廖怡星，劉柯岑，喻沁然，何崢巖，趙 淵，單天琪

（重慶醫(yī)科大學 生物醫(yī)學工程學院/超聲醫(yī)學工程國家重點實驗室，重慶 400016）

高強度聚焦超聲（High intensity focused ultrasound, HIFU）以無創(chuàng)組織消融的特點正迅速發(fā)展成為一種公認的臨床治療方式。在HIFU 治療過程中，聚焦的超聲能量被傳輸?shù)杰浗M織中，超聲換能器的聚焦區(qū)獲得高聲強，而聚焦區(qū)以外的區(qū)域聲強較低，高強度超聲被軟組織吸收后局部溫度升高，引發(fā)焦域內靶組織細胞凝固性壞死同時保存周圍健康組織[1]。HIFU 消融術已被應用于多種良惡性腫瘤的治療，包括乳腺癌、子宮肌瘤等實體瘤[2-4]。

為了提高HIFU 治療的有效性，我們需要對靶組織狀態(tài)進行監(jiān)測，從而對治療提供指導和反饋。熱效應是HIFU 進行腫瘤消融的主要機制之一，對熱損傷的監(jiān)控是確保HIFU 治療安全性與有效性的基礎[5]。對于HIFU 治療的監(jiān)控，目前臨床上主要采用的是超聲成像和核磁共振成像。超聲引導的HIFU 治療，主要是通過B 超圖像的灰階變化和治療前后多普勒血流成像來判斷熱凝固性損傷[6]。但使用B 超監(jiān)控熱凝固性損傷存在許多問題：B 超圖像的灰階變化主要由組織中空化/沸騰泡的出現(xiàn)所引發(fā)，而熱凝固性損傷可能在空化/沸騰現(xiàn)象之前出現(xiàn)，且并不一定伴隨有空化/沸騰，因此，利用B 超圖像的灰階變化對熱凝固性損傷進行監(jiān)測的靈敏度低，在很多情況下無法監(jiān)測到損傷出現(xiàn)，造成了過度治療的問題[7]；多普勒超聲易受多種因素影響，對細小血管及低速血流不敏感，造成其測量精度不高等問題[8]。與基于超聲引導不同，磁共振成像（MRI）監(jiān)測最大的優(yōu)點是可以獲取組織的溫度分布，并計算出熱劑量分布。然而MRI 的時間分辨率（1～4 s）[9]有限，對于HIFU 治療中快速溫升的情況并不完全適用，并且MRI 的高成本、使用時間較長及使用存在禁忌（對于裝有心臟起搏器或植入金屬的患者不能使用）等問題很大程度上限制了MRI 引導的HIFU 技術的推廣和普及。

因此，建立一種對組織熱損傷具有高靈敏度的監(jiān)測手段對提高治療的安全性和有效性至關重要。近年來，一些新型成像技術也在探索在HIFU 治療監(jiān)測中的應用，光聲成像（Photoacoustic Imaging，PAI）以其優(yōu)秀的光學對比度、時間及空間分辨率，以超聲為媒介達到了無損的醫(yī)學成像目的。光聲成像對熱病變成像有很大的優(yōu)勢，可以提供生物組織的結構和功能信息，如：氧合血紅蛋白及脫氧血紅蛋白濃度、黑色素和脂質含量等[10-12]。目前，PAI 在HIFU 治療中的應用已經有一些研究，例如HIFU 焦域的可視化[13]、損傷前的組織溫度檢測[14]，以及治療后的熱凝固組織評估[15]等。然而在HIFU 治療組織的過程中，我們往往需要判斷靶組織的狀態(tài)，使其能夠達到不可逆的熱凝固損傷，同時避免治療不完全或過度治療的發(fā)生。雖然熱凝固損傷引起的組織光吸收系數(shù)改變可以反應在光聲圖像的對比度變化上，但是HIFU 治療過程中溫度持續(xù)升高同樣會引起靶組織光聲圖像對比度的變化，因而無法單純從光聲圖像上判斷治療過程中組織熱凝固損傷形成。此外，由于組織之間的差異性，不同組織達到熱凝固性損傷所需要的熱計量（加熱持續(xù)時間和溫度的函數(shù)）不同，僅對溫度成像無法準確判斷熱凝固損傷的出現(xiàn)及發(fā)展過程[16]。并且，目前深部組織內無損測溫仍是一個巨大挑戰(zhàn)，利用光聲技術進行測溫的方法大多只能測量相對溫度變化[17-19]，對于絕對溫度的測量仍存在很大局限，無法實現(xiàn)對深部組織內實際溫度的測量[20]。因此，如何在HIFU 治療過程中監(jiān)測組織熱凝固的出現(xiàn)及發(fā)展過程仍然是一個有待解決的重要問題。

