高 健，吳勝男，王曉靜，紀景馨，張 然，程景民*

1.山西醫(yī)科大學管理學院，山西 030001；2.山西醫(yī)科大學公共衛(wèi)生學院

非酒精性脂肪肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）包括脂肪變性、脂肪肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）、肝纖維化，最終導致肝硬化及肝細胞癌癥的廣泛性系列疾病[1]。據(jù)流行病學調(diào)查數(shù)據(jù)顯示，全球成人非酒精性脂肪肝病的患病率高達23%～25%，其中20%非酒精性脂肪肝病病人受脂肪肝炎的影響[2]?，F(xiàn)階段，在“二次打擊”學說不斷發(fā)展的基礎上，針對除脂肪變性、氧化應激以外的胰島素抵抗、線粒體功能紊亂、脂質(zhì)毒性等多重平行打擊在致病機制方面表明，非酒精性脂肪肝病為多種危險因素的相互作用導致[3-4]?？紤]到非酒精性脂肪肝病受基因遺傳、表觀遺傳和環(huán)境暴露等諸多復雜因素的相互影響，除使用非針對性藥物治療或接受身體運動的建議以外[5]，現(xiàn)階段提出的“營養(yǎng)遺傳學”和“營養(yǎng)表型基因組學”，通過研究飲食暴露與基因組的相互作用，改善臨床與健康營養(yǎng)實踐[5]。同時，植物提取物的多種活性成分、多種藥理作用在非酒精性脂肪肝病實驗模型中展現(xiàn)潛在多靶向效應[3]。于是，膳食管理和植物營養(yǎng)干預非酒精性脂肪肝病應運而生。沙棘果、沙棘葉和沙棘籽包含多糖、多酚和氨基酸等活性物質(zhì)種類豐富，藥理作用明顯[6-8]。沙棘葉和沙棘果的提取物抑制糖基化終產(chǎn)物的形成[9]，沙棘油富含的山柰酚可減弱細胞的氧化應激和脂質(zhì)積累[10]，沙棘汁在抑制炎癥和預防代謝性綜合征、神經(jīng)退行性疾病中發(fā)揮重要作用[8]。

隨著非酒精性脂肪肝病和沙棘相關研究的不斷深入，單靶點-單成分的研究模式已無法完全解釋其治療作用。本研究通過構建多成分-多靶點-多信號通路的關聯(lián)網(wǎng)絡探究沙棘對非酒精性脂肪肝病的綜合干預方式，對非酒精性脂肪肝病的發(fā)病、進展以及沙棘活性成分干預機制有著重要意義，為后續(xù)進一步探索沙棘治療非酒精性脂肪肝病相關作用機制提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 沙棘成分的獲取

在TCMSP數(shù)據(jù)庫（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）檢索沙棘主要成分并轉化為相關干預的蛋白質(zhì)，同時剔除未檢索到靶點蛋白的成分。參考Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）規(guī)范蛋白質(zhì)名稱后將其轉化為基因名稱（gene symbol）?？紤]檢索到的沙棘成分以及成分對應靶點數(shù)目較少，且沙棘作為食品可直接食用，故暫不考慮使用常用參數(shù)藥物相似度（DL）、口服生物利用度（OB）等對其進行過濾篩除。

1.2 非酒精性脂肪肝差異表達基因的篩選

在GEO 數(shù)據(jù)庫（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）中選擇表達譜GSE126848 高通量測序數(shù)據(jù)集做差異表達分析。將數(shù)據(jù)矩陣中“健康人群（healthy normal weight）”和“健康肥胖（obese）”作為對照組，“單純性脂肪變性（NAFL）”和“非酒精性脂肪性肝炎”作為試驗組。對照組與試驗組的測序數(shù)據(jù)統(tǒng)一為基因名稱（gene symbol）后，使用R（4.1.3）“l(fā)imma”包以P＜0.05、|LogFC|≥1 為臨界閾值篩選差異基因并繪制火山圖。其中，數(shù)據(jù)集中體重正常和肥胖受試者顯示正常的肝臟組織學。

1.3 沙棘影響非酒精性脂肪肝病的潛在靶點預測

沙棘成分的對應靶點基因與非酒精性脂肪肝病差異表達的基因在JVENN 在線網(wǎng)站（http://jvenn.toulouse.inra.fr/app/example.html）繪制韋恩圖（Venn），其中交集基因即沙棘干預非酒精性脂肪肝病的潛在靶點。

