郭靜潔，張引紅

1.山西傳媒學(xué)院，山西 030619；2.山西醫(yī)科大學(xué)

缺血性腦卒中是世界范圍內(nèi)引起行動(dòng)障礙和運(yùn)動(dòng)障礙的主要原因之一，通過藥物干預(yù)或器械取栓快速恢復(fù)腦血流是缺血性腦卒中的首選治療方法[1]。然而，盡管再灌注可恢復(fù)腦組織所必需的營(yíng)養(yǎng)和氧氣，但灌注區(qū)不可避免地會(huì)造成血腦屏障通透性增加及腦水腫的發(fā)生和大量細(xì)胞死亡及組織破壞，稱為腦缺血再灌注（cerebral ischemia-reperfusion，CI/R）損傷，其常引起遲發(fā)性神經(jīng)元損傷，嚴(yán)重影響病人的日?；顒?dòng)和預(yù)后，給社會(huì)和家庭帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)壓力[2]。因此，有必要進(jìn)一步探索其潛在的病理機(jī)制，研究新的干預(yù)措施。

研究認(rèn)為，CI/R 損傷和復(fù)雜的病理過程與多種不同的機(jī)制有關(guān)，包括氧化應(yīng)激、細(xì)胞內(nèi)鈣超載、炎癥和細(xì)胞凋亡等[3]。最近的證據(jù)表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是CI/R損傷進(jìn)展的關(guān)鍵決定因素[4]。在一些病理狀態(tài)下，嚴(yán)重且持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡信號(hào)通路中必需分子CAAT 區(qū)/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞凋亡，從而加劇病理過程，最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡[5]。缺血預(yù)處理作為一種有效的腦缺血保護(hù)策略，已備受學(xué)者廣泛關(guān)注。而在眾多的預(yù)防措施中，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理被認(rèn)為是一種臨床可操作的、成本較低且易于被病人接受的有效預(yù)防缺血性腦卒中的方法，被證明可有效誘導(dǎo)缺血耐受性，減輕腦損傷，從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[6]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可通過降低谷氨酸興奮性毒性、抑制神經(jīng)炎癥及細(xì)胞凋亡，改善大鼠CI/R 后的神經(jīng)功能缺損[7]。白藜蘆醇是一種多酚，在多種植物中大量表達(dá)，具有保護(hù)心臟、抗癌、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用。Lei 等[8]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇（100 mg/kg）預(yù)處理可降低CI/R 炎癥反應(yīng)、改善神經(jīng)功能缺損評(píng)分、減少大鼠腦梗死體積及腦水腫含量，提示白藜蘆醇可能是一種很有前途的神經(jīng)保護(hù)劑。逯冉冉等[9]研究發(fā)現(xiàn)，CI/R 前30 min 灌服白藜蘆醇可以縮小腦梗死體積，對(duì)CI/R 損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。然而對(duì)CI/R 大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制尚不明確；并且運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇是否對(duì)CI/R 大鼠的腦神經(jīng)損害具有更有效的保護(hù)效應(yīng)，目前尚缺乏充足的研究。因此，本研究對(duì)CI/R大鼠分別進(jìn)行4 周有氧跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)或白藜蘆醇干預(yù)以及有氧運(yùn)動(dòng)聯(lián)合白藜蘆醇干預(yù)，通過測(cè)量CI/R 大鼠腦梗死體積、腦水腫含量及缺血再灌注區(qū)神經(jīng)凋亡細(xì)胞的變化和腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白表達(dá)的變化，從分子學(xué)角度進(jìn)一步探討運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇預(yù)處理對(duì)CI/R大鼠腦損傷保護(hù)的可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

無特定病原體（SPF）級(jí)6～7 周齡（體質(zhì)量210～230 g）雄性SD 大鼠114 只，被飼養(yǎng)在標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中。適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境1 周后，將114 只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（n=22）、CI/R 模型組（n=22）、CI/R 運(yùn)動(dòng)組（n=23）、CI/R 白藜蘆醇組（n=23）、CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組（n=23）。實(shí)驗(yàn)中所有大鼠均按照《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用指南》的原則進(jìn)行。

