于靜 張明宇 肖娜 辛長勛 馬振乾

摘 要：為確定河南某鴨場發(fā)病番鴨的致病原因，采集該鴨場患病鴨的小腸組織病料作為檢測樣品，采用PCR的方法對病原進(jìn)行檢測分析，同時進(jìn)行VP1 基因序列的測序比對。結(jié)果表明，該病原VP1基因與小鵝瘟病毒同源性最高，最高為99.8%，且位于進(jìn)化樹同一分支，而與經(jīng)典番鴨細(xì)小病毒的同源性為81.4%～87.8%。因此，確定該病由小鵝瘟病毒引起。

關(guān)鍵詞：番鴨；小鵝瘟；序列分析

中圖分類號：S858.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：B 文章編號：1673-1085（2023）08-0054-05

小鵝瘟（Gosling plague）是由小鵝瘟病毒（Gosling plague virus，GPV）引起的一種急性或亞急性的敗血性傳染病。該病具有傳播快、發(fā)病率高及致死率高等特點(diǎn)，給水禽生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。小鵝瘟病毒主要侵害30日齡以內(nèi)的雛鵝或雛番鴨，而隨著雛鵝或雛番鴨日齡的增大，其發(fā)病率及致死率會顯著下降[1-3]。

GPV屬于細(xì)小病毒科，在電鏡下觀察可見空殼和實(shí)心兩種病毒粒子，無囊膜，二十面體對稱，大小為20～22 nm。GPV有3種結(jié)構(gòu)蛋白，分別是VP1、VP2、VP3，分子量分別是85 000、61 000、57 500 Da，其中VP3為主要結(jié)構(gòu)蛋白[4-5]。1956年，方定一先生首次在我國揚(yáng)州地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病毒，1958年確定為小鵝瘟病毒[6]。本文通過對河南省某疑似發(fā)生小鵝瘟鴨場采集到的病料進(jìn)行病毒分離鑒定，確診為小鵝瘟病毒，隨后對VP1基因序列進(jìn)行分析，以期為小鵝瘟疫苗的研發(fā)提供進(jìn)一步的信息支持。

1 材料與方法

1.1 病料來源

河南某鴨場病鴨出現(xiàn)拉稀現(xiàn)象，伴有墨綠色糞便和灰白色水樣糞便，飲水量增加，有明顯的呼吸道癥狀，精神沉郁，解剖發(fā)現(xiàn)該番鴨出現(xiàn)小腸栓塞及肝臟包膜等典型臨床癥狀，見圖1。采集疑似感染小鵝瘟番鴨的小腸樣品作為待檢病料。

1.2 試劑

DNA提取試劑盒購自杭州博日科技股份有限公司；Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖購自生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)合成

根據(jù)GenBank上已發(fā)表的GPV SYG61v（登錄號： KC996729）、VG32/1（登錄號：EU583392）等病毒株的基因序列，應(yīng)用Primer premier 5軟件在VP1基因內(nèi)部設(shè)計(jì)并合成一對引物（表1），該引物可同時擴(kuò)增出經(jīng)典小鵝瘟、新型小鵝瘟、經(jīng)典番鴨細(xì)小病毒及新型番鴨細(xì)小病毒的VP1基因片段，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4 病料處理

將番鴨小腸組織樣品加入PBS緩沖液充分研磨成懸濁液，反復(fù)凍融3次，10 000 r/min離心4min，取上清，經(jīng)0.22 μm濾器過濾。使用NDA提取試劑盒按說明書中的步驟從樣品中提取總DNA。

1.5 PCR檢測

采用表1中的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)體系按照說明書制備，即：10×PCR緩沖液 5 μL，Mg2+（25 mM）3 μL，dNTP（10 mM）1 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）1 μL，cDNA模板 1 μL，上下游引物各2 μL，用ddH2O補(bǔ)齊至50 μL。PCR運(yùn)行程序?yàn)椋?5 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，共30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。ddH2O作為陰性對照，同時用實(shí)驗(yàn)室其他水禽常見病毒檢測引物對待檢樣品進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 PCR產(chǎn)物測序及序列分析

將PCR產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測序，序列與GenBank下載的GPV參考毒株（表2）進(jìn)行序列比對和分析。