針對上述問題，本文研究了基于光聲信號特征及幅值隨加熱時間變化規(guī)律監(jiān)測組織熱凝固產生及發(fā)展過程的可行性。通過構建的光聲和HIFU 一體化系統(tǒng)，對離體牛肝組織在HIFU 輻照過程中光聲信號幅值變化進行測量，研究了組織熱凝固前、熱凝固形成過程中及組織完全熱凝固后光聲信號幅值與加熱時間的依賴曲線特征，并通過對不同階段的組織進行病理分析驗證了不同曲線特征與組織狀態(tài)的對應性。本研究為實時監(jiān)測HIFU 治療中組織熱凝固的形成過程提供了一種新的技術路徑，具有重要的臨床意義。

1 材料和方法

1.1 理論背景

光聲信號是基于脈沖激光輻射對超聲波的熱聲激勵。在應力約束輻照條件下，用入射激光通量為F 的短激光脈沖照射吸收介質，在吸收體內引起瞬時壓力上升P

式中：β 為熱膨脹系數(shù)，℃-1；cs為聲速，m/s；Cp為恒壓下的熱容，J/g℃；F 為激光通量，J/m2；μa為光吸收系數(shù)，m-1；Γ 為與溫度相關的函數(shù)（Grüneisen）。式（1）將局部壓力與局部Grüneisen 參數(shù)、光通量和吸收系數(shù)聯(lián)系起來，當熱沉積過程中的壓力弛豫可以忽略時，式（1）在應力約束條件下是有效的。當激光脈沖持續(xù)時間τp小于吸收體應力弛豫時間τstr時，滿足應力約束條件

因為Grüneisen 系數(shù)取決于組織溫度，因此光聲信號具有一定的溫度依賴性，當組織未發(fā)生熱凝固時（溫度低于43 ℃），μa變化可忽略不計，若光通量不變，則光聲信號振幅只與溫度相關。當組織開始發(fā)生熱凝固性損傷時（43～55 ℃），組織變化導致μa發(fā)生較大變化，同時，溫度升高及組織脫水都會導致組織Grüneisen 系數(shù)改變，此時光聲信號振幅變化受組織變化與溫度共同影響。當組織完全熱凝固后（溫度高于55 ℃），已經脫水的組織Grüneisen 系數(shù)的溫度依賴性減弱，同時，組織完全熱凝固后，其結構和成分不再發(fā)生劇烈變化，即μa基本不變，則此時光聲信號幅值變化較小。當組織過度治療時，其結構和成分再次發(fā)生較大變化，那么光聲信號幅值也會隨之發(fā)生較大改變。因此，在HIFU加熱組織產生熱凝固的不同階段，光聲信號隨加熱時間變化規(guī)律不同，由此可根據(jù)光聲信號隨加熱時間變化規(guī)律的改變來判斷組織狀態(tài)。