1.2 主要試劑與儀器

原位末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記技術(shù)（TUNEL）染色試劑盒（批號(hào)：KGA7045）；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucoseregulated protein78，GRP78）一抗（批號(hào)：12G34）、CHOP 一抗（批號(hào)：B0S5476BP2307）、β-actin 一抗（批號(hào)：B2801）、HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG（批號(hào)：B0201），均購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司；白藜蘆醇購(gòu)于上海阿拉丁試劑公司（批號(hào)P109978）；酶標(biāo)儀（型號(hào)：RT-6000）購(gòu)自深圳Rayto 公司；凝膠成像儀（型號(hào)：Tanon 4600）購(gòu)自北京原平皓生物技術(shù)有限公司；電子天平（型號(hào)：FA1004）購(gòu)自上海舜宇恒科技儀器有限公司；動(dòng)物跑臺(tái)（型號(hào)：FT-200），購(gòu)自成都泰盟科技有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)預(yù)干預(yù)[10]

正式跑臺(tái)訓(xùn)練前，CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠以5～7 m/min 的速度進(jìn)行2 d、每天30 min 的適應(yīng)性訓(xùn)練。正式訓(xùn)練時(shí)，第1 周大鼠跑臺(tái)速度18 m/min（坡度為0o），每天持續(xù)運(yùn)動(dòng)35 min；第2周跑臺(tái)速度18 m/min（坡度為5o），每天持續(xù)運(yùn)動(dòng)40 min；第3 周跑臺(tái)速度18 m/min（坡度為5o），每天持續(xù)運(yùn)動(dòng)45 min；第4 周跑臺(tái)速度18 m/min（坡度為5o），每天持續(xù)運(yùn)動(dòng)50 min；每周均運(yùn)動(dòng)5 d，連續(xù)運(yùn)動(dòng)4 周。

1.3.2 白藜蘆醇給藥方法

依據(jù)藥理學(xué)方法，將白藜蘆醇充分溶于雙蒸水中制成（6 mg/mL）懸濁液，對(duì)CI/R 白藜蘆醇組及CI/R白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組進(jìn)行稱重后每天早上08:00 灌胃白藜蘆醇40 mg/kg，CI/R 模型組大鼠給予同體積的雙蒸水灌胃。連續(xù)灌胃4 周，每周7 d[11]。

1.4 CI/R 模型制備

跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)及灌服白藜蘆醇4 周后，采用大腦中動(dòng)脈（MCAO）閉塞（90 min）再灌注法（24 h）誘導(dǎo)大鼠CI/R 模型[12]。假手術(shù)組大鼠不進(jìn)行MCAO 缺血再灌注。

1.5 神經(jīng)功能評(píng)分

再灌注24 h 后對(duì)所有大鼠的神經(jīng)功能缺損進(jìn)行評(píng)估。無神經(jīng)功能缺損計(jì)0 分；提尾時(shí)大鼠不能完全伸展左前爪計(jì)1 分；大鼠行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈計(jì)2 分；行走困難，行走時(shí)向左側(cè)轉(zhuǎn)圈、傾倒計(jì)3 分；大鼠不能自發(fā)行走和/或失去意識(shí)計(jì)4 分。本研究共排除6 只大鼠，其中CI/R 模型組死亡1 只大鼠及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠死亡2 只大鼠，CI/R 模型組1 只大鼠評(píng)分為4分、CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組各有1 只大鼠神經(jīng)功能評(píng)分為0 分。

1.6 神經(jīng)細(xì)胞凋亡觀察

神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，各組隨機(jī)取5 只大鼠，常規(guī)灌注后取腦，梯度乙醇脫水、二甲苯透明后石蠟包埋，連續(xù)切片（4 μm），用于TUNEL 染色。