2 結(jié)果

2.1 分離毒的PCR檢測結(jié)果

以疑似感染病料上清液為模板，GPV VP1-F/ GPV VP1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，同時用實(shí)驗(yàn)室其他水禽常見病毒檢測引物進(jìn)行PCR檢測，將產(chǎn)物經(jīng)過凝膠電泳檢測后，結(jié)果顯示，檢測樣品擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶與小鵝瘟病毒陽性對照一致，約為1 000 bp，陰性對照未見任何非特異擴(kuò)增（圖2），表明分離的病毒為GPV。

2.2 分離毒VP1序列分析

將從病料中分離毒株的VP1基因與從GenBank上下載的小鵝瘟及經(jīng)典番鴨細(xì)小病毒毒VP1進(jìn)行基因比對。結(jié)果顯示，該測序序列與新型小鵝瘟同源性最高，為98.5%～99.8%，位于同一分支，而與經(jīng)典番鴨細(xì)小病毒的同源性為81.4%～87.8%，結(jié)果見圖3和圖4。

3 討論

實(shí)驗(yàn)室檢測對于小鵝瘟的臨床診斷及病原研究非常重要。近些年，分子生物學(xué)技術(shù)在獸用疾病臨床診斷方面發(fā)揮重要作用，PCR快速檢測方法省時省力，已經(jīng)成為小鵝瘟臨床診斷常用的檢測方式。童艷梅等[7]為了提高小鵝瘟病毒PCR檢測的檢出率，根據(jù)已有的小鵝瘟病毒基因序列，設(shè)計(jì)合成了一對特異性引物，并進(jìn)行了優(yōu)化，其優(yōu)化后的PCR方法特異性強(qiáng)、敏感性高，反應(yīng)時間明顯縮短。

近些年小鵝瘟?xí)r有發(fā)生，在福建、廣東、江蘇、山東、吉林等地區(qū)[8-14]均有報(bào)道。該病毒基因組變異較小，20世紀(jì)分離的毒株SYG61與今年分離的毒株間同源性很高，與本實(shí)驗(yàn)室分離的毒株同源性為92.2%。無論是在國內(nèi)不同區(qū)域分離到的毒株，還是國內(nèi)與國外分離到的毒株間同源性均較高，無論非結(jié)構(gòu)蛋白還是結(jié)構(gòu)蛋白編碼基因核苷酸序列一致性均達(dá)到90.0%以上。

本實(shí)驗(yàn)室從河南省某鴨場分離得到的一株細(xì)小病毒，結(jié)果顯示該病毒為小鵝瘟。對其進(jìn)行VP1基因序列測定顯示，該毒株與新型小鵝瘟同源性為98.5%～99.8%，而與經(jīng)典鴨細(xì)小病毒的同源性為81.4%～87.8%。因此該毒株為番鴨源鵝細(xì)小病毒，即新型小鵝瘟，并證實(shí)了GPV對鴨場的污染。臨床上使用我國最早分離毒株SYG61研發(fā)的疫苗對小鵝瘟仍有良好的免疫保護(hù)效果。

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Identification of a Muscovy Goose Plague Virus Strain and Sequence Analysis of VP1 Gene from Muscovy Duck in Henan Province

YU Jing1， ?ZHANG Mingyu1，XIAO Na1，XIN Changxun1， MA Zhenqian2*

（1.Qingdao Ruier Weite Biotechnology Co.， Ltd.， Qingdao ?266000， China;

2.Qingdao Yebio Biotechnology Co.， Ltd.， Qingdao ?266000， China）

Abstract： ?In order to determine the pathogenesis of sick Muscovy ducks in a muscovy duck farm in Henan Province， the samples of small intestine tissues of sick ducks were collected and the pathogen was detected by PCR. Then the VP1 gene sequence was sequenced and compared. The results showed that the VP1 gene had the highest homology （99.8%） with Gosling plague virus and located in the same branch of the phylogenetic tree. The homology of VP1 gene with classical Muscovy duck parvovirus was 81.4% ～ 87.8% . Therefore， it was confirmed that the disease was caused by Gosling plague virus.

Keywords： Muscovy duck; Goose plague; Sequence analysis