胞的氧化應(yīng)激。再通過si-RNA技術(shù)和過表達(dá)載體方法建立特異性干擾FoxO1模型，發(fā)現(xiàn)抑制FoxO1（si-FoxO1）或者過表達(dá)FoxO1（過表達(dá)載體pcDNA3.1-FoxO1）后，顆粒細(xì)胞的增殖或凋亡都受到抑制或者增強(qiáng)，而抗氧化基因（SOD1、SOD2、CAT、GPX3 和PRDX3）和凋亡基因（Bim、Bax 和Caspase-3）的mRNA和蛋白的表達(dá)量也同等程度的被抑制或增強(qiáng)，但是給予褪黑素處理后緩解了氧化應(yīng)激帶來的損傷，進(jìn)一步驗(yàn)證了FoxO1 信號(hào)通路參與褪黑素抑制氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的卵巢顆粒細(xì)胞凋亡。

本項(xiàng)目最終探明50 微摩爾/升H2O2處理蛋雞卵顆粒細(xì)胞6 小時(shí)可建立氧化應(yīng)激模型；100微摩爾/升褪黑素可通過清除ROS 及強(qiáng)化SOD、CAT、GPX3、PRDX3 等抗氧化基因和蛋白表達(dá)來緩解H2O2誘導(dǎo)的OGC 的氧化應(yīng)激損傷，為我國(guó)蛋雞健康養(yǎng)殖奠定了良好的理論基礎(chǔ)。

褪黑素對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋雞卵巢顆粒細(xì)胞抗氧化相關(guān)基因的影響

褪黑對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)蛋雞卵巢顆粒細(xì)胞抗氧化基因相關(guān)蛋白的影響