1.7 腦梗死體積的測(cè)量

神經(jīng)功能評(píng)分結(jié)束后，每組隨機(jī)取5 只大鼠，麻醉后立即取腦，冠狀切片用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）法染色并計(jì)算大鼠的腦梗死體積。

1.8 腦組織含水量的測(cè)定

采用干濕法測(cè)量大鼠腦組織含水量。神經(jīng)功能評(píng)分后，取每組6 只大鼠斷頭取腦，分離出右側(cè)大腦。冰生理鹽水沖洗右側(cè)腦組織，濾紙粘吸腦組織表面的水及血跡后用電子分析天平稱缺血半球的濕重(右)，置于110 °C 烤箱中孵育24 h 后立即稱干重。腦組織含水量=（濕重-干重）/濕重×100%。

1.9 蛋白免疫印跡法（Western Blot）檢測(cè)腦組織內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白

將每組剩余大鼠取缺血區(qū)腦組織50 mg，用Western Blot 法檢測(cè)大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS Statistics 21.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì),所有數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間差異比較采用最小顯著差異法（LSD）法，以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較

腦缺血再灌注24 h，與假手術(shù)組比較，CI/R 模型組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分提高（P＜0.05）；與CI/R 模型組比較，CI/R 運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均降低（P＜0.05）；與CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組比較，CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分降低（P＜0.05），而CI/R運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組腦缺血再灌注24 h 神經(jīng)功能評(píng)分差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）單位：分

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分比較（±s）單位：分

注：與假手術(shù)組比較，① P＜0.05；與CI/R 模型組比較，②P＜0.05；與CI/R 白藜蘆醇組比較，③ P＜0.05；與CI/R運(yùn)動(dòng)組比較，④ P＜0.05。

組別假手術(shù)組CI/R 模型組CI/R 白藜蘆醇組CI/R 運(yùn)動(dòng)組CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組F 值P評(píng)分0.00±0.00 2.52±0.69①1.68±0.65①②1.74±0.73①②1.09±0.62①②③④57.020＜0.001只數(shù)22 21 22 22 21

2.2 各組大鼠腦梗死體積比較

腦缺血再灌注24 h，與假手術(shù)組比較，CI/R 模型組大鼠腦梗死體積增加（P＜0.05）；與CI/R 模型組比較，CI/R 運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠腦梗死體積均降低（P＜0.05）；與CI/R運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組比較，CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠腦梗死體積降低（P＜0.05），而CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組腦梗死體積差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s）單位：%

表2 各組大鼠腦梗死體積比較（±s）單位：%

注：與假手術(shù)組比較，① P＜0.05；與CI/R 模型組比較，②P＜0.05；與CI/R 白藜蘆醇組比較，③ P＜0.05；與CI/R運(yùn)動(dòng)組比較，④ P＜0.05。

組別假手術(shù)組CI/R 模型組CI/R 白藜蘆醇組CI/R 運(yùn)動(dòng)組CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組F 值P梗死體積0.66±0.08 43.33±7.34①33.80±4.93①②34.08±4.26①②27.13±4.86①②③④54.862＜0.001只數(shù)55555

2.3 各組大鼠缺血側(cè)大腦半球腦組織含水量比較

腦缺血再灌注24 h，與假手術(shù)組比較，CI/R 模型組大鼠腦組織含水量明顯增加（P＜0.05）；與CI/R 模型組比較，CI/R 運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組大鼠腦組織含水量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠腦組織含水量下降（P＜0.05）；CI/R運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組組間大鼠腦組織含水量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表3。

表3 各組大鼠缺血側(cè)大腦半球腦組織含水量比較（±s）單位：%

表3 各組大鼠缺血側(cè)大腦半球腦組織含水量比較（±s）單位：%

注：與假手術(shù)組比較，① P＜0.05；與CI/R 模型組比較，② P＜0.05。

組別假手術(shù)組CI/R 模型組CI/R 白藜蘆醇組CI/R 運(yùn)動(dòng)組CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組腦組織含水量76.47±5.86 82.77±4.30①79.65±3.94 80.16±2.36 77.65±3.53②只數(shù)66666