1.4 構建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡（PPI）

將沙棘干預非酒精性脂肪肝病的潛在靶點導入STRING 網(wǎng)站（https://cn.string-db.org/）構建靶點蛋白之間的關系網(wǎng)絡圖（medium confidence：0.4）。將PPI 網(wǎng)絡關系圖導入Cytoscapev 3.9.0 平臺可視化并借助Cytohubba 工具計算Degree 度值。

1.5 基因本體（GO）功能富集與基因組百科全書（KEGG）通路富集

將潛在靶點的gene symbol 使用org.Hs.eg.db R 包轉化為Entrez ID 后，clusterprofiler、enrichplot R 包對潛在靶點進行生物過程（biological process，BP）、細胞組分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）做GO 功能富集和KEGG 通路富集（FDR＜0.05）。篩選BP、CC 和MF 三者富集數(shù)量排序均居前10 位的結果通過ggpubr 包繪制GO 功能富集的條形圖。借助ggplot 2 包將KEGG 信號通路的全部結果可視化繪制氣泡圖。

1.6 成分-靶點-通路網(wǎng)絡的構建

沙棘成分、靶點信息和信號通路的相互關系導入Cytoscape（v 3.9.0）平臺構建成分-基因-通路分析網(wǎng)絡。

1.7 分子對接驗證分析

使用網(wǎng)絡拓撲分析Degree 算法篩選出前10 個基因作為核心靶點，并利用RCSB 數(shù)據(jù)庫（https://www.rcsb.org/）、AlphaFold 數(shù)據(jù)庫（https://alphafold.ebi.ac.uk/）和TCMSP 數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）獲取10 個活性分子的三維結構信息。有效成分和經(jīng)PyMOL 2.2.5 去除多余配體的靶點蛋白在AutoDock Tools 1.5.7 軟件分別去除水分子、補全氫分子，選定受體、配體后輸出為PDBQT 文件。調(diào)整靶點蛋白Grid Box 參數(shù)使其對接范圍包含全部的蛋白質(zhì)結構。在AutoDock Vina 軟件中完成核心成分與靶點之間的對接，記錄其親和性并用pheatmap R 包繪制對接結果熱圖進行分析。沙棘的10 種活性成分與其親和性最高的非酒精性脂肪肝病核心靶點在PyMol 中進行分子對接的可視化。

2 結果

2.1 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點的獲取

在TCMSP 數(shù)據(jù)庫檢索到沙棘有效成分223 種，剔除未檢索到靶點的成分和刪除重復選項后，得到138 種活性成分與574 個靶點蛋白的關系信息。GSE126848 測序數(shù)據(jù)包含健康群體（14 例）、健康肥胖（12 例）、單純非酒精性脂肪變性（15 例）和非酒精性脂肪肝炎（16 例）4 組信息。將對照組（健康群體和健康肥胖）26 例樣本與試驗組（脂肪變形和脂肪肝炎）31例樣本的表達譜信息轉化為13 569 個基因矩陣信息后，以P＜0.05、|LogFC|≥1 為過濾條件篩選非酒精性脂肪肝病的差異表達基因。非酒精性脂肪肝病差異表達基因共1 188 個，其中上調(diào)表達627 個，下調(diào)表達561 個，采用limma R 包對數(shù)據(jù)矩陣進行差異分析，代表上調(diào)基因的紅色圓點共627 個，代表下調(diào)基因的藍色圓點共561 個，灰色部分代表的基因被認為差異表達不顯著。詳見圖1。574 個沙棘靶點與1 188 個非酒精性脂肪肝病靶點的交集，共61 個關聯(lián)靶點。詳見圖2。

圖1 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點火山圖

圖2 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點韋恩圖

2.2 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡的構建

61 個影響非酒精性脂肪肝病的潛在基因在STRING 網(wǎng)站檢索后蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡關系圖見圖3。將網(wǎng)絡關系導入Cytoscape 平臺，其中TCF7L1、PCDH12、PDXP、B3GAT1、MAPK8IP2、HS3ST3A1、NT5M、SLC16A6 和CBS 這9 個靶點基因由于獨立于主要網(wǎng)絡關系暫不納入分析。按照網(wǎng)絡拓撲分析計算Degree 值排序，選取Degree 值居前10 位的基因（JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3、CCNA2）作為核心靶點做深入研究分析，詳見圖4，圖中顏色深淺反映網(wǎng)絡拓撲分析Degree 關系強弱。