1.2 實驗設置

實驗系統(tǒng)示意圖如圖1 所示，本系統(tǒng)使用可調諧光參量振蕩（optical parametric oscillators，OPO）激光器（NSOPO-L532HF-200，中科思遠，中國），以100 Hz的重復頻率，輸出720 nm 波長的激光，其中脈沖持續(xù)時間為5 ns，并耦合入定制高能光纖束（CeramOptec，德國），光纖束末端固定在定制聚焦超聲換能器中心開孔處，激光通過換能器中心孔垂直輻照于下方樣本組織表面，通過能量計測得樣本組織表面的能量密度為6.6 mJ/cm2，小于美國國家標準（American National Standards，ANSI）中720 nm 波長激光的安全標準[21]。組織產生的光聲信號由1 個中心頻率為1 MHz 的超聲換能器（奧索電子科技，中國，帶寬：0.39～1.61 MHz）接收，并經由放大器放大后通過示波器（Picoscope5000D，Pico 科技，英國）采集并上傳存儲至上位機中。樣品組織封裝在1 個直徑為4.5 cm 的2%瓊脂糖仿體中與水隔離，仿體放置于亞克力水缸正中心的盛放支架上，水缸中裝滿脫氧水。聚焦超聲換能器匹配層浸入水中，對下方組織以15 W 的電功率進行輻照，整個輻照過程時長約為56 s。

圖1 光聲與聚焦超聲一體化系統(tǒng)

本系統(tǒng)中采用多通道數(shù)字延遲脈沖發(fā)生器（DG538，中科思遠，中國）實現(xiàn)激光器、數(shù)據(jù)采集及聚焦超聲發(fā)射的觸發(fā)。觸發(fā)時序如圖2 所示，在聚焦超聲發(fā)射間隙進行光聲信號采集，實現(xiàn)光聲對聚焦超聲治療的實時監(jiān)測，激光器與數(shù)據(jù)采集同步觸發(fā)，延遲1 ms后觸發(fā)聚焦超聲發(fā)射，避開光聲采集時段，從而避免聚焦超聲發(fā)射對光聲信號的干擾。實驗中光聲信號經過多次平均，以排除激光能量抖動及實驗環(huán)境所帶來的實驗誤差。上位機使用LabView 開發(fā)程序，實現(xiàn)系統(tǒng)控制及實驗結果的實時顯示。

圖2 聚焦超聲治療與光聲采集時序圖

聚焦超聲通常治療的部位是一些軟組織，所以實驗選用血液灌注豐富的牛肝組織作為軟組織模型。實驗采用新鮮組織（從動物身上取出6 h 以內），將其放入空氣泵當中脫氣1 h，除去組織中的氣泡，防止氣泡影響原始光聲信號，接著將組織切割為1.5 cm×1.5 cm×1.5 cm 的方塊，嵌入仿體當中。取得4 組樣本進行實驗。

2 結論

2.1 牛肝組織焦點處的時域光聲信號特征

利用聚焦超聲換能器對樣本組織進行加熱，會對靶組織造成1 個直徑約1 mm 的熱凝固損傷，在不同時刻對靶組織光聲信號進行采集。圖3 是牛肝組織在HIFU 治療后的焦域形態(tài)的示例。

圖3 牛肝組織在HIFU 治療后焦點的形態(tài)

牛肝組織在HIFU 治療開始前、HIFU 治療結束后及焦域冷卻后3 種狀態(tài)下檢測到的光聲信號時域剖面圖的典型分布如圖4 所示。

圖4 利用超聲換能器對不同狀態(tài)下的牛肝組織樣品當中激發(fā)出的光聲信號在時域下進行檢測

由圖4 可知，牛肝組織在HIFU 治療前后光聲信號振幅呈倍數(shù)增加，在治療冷卻后焦域處光聲信號振幅比剛完成治療后有所減少，但是依然比治療前有顯著增加，得以證明此時焦域已完成熱凝固性損傷，揭示了組織中不可逆的損傷?？梢园l(fā)現(xiàn)，熱損傷后的組織樣品光聲信號前緣信號比熱損傷前樣品組織的焦點信號前緣斜率變陡了許多。一般地，在光通量不變的情況下，較大的光吸收系數(shù)會產生更鋒利的前緣信號[22]。光聲信號后緣斜率可以定性地反映光學性質（光吸收系數(shù)μa或光散射系數(shù)μs兩者的增加都有可能導致斜率變陡）[23]，后緣斜率隨著不同時刻發(fā)生變化，在不同溫度狀態(tài)下呈不同形態(tài)。因此，光聲信號振幅及特征可一定程度反映熱凝固前后的組織狀態(tài)。