2.4 各組大鼠缺血半暗帶區(qū)神經(jīng)元凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

與假手術(shù)組比較，CI/R 模型組大鼠神經(jīng)元中凋亡細(xì)胞增加（P＜0.05）。與CI/R 模型組比較，CI/R 運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組及CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)元中凋亡細(xì)胞減少（P＜0.05）；與CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組比較，CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠神經(jīng)元中凋亡細(xì)胞減少（P＜0.05），CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R白藜蘆醇組神經(jīng)元中凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表4。

表4 各組大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較（±s）

表4 各組大鼠缺血半暗帶神經(jīng)元陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，① P＜0.05；與CI/R 模型組比較，②P＜0.05；與CI/R 白藜蘆醇組比較，③ P＜0.05；與CI/R運(yùn)動(dòng)組比較，④ P＜0.05。

組別假手術(shù)組CI/R 模型組CI/R 白藜蘆醇組CI/R 運(yùn)動(dòng)組CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組F 值P陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)1.70±0.95 20.10±3.45①14.50±2.79①②16.00±1.94①②10.50±2.88①②③④74.477＜0.001只數(shù)55555

2.5 各組大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)比較

與假手術(shù)組比較，CI/R 模型組大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05）；與CI/R模型組比較，CI/R 運(yùn)動(dòng)組、CI/R 白藜蘆醇組及CI/R白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠腦組織GRP78 蛋白表達(dá)量進(jìn)一步增加（P＜0.05），CHOP 蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05）。與CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組比較，CI/R白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組大鼠腦組織GRP78 蛋白表達(dá)量增加（P＜0.05），CHOP 蛋白表達(dá)量減少（P＜0.05）；而CI/R 運(yùn)動(dòng)組及CI/R 白藜蘆醇組大鼠腦組織GRP78及CHOP 蛋白表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。詳見表5。

表5 各組大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)結(jié)果（±s）

表5 各組大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)結(jié)果（±s）

注：與假手術(shù)組比較，① P＜0.05；與CI/R 模型組比較，② P＜0.05；與CI/R 白藜蘆醇組比較，③ P＜0.05；與CI/R 運(yùn)動(dòng)組比較，④ P＜0.05。

組別假手術(shù)組CI/R 模型組CI/R 白藜蘆醇組CI/R 運(yùn)動(dòng)組CI/R 白藜蘆醇+運(yùn)動(dòng)組F 值P CHOP/β-actin 0.42±0.09 0.92±0.10①0.73±0.13①②0.76±0.05①②0.57±0.12①②③④18.882＜0.001只數(shù)65665 GRP78/β-actin 0.32±0.08 0.56±0.10①0.72±0.12①②0.75±0.11①②0.95±0.14①②③④26.131＜0.001