圖3 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖（基于STRING 網(wǎng)站）

圖4 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡圖（基于Cytoscape 平臺）

2.3 GO 功能富集與KEGG 通路富集

利用clusterprofiler 包富集61 個潛在靶點主要的細胞功能與信號通路并將其可視化，GO 功能富集主要富集到對異源刺激反應、活性氧反應、鎘離子的反應、營養(yǎng)反應、調(diào)節(jié)血管形成、脈管系統(tǒng)發(fā)展相關生物過程，詳見圖5；KEGG 信號通路主要富集到細胞周期、p53 信號通路、動脈粥樣硬化、AGE-RAGE 信號通路、細胞衰老、缺氧誘導因子-1（HIF-1）信號通路等信號通路。詳細見圖6。

圖5 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點GO 富集分析柱狀圖

圖6 沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點KEGG 富集分析氣泡圖

2.4 成分-靶點-通路網(wǎng)絡的構建

沙棘中62 種活性成分顯示，通過調(diào)節(jié)轉錄因子JUN 等61 個靶點影響干預非酒精性脂肪肝病的發(fā)展。將基因與信號通路的關系導入Cytoscape 平臺進行可視化處理，62 種沙棘成分、61 個靶點基因、10 條GO 功能富集（生物過程）和26 條KEGG 信號通路，共159 個節(jié)點和表示其相互關系的387 條邊共同構成成分-靶點-信號通路關系網(wǎng)絡。詳見圖7。

圖7 沙棘干預非酒精性脂肪肝病的成分-靶點-通路網(wǎng)絡關系圖

2.5 分子對接驗證分析

篩選到的核心基因與主要成分進行進一步分子學驗證，以研究成分靶點之間具體的結合分子機制。核心靶點（JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3、CCNA2）與各核心成分[槲皮素（quercetin）、黃酮（flavone）、山柰酚（kaempferol）、亞麻酸（linolenic acid）、異鼠李素（isorhamnetin）、楊梅黃酮（myricetin）、香豆素（coumarin）、熊果酸（ursolic acid）、蘆?。╮hein）、豆甾醇（stigmasterol）]一一進行分子對接，利用pheatmap 包繪制對接親和性熱圖，詳見圖8。其中，結合能（Vina 評分）越低則表示靶點與活性成分對接后越穩(wěn)定。在Autodock Vina 分子對接中，配體和受體之間對接結果若結合能≤-5.0 kcal/mol，則被認為是對接的良好標準品[11-12]。同時也有經(jīng)驗法則（rule of thumb）認為，結合能≤-7.0 kcal/mol 為結合力強的體現(xiàn)。沙棘活性成分蘆丁與核心靶點NOS3親和性結合能=-8.8 kcal/mol 為100 次對接結果中親和性最高的組合。分子對接結果顯示，槲皮素、黃酮、山柰酚、亞麻酸、異鼠李素、楊梅黃酮、香豆素、熊果酸、蘆丁和豆甾醇共10 種活性物質(zhì)與JUN、MMP9、FGF2、VCAM1、CDKN1A、ACE、SERPINE1、SPP1、NOS3 和CCNA2 10 個核心靶點有較高親和性。詳見圖9。

圖8 10 個核心靶點與10 個核心成分之間的Autodcok vina 對接親和性熱圖

圖9 沙棘主要活性物質(zhì)與親和性最高的靶點的分子對接可視化圖

3 討論

在全球流行肥胖的背景下，非酒精性脂肪肝病患病率不斷上升[13]。目前，“多重打擊”解釋非酒精性脂肪肝病發(fā)病過程中多種可能的平行作用，其中氧化應激被認為是肝損傷和疾病發(fā)展的主要因素[14]。脂類代謝紊亂導致肝臟脂質(zhì)積累，影響線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和NADPH 氧化酶等活性氧的發(fā)生器，從而影響胰島素敏感性和脂類代謝關鍵酶的活性與表達[15]。盡管肥胖是非酒精性脂肪肝病公認的風險因素，但也有瘦弱個體的患病報道[16]。所以在本研究中，GSE126848 數(shù)據(jù)集中14 例正常健康樣本與12 例健康肥胖（肝臟樣本正常）樣本一同納入本研究的對照組，有效排除單純肥胖對非酒精性脂肪肝病研究的影響。