2.2 牛肝組織光聲信號振幅與治療時間的關系及樣本組織焦點處病理切片分析

用采樣頻率為10 Hz 的熱電偶插在聚焦超聲焦點處，進行記錄組織升溫過程，聚焦超聲加熱過程中焦域處靶組織的溫度變化示例如圖5 所示，可以看到聚焦超聲加熱組織溫升相對均勻。

圖5 聚焦超聲加熱過程中焦域處靶組織的溫度變化

圖6 為牛肝樣本靶組織的光聲信號振幅隨加熱時間變化的示例圖。從圖6 中看出，光聲信號有3 個變化階段，在第一個階段（加熱20 s 內），靶組織溫度在43～55 ℃（圖5），光聲信號幅值隨加熱時間迅速升高，對該區(qū)間數(shù)據(jù)進行最小二乘擬合得到曲線斜率為0.002 44±1.659 59×10-4V/s。在第二階段（20～53 s），靶組織溫度在55～62 ℃，光聲信號幅值隨加熱時間變化率大幅減小，對該區(qū)間數(shù)據(jù)進行最小二乘擬合得到曲線斜率為0.000 51±4.363 56×10-5V/s。在第三階段（53～80 s），靶組織溫度在62～72℃，光聲信號幅值隨加熱時間再次迅速升高，對該區(qū)間數(shù)據(jù)進行最小二乘擬合得到曲線斜率為0.001 59±6.833 09×10-5V/s。表1 為4 組樣品在光聲信號幅值隨時間變化的3 個階段數(shù)據(jù)的最小二乘擬合斜率?？梢钥闯龉饴曅盘柗惦S時間變化均存在相似規(guī)律。多組實驗中光聲信號振幅變化規(guī)律基本一致，表示該實驗結果的準確性。導致上述光聲信號變化規(guī)律的原因，可能是靶組織在第一階段（43～55 ℃）開始產生部分熱凝固，此時靶組織成分和結構發(fā)生變化，組織開始脫水萎縮，導致組織發(fā)色團濃度增加，光吸收系數(shù)升高，同時，溫度升高及組織脫水導致Grüneisen 系數(shù)升高。由式（1）可知，光聲信號振幅與光吸收系數(shù)及Grüneisen 系數(shù)成正比，因此，產生組織熱凝固的階段，牛肝組織光聲信號會迅速升高。在第二階段（20～53 s），靶組織已經完全熱凝固，此時，由于已經脫水的組織Grüneisen 系數(shù)溫度依賴性大幅減弱，且光吸收系數(shù)變化較小或基本不變，因此，在已形成完全熱凝固的階段，光聲信號幅值變化率大幅減小。在第三階段，當組織完全熱凝固后繼續(xù)對靶組織加熱，隨著溫度升高，組織結構和成分進一步發(fā)生變化，導致光聲信號幅值變化率改變，此時組織已經過度治療。例如，肝臟組織是一種典型的具有豐富血流灌注的組織，血紅蛋白是產生光聲信號的主要內源發(fā)色團，在高溫下（60 ℃以上），血紅蛋白會轉化為高鐵血紅蛋白，其光吸收系數(shù)也會隨之增大，因此，光聲信號幅值再次快速升高可以指示靶組織過度治療。