3 討論

3.1 運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)CI/R 大鼠腦組織損傷的影響

缺血性腦卒中是致命性疾病之一，具有快速起病、高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅病人的健康和生命，并導(dǎo)致病人生活質(zhì)量明顯下降?；謴?fù)缺血半暗帶血流是目前治療該病的主要策略，可恢復(fù)腦供氧，清除有害代謝物，然而在某些情況下，再灌注本身會(huì)引發(fā)細(xì)胞死亡過程，導(dǎo)致腦出血和腦水腫，誘發(fā)更嚴(yán)重的腦損傷[13]。研究認(rèn)為，CI/R 是影響缺血性卒中的重要病理生理過程，可導(dǎo)致腦梗死體積增加及對(duì)側(cè)肢體運(yùn)動(dòng)及感覺功能障礙或伴意識(shí)喪失[14]。多數(shù)學(xué)者通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)，CI/R 可使大鼠出現(xiàn)腦缺血病變，血腦屏障破壞嚴(yán)重，腦水腫明顯增加，而腦水腫是導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡和腦損傷發(fā)展的重要因素之一[14]。MCAO 是一種經(jīng)典的、被廣泛接受的缺血性腦血管病動(dòng)物模型，因此本研究采用結(jié)扎MCAO 90 min、再灌注24 h 的方法制備大鼠CI/R 模型。研究結(jié)果顯示，大鼠再灌注后24 h 出現(xiàn)明顯的神經(jīng)功能缺損及腦梗死體積、腦含水量均明顯增加，提示本研究建立的大鼠局灶性腦缺血再灌注模型是成功的。近來研究發(fā)現(xiàn)，缺血預(yù)處理可對(duì)大腦產(chǎn)生顯著的神經(jīng)保護(hù)作用，有效減輕CI/R 損傷，改善病人預(yù)后[15]。本研究分別給予CI/R 大鼠4 周遞增強(qiáng)度跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇灌胃給藥干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)運(yùn)動(dòng)、單獨(dú)灌服白藜蘆醇及聯(lián)合干預(yù)均可顯著降低CI/R 大鼠腦梗死體積，且神經(jīng)運(yùn)動(dòng)障礙明顯改善；并且單獨(dú)運(yùn)動(dòng)及單獨(dú)灌服白藜蘆醇在改善CI/R 大鼠的腦神經(jīng)保護(hù)方面具有相同的益處，而運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇共同干預(yù)的預(yù)處理方式對(duì)CI/R 引起的腦損傷和運(yùn)動(dòng)功能障礙的神經(jīng)保護(hù)作用方面優(yōu)于單純運(yùn)動(dòng)和單純灌服白藜蘆醇，且只有聯(lián)合干預(yù)使CI/R 大鼠腦含水量顯著降低，但具體機(jī)制尚不清楚。

3.2 運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇對(duì)CI/R 大鼠腦組織GRP78 及CHOP 蛋白表達(dá)的影響

研究認(rèn)為，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是CI/R 損傷的發(fā)病機(jī)制之一，而抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可作為治療CI/R 損傷的有效策略[16]。GRP78 是熱休克蛋白70 家族成員，位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)通路中，GRP78 表達(dá)上調(diào)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激激活的標(biāo)志，其高表達(dá)可減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白聚集，并且GRP78 的激活已經(jīng)被證明可以改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷及保護(hù)神經(jīng)元免受損害[17]。CHOP 是一種多功能轉(zhuǎn)錄因子，在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中起核心作用。黃澈等[18]觀察到大鼠MCAO 閉塞恢復(fù)血流3 h 模型組大鼠GRP78 的表達(dá)迅速升高，至12 h達(dá)到高峰，之后逐漸下降，但仍高于假手術(shù)組；而CHOP 表達(dá)逐漸增加，至24 h 達(dá)到高峰，表明CI/R 后引起的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激首先是減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損傷，但后期由于應(yīng)激時(shí)間過長(zhǎng)導(dǎo)致細(xì)胞由抗凋亡向促凋亡轉(zhuǎn)換，加重細(xì)胞死亡。本研究的觀察時(shí)間點(diǎn)為CI/R 后24 h，與假手術(shù)組比較，CI/R 大鼠缺血再灌注區(qū)GRP78 及CHOP 表達(dá)均增高，TUNEL 染色顯示神經(jīng)凋亡細(xì)胞增多，說明CI/R 導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的啟動(dòng)，并啟動(dòng)了由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡通路。同時(shí)本研究還發(fā)現(xiàn)CI/R 大鼠腦梗死體積、腦組織含水量及神經(jīng)功能評(píng)分均顯著增加，說明CI/R 可能通過增強(qiáng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激促凋亡蛋白CHOP 的表達(dá)從而加重了CI/R損傷。因此，可以認(rèn)為，本研究CI/R 大鼠腦損傷可能與腦細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)因子GRP78、CHOP 的表達(dá)水平上調(diào)誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡有關(guān)，具體機(jī)制需進(jìn)一步研究。