由于非酒精性脂肪肝病的多種危險因素的相互作用，來自草藥或飲食的天然活性物質(zhì)由于對應的眾多靶點而成為非酒精性脂肪肝病潛在的治療方法[17]。從構建的網(wǎng)絡中發(fā)現(xiàn)，不同化合物對應的多個靶點、多個信號通路重合，預測對非酒精性脂肪肝病可發(fā)揮協(xié)同干預作用。槲皮素誘導超氧化物歧化酶（SOD）催化分解反應中供氫體谷胱氨肽的合成，從而發(fā)揮清除自由基和活性氧的作用[18]。除此之外，槲皮素還可以通過激活FXR1/TGR5 信號通路改善脂質(zhì)代謝[19]，或通過抑制脂肪酸的從頭合成途徑減少脂質(zhì)積累[20]。山柰酚緩解細胞中脂質(zhì)儲存和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激[21]，介導磷酸腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/西羅莫司靶蛋白（mTOR）的磷酸化誘導細胞自噬從而發(fā)揮對脂毒細胞的保護作用[22]。作為過氧化物酶增殖物激活受體γ（PPARγ）天然配體，異鼠李素通過抑制受體信號傳遞改善胰島素抵抗、抑制脂肪細胞的分化并減輕肝臟的脂肪變性以及纖維化程度[23-24]。

61 個沙棘干預非酒精性脂肪肝病潛在靶點構建蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡確定了其中10 個核心基因參與疾病的發(fā)生、發(fā)展。轉錄因子JUN（transcription factor JUN）在61 個潛在干預靶點的網(wǎng)絡拓撲分析中Degree度值最高。JUN 識別激活蛋白-1（activator protein-1，AP-1）特定序列并與之結合成轉錄復合物，可增強其結合活性與轉錄活性[25-26]。構成AP-1 的系列蛋白特別是c-Jun 已被證明在肝臟生物學和疾病的許多方面起著至關重要的作用[27]。與對照組小鼠相比，飲食誘導的非酒精性脂肪肝病小鼠在組織陣列和免疫組化分析中JUN 信使核糖核酸（mRNA）表達水平及磷酸化水平升高[28]。與正常肝組織相比，非酒精性脂肪肝病病人mRNA 的表達水平顯著增強，且c-JUN 的表達與炎性評分、脂肪變性分級顯示顯著相關性[28]。在與JUN靶點對應的多個沙棘活性成分中，楊梅黃酮與熊果酸通過抑制可磷酸化激活c-jun 的酶類（jun N-terminal kinase，JNK）表現(xiàn)抑制JUN 作用[29-30]。與其他核心基因相比，內(nèi)皮細胞一氧化氮合酶（nitric oxide synthase,endothelial NOS3）與沙棘多個活性成分展現(xiàn)高親和性。內(nèi)皮一氧化氮合酶（eNOS）介導血管張力并在心血管系統(tǒng)中提供抗炎信號，而缺乏eNOS 的小鼠線粒體周轉和自噬的相關標志物減少，更容易受到西方飲食誘導的肝臟炎癥和纖維化的影響[31]。在篩選的沙棘活性成分中，蘆丁可通過NOS 介導的核轉錄因子-κB（NF-κB）信號通路抑制氧化應激和抗炎效應[32]，同時對卡非佐米（carfilzomib，CFZ）誘導的腎毒性表現(xiàn)出保護作用[32]，在肝臟相關研究中也可能有類似功效潛力。有統(tǒng)計學研究顯示，重塑金屬蛋白酶9（matrix metalloproteinase-9，MMP9）在內(nèi)臟脂肪組織中表達增加，且促炎糖蛋白TNC 與MMP9 的表達水平呈現(xiàn)明顯正相關[33]。而在本研究中MMP9 受沙棘中槲皮素的調(diào)控表達同樣在相關研究中得到驗證。槲皮素可降低MMP9、MMP2 和血管內(nèi)皮生長因子-A（VEGF-A）的表達阻止癌細胞的侵襲和血管形成[34]。MMP9 對非酒精性脂肪肝病的直接影響相對較少，仍處于研究更新狀態(tài)，但是MMP9 在肥胖癥中的表達異?；蚧钚愿淖儚娬{(diào)其在肥胖及相關肥胖并發(fā)癥的病理生理的參與[33]。