表1 4 組樣品在光聲信號幅值隨時間變化3 個階段數(shù)據(jù)的最小二乘擬合斜率

圖6 牛肝樣本靶組織的光聲信號振幅隨加熱時間變化

為了驗證上述光聲信號幅值變化規(guī)律與HIFU 治療過程中靶組織狀態(tài)變化的對應性，本研究對3 個不同階段的靶組織進行了HE 染色病理分析。根據(jù)光聲信號振幅隨時間變化曲線，取3 個不同階段的樣本組織（同一塊肝臟組織取下），圖7 為不同階段組織HE染色圖示例。如圖7（a）所示，在第一階段（加熱20 s 內，43～55 ℃），開始產生熱凝固損傷階段，肝小葉內可見小葉中央靜脈（實線箭頭所示），虛線箭頭所指部分區(qū)域內可見少量炎性細胞浸潤，劃線箭頭處空隙與周圍組織間未見細胞破裂，故可見微小組織病變，由此可知組織已開始產生部分熱凝固。在第二階段（加熱20～53 s，55～62 ℃），如圖7（b）所示，實線箭頭所指可見小葉中央靜脈，虛線箭頭處可見肝細胞索之間少量出血，劃線箭頭表示肝細胞核，可見損傷點與周圍組織邊界清晰，并且伴隨細胞膜破裂，細胞核露出，細胞收縮顏色變深，表示細胞死亡，靶組織已經形成熱凝固損傷。在第三階段（加熱53 s 之后，62～72 ℃），如圖7（c）實線箭頭所示，治療區(qū)域內肝組織明顯破壞，肝細胞完全消失，治療區(qū)域邊界周圍伴有大量炎性細胞浸潤（圓圈內）并且大量出血，劃線箭頭所示，損傷點與周圍正常組織之間邊界清晰，細胞膜破碎，肝細胞核萎縮導致邊界顏色加深，此時熱損傷已經過度。上述病理結果與我們得到的3 個階段光聲信號幅值隨時間變化規(guī)律相吻合，由此證明了基于光聲信號幅值隨時間變化規(guī)律對HIFU 治療過程中組織熱凝固產生及發(fā)展過程監(jiān)測的可行性。

圖7 光聲信號幅值隨時間變化的3 個階段中牛肝靶組織細胞層面展示及病理分析

3 討論

本文研究了基于光聲信號特征及幅值隨時間變化規(guī)律監(jiān)測HIFU 治療過程中組織熱凝固的產生及發(fā)展過程的可行性。該方法避免了深部組織內無損測溫的困難，通過熱凝固產生過程中組織不同狀態(tài)下光聲信號特征及信號幅值隨時間變化規(guī)律的不同對組織狀態(tài)進行監(jiān)測。在組織開始發(fā)生熱凝固的階段，光聲信號幅值快速升高，信號幅值隨時間變化率較大。這是由于組織在凝固過程中會發(fā)生脫水萎縮，由于軟組織的熱膨脹系數(shù)遠大于水的熱膨脹系數(shù)，因此組織脫水會導致熱膨脹系數(shù)的增大，并且軟組織的脫水會導組織內含水量降低，從而使組織比熱Cp降低，導致急劇升高。Grüneisen 系數(shù)受到熱膨脹系數(shù)β 及比熱Cp的影響而升高，此外，組織脫水萎縮的過程也會導致產生光聲信號的發(fā)色團濃度增加，從而使光吸收系數(shù)升高。Grüneisen 系數(shù)與光吸收系數(shù)二者同時作用使光聲信號幅值快速升高，表現(xiàn)為信號幅值隨時間變化率較大，這就是圖6 中光聲信號幅值變化的第一個階段。同時對靶組織溫度進行測量（圖5），靶組織溫度處于43～55 ℃，該溫度是組織發(fā)生熱凝固的溫度范圍。當靶組織形成完全熱凝固時，已經脫水的組織Grüneisen系數(shù)的溫度依賴性大幅降低且光吸收系數(shù)變化較小，因此，這一階段光聲信號幅值變化較小且隨時間變化率大幅降低。隨著HIFU 的持續(xù)治療，組織溫度持續(xù)升高，組織結構及成分隨之發(fā)生變化，在高溫下（大于60 ℃），組織內的血紅蛋白會逐漸轉化為高鐵血紅蛋白[24]，使光吸收系數(shù)大幅增加，導致光聲信號幅值再次快速升高，信號隨時間變化率提高。圖7 的組織病理分析表明，此階段存在過度治療。

綜上所述，本文提出了利用光聲信號特征及幅值隨時間變化規(guī)律對HIFU 治療過程中肝臟組織熱損傷進行監(jiān)測，從多個角度表征熱損傷的狀態(tài)，并且在細胞層面對實驗結論進行驗證。研究表明該方法可以避免深部組織無損測溫的難題，實現(xiàn)對組織熱凝固形成過程的無損監(jiān)測。研究結果為HIFU 治療中組織熱凝固實時監(jiān)測提供了一種新的技術路徑，具有重要的臨床價值。