研究認(rèn)為，缺血前預(yù)處理可通過降低內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡對(duì)CI/R 大鼠起到腦保護(hù)作用。白藜蘆醇是一種天然的多酚（化學(xué)名稱為3,4,5-三羥基二苯乙烯），在虎杖、葡萄、黎蘆、決明、花生等植物中含量較為豐富[19]。越來越多的研究表明，白藜蘆醇可能通過其抗氧化、抗炎、抗凋亡及抗內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等特性在人類健康中發(fā)揮潛在的治療作用[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇預(yù)干預(yù)（缺血前7 d 腹腔注射）可通過增強(qiáng)CI/R 大鼠前額葉皮質(zhì)GRP78 蛋白的表達(dá)恢復(fù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，減少腦含水量及腦梗死體積從而發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用[21]。在本研究中，對(duì)CI/R 大鼠進(jìn)行為期4 周的白藜蘆醇預(yù)處理，結(jié)果顯示其腦缺血再灌注區(qū)GRP78 顯著增加，CHOP 表達(dá)水平下降，并且TUNEL 染色顯示，白藜蘆醇組大鼠凋亡細(xì)胞顯著減少，與前期學(xué)者研究結(jié)果一致。

與其他預(yù)處理方法比較，運(yùn)動(dòng)預(yù)處理操作簡(jiǎn)單，更容易被病人接受；并且運(yùn)動(dòng)預(yù)處理可通過多途徑、多靶點(diǎn)包括調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、抑制凋亡及促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生等保護(hù)CI/R 導(dǎo)致的腦損傷[6]。有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)預(yù)干預(yù)（60 min/d，每周5 d）對(duì)CI/R 引起的腦水腫和運(yùn)動(dòng)障礙有神經(jīng)保護(hù)作用，被認(rèn)為是預(yù)防腦缺血性損傷的一種有用的策略[7]。本研究結(jié)果顯示，CI/R 運(yùn)動(dòng)組大鼠腦缺血再灌注區(qū)GRP78 及CHOP 表達(dá)水平及凋亡細(xì)胞變化趨勢(shì)與白藜蘆醇組一致，說明白藜蘆醇及運(yùn)動(dòng)預(yù)處理均可進(jìn)一步上調(diào)GRP78 蛋白的表達(dá)，下調(diào)CHOP 蛋白的表達(dá)，說明兩者均可促進(jìn)CI/R 大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)和功能的恢復(fù)，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷。

近年來，人們熱衷于將運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇聯(lián)合起來研究二者的協(xié)同效應(yīng)。Broderick 等[22]研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇、跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)及聯(lián)合干預(yù)均可通過抑制神經(jīng)元自噬、減少細(xì)胞凋亡和上調(diào)突觸相關(guān)蛋白的表達(dá)對(duì)老年癡呆大鼠產(chǎn)生神經(jīng)保護(hù)作用，但聯(lián)合干預(yù)效果更好。本研究也發(fā)現(xiàn)，跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)與白藜蘆醇共同干預(yù)，比單純運(yùn)動(dòng)、單純白藜蘆醇給藥能更進(jìn)一步增強(qiáng)CI/R 大鼠缺血半暗帶區(qū)GRP78 的表達(dá)，CHOP 表達(dá)及神經(jīng)細(xì)胞凋亡率下降幅度更大，說明聯(lián)合預(yù)干預(yù)更能有效抑制CI/R大鼠內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)功效疊加效應(yīng)，與上述學(xué)者研究結(jié)果一致。因此，本研究4 周跑臺(tái)運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇均能降低CI/R 大鼠腦梗死體積及神經(jīng)功能評(píng)分，兩者聯(lián)合干預(yù)較單一干預(yù)效果更為顯著，且只有聯(lián)合干預(yù)降低了CI/R 大鼠腦水腫，其機(jī)制可能是運(yùn)動(dòng)和白藜蘆醇促進(jìn)細(xì)胞未折疊及錯(cuò)誤折疊蛋白的正確組裝，抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，同時(shí)減少細(xì)胞凋亡，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)凋亡的具體調(diào)控通路尚需進(jìn)一步深入研究。