61 個沙棘干預非酒精性脂肪肝病的靶點在GO 功能富集中收集到多種生物學相關過程，其中活性氧（ROS）、活性氮（RNS）等促氧化劑與抗氧化劑之間的平衡維持著細胞正常生理狀態(tài)下的增殖、分化、遷移和收縮[35]。正常生理狀態(tài)下，基礎水平的ROS 參與氧化還原反應信號的傳導[36]。細胞通過分解脂滴回收受損的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，抑制氧化應激和有害ROS 的生成[37]，維持肝臟功能代謝和能量需求，預防非酒精性脂肪肝病或非酒精性脂肪性肝炎[38-39]。高脂飲食和脂質(zhì)代謝失調(diào)導致肝游離脂肪酸和三酰甘油的積累[40]。線粒體β 氧化水平降低和脂肪生成增加導致肝細胞中的脂質(zhì)積累，生成過多的ROS[39]。除線粒體外，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中細胞色素P450 活性反應、微粒體代謝、CHOP 表達也是ROS 的來源[41]。ROS 異常生成時，通過抑制線粒體呼吸鏈酶、誘導脂質(zhì)過氧化、促進促纖維化細胞遷移，造成肝細胞的損傷和纖維化[42]。同時ROS 不利于線粒體自噬對肝臟的保護。ROS 誘導線粒體膜電位增加不利于線粒體自噬的發(fā)生[43]，不利于凋亡降解維持線粒體功能結構[39]?？梢?，ROS 參與細胞多種反應過程，對維持肝細胞微環(huán)境非常重要。

除此之外，在KEGG 富集通路中也有豐富的生物信號通路體現(xiàn)。P53 調(diào)節(jié)細胞應激、代謝和周期，已成為肝臟穩(wěn)態(tài)和功能障礙的重要調(diào)節(jié)劑[44]。P53 參與脂質(zhì)代謝相關基因的表達促進脂質(zhì)分解，或抑制脂質(zhì)合成蛋白質(zhì)來調(diào)控脂質(zhì)積累。但是也有相關報道稱表示抑制P53 的轉錄活性可以降低肝臟脂肪變性相關的氧化應激[45]。其中，P53 與非酒精性脂肪肝病的雙重關系可能與激活狀態(tài)、細胞內(nèi)分布和突變相關[46]。

10個核心靶點與10個核心成分之間的Autodcok Vina對接親和性熱圖顯示，沙棘活性成分與非酒精性脂肪肝病核心靶點親和性幾乎全部結合能≤-5.0 kcal/mol，且部分對接組合結果結合能≤-7.0 kcal/mol 展示高親和性。

沙棘主要的活性物質(zhì)與親和性最高的靶點的分子對接可視化圖顯示，受體與配體間接觸面積較大，活性分子基本被蛋白分子接觸包繞。除去NOS3 與豆甾醇之間的結合為疏水作用力，其余核心靶點與活性成分展現(xiàn)高親和性則以親水氫鍵連接。通過分子對接親和力熱圖層次聚類分析，NOS3、MMMP9、ACE、SERPINE1 和CCNA2 與沙棘活性成分親和力明顯高于其余核心基因而被分為不同模塊。其中NOS3 與眾多沙棘核心成分親和性最高，沙棘成分可能主要通過與NOS3 的相互作用發(fā)揮抗炎抗非酒精性脂肪肝病功效。與其他沙棘成分相比，熊果酸與多個核心基因也顯示較高親和性。除熊果酸以外，沙棘中其他種類及含量豐富的有機酸也可能在非酒精性脂肪肝病干預過程中發(fā)揮潛在作用。

總而言之，本項目研究GEO 公開數(shù)據(jù)庫收集非酒精性脂肪肝病的特征基因，并篩選與之對應匹配的沙棘活性成分。研究結果表明沙棘可通過多靶點和多通路影響干預非酒精性脂肪肝病，為以后非酒精性脂肪肝病的相關病理或藥理研究提供參考。