彭群藝，李純團(tuán)，鄭艷，朱雄鵬

362000福建 泉州，福建醫(yī)科大學(xué)附屬泉州市第一醫(yī)院 血液科

近年來(lái)，將嵌合抗原受體（chimeric antigen receptor，CAR）與T細(xì)胞結(jié)合的一種T細(xì)胞技術(shù)應(yīng)用于腫瘤免疫治療中已成為學(xué)術(shù)研究的主要焦點(diǎn)［1-2］。通過(guò)基因修飾使T細(xì)胞表達(dá)CAR，從而針對(duì)靶細(xì)胞進(jìn)行直接識(shí)別和殺傷，這項(xiàng)技術(shù)在血液腫瘤治療中取得了顯著效果［3-5］。

CART細(xì)胞治療常用的轉(zhuǎn)染方法有三種：電穿孔、基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶基因傳遞和慢病毒轉(zhuǎn)染［6］。電穿孔法效率最差；基于質(zhì)粒的轉(zhuǎn)座子/轉(zhuǎn)座酶基因傳遞法成本低，轉(zhuǎn)染效率僅次于慢病毒法［7］；慢病毒轉(zhuǎn)染效果最佳，但成本高［8］。

由于構(gòu)建不同CAR載體，轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)方式的不同，以及細(xì)胞株等因素影響，導(dǎo)致每一次轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染效率差異較大，對(duì)CART細(xì)胞功能研究造成嚴(yán)重的影響。故本研究擬構(gòu)建一種靶向程序性死亡配體1（programmed death-ligand 1，PDL1）的CAR慢病毒載體（抗PDL1-CAR），并采用非磁珠法進(jìn)行轉(zhuǎn)染和擴(kuò)增培養(yǎng)，并利用不同的病毒感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection， MOI）對(duì)T細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染，保證抗PDL1-CAR慢病毒轉(zhuǎn)染效率，從而優(yōu)化CART細(xì)胞最佳的轉(zhuǎn)染條件與培養(yǎng)方式，為CART細(xì)胞的功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人伯基特淋巴瘤CA46細(xì)胞株由福建省血液病研究所提供。本課題組在前期研究中，已將CD274基因慢病毒轉(zhuǎn)導(dǎo)到CA46細(xì)胞中得以產(chǎn)生表達(dá)PD L1和mCherry熒光蛋白的PDL1-CA46細(xì)胞，并使用含有5 mg/mL嘌呤霉素的10%胎牛白清培養(yǎng)基培養(yǎng)。293T細(xì)胞（購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司）為慢病毒的包裝細(xì)胞，按5×105個(gè)/mL的細(xì)胞密度接種于10 cm的培養(yǎng)皿中，加入含10% 胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。

1.2 工具載體酶切

帶有增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（enhanced green fluorescent protein， EGFP） 的質(zhì)粒GV401（購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司）結(jié)構(gòu)圖見(jiàn)圖1A，構(gòu)建 50 μL酶切體系：ddH2O 43μL，CutSmart Buffer 2.5μL，質(zhì)粒 DNA3μL，BamH I 1.5μL，混勻，37℃反應(yīng) 3 h。反應(yīng)后將產(chǎn)物電泳并回收目的條帶。

圖1 抗PDL1-CAR載體的設(shè)計(jì)與鑒定Figure 1.Design and Identification of the Anti-PDL1-CAR Vectors

1.3 獲取與擴(kuò)增抗PDL1-CAR基因片段

設(shè)計(jì)抗PDL1-CAR基因引物：上游5’-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTG-3’，下游3’-ATAAGCTTGATATCGAATTCTTAAACAACAGAGAAACGGGAGCGATAGGCTGCGAAGTCG-5’。建立PCR體系：5×PS Buffer 10μL， 上下游引物（10μM）各1μL，dNTP Mix 4μL， Prime STAR HS DNA 聚合酶 0.5μL，抗PDL1-CAR基因（上海生工合成）樣本1μL，ddH2O 32.5μL，共50μL。PCR循環(huán)條件：98℃加熱5 min；98℃ 10 s、56℃ 10 s、72℃ 90 s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸8 min，4℃保溫。PCR基因擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，110 V，電泳0.5 h。

1.4 抗PDL1-CAR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與載體重組和轉(zhuǎn)化

于冰浴中配制反應(yīng)體系，樣本組：ddH2O 3.5μL，5×CE II 緩沖液 2μL，酶切后載體DNA 2.5μL，抗PDL1-CAR基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物 1μL，Exnase TM II 1μL，共10μL。GAPDH對(duì)照組：ddH2O 2.5μL，5×CE II緩沖液 2μL，酶切后的載體 DNA 2.5μL，GAPDH基因2μL，Exnase TM II 1μL，共10μL?；靹蚝?7℃30 min，再冰浴 5 min 后立即轉(zhuǎn)化。將 5μL轉(zhuǎn)化產(chǎn)物與100 μL感受態(tài)混勻，冰上放置 30 min。 42℃熱激 90 s，冰育 5 min。再加入 450 μL LB 培養(yǎng)基，37℃搖床振蕩培養(yǎng)1 h。混合液均勻涂在平板上，倒置培養(yǎng)于37℃恒溫培養(yǎng)箱中12～16 h。 轉(zhuǎn)化后的樣本送往上海生工進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果用基因比對(duì)軟件DNA-MAN進(jìn)行分析比對(duì)。最后將測(cè)序陽(yáng)性的樣本提取質(zhì)粒。

1.5 轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物鑒定

目的基因引物：上游5’-CCACCCAATGCTAATGAAG-3’，下游3’-CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG-5’。建立反應(yīng)體系：ddH2O 8.2μL，轉(zhuǎn)化后陽(yáng)性樣本1μL，2× Taq Plus Master Mix 10μL，上下游引物（10 μM）各0.4μL，共20μL。PCR循環(huán)條件：95℃加熱3 min，1個(gè)循環(huán)；95℃30 s，55℃30 s，72℃90 s，32個(gè)循環(huán)；72℃延伸5 min，4℃保溫。PCR擴(kuò)增基因產(chǎn)物的凝膠電泳檢測(cè)：制2%濃度的瓊脂糖凝膠，取5μL的PCR產(chǎn)物，與1μL的EB混合后加入凝膠孔中，110 V，電泳0.5 h。

1.6 慢病毒的包裝與濃縮

配制體系： pHelper 1.0質(zhì)粒 15 μg，GV401質(zhì)粒20 μg， pHelper 2.0 質(zhì)粒10 μg，Lipo3000 22.5μL，用Opti-MEM將體積調(diào)整為 1 mL，加入293T細(xì)胞當(dāng)中，培養(yǎng)6 h后更換含 10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)48 h。收集293T細(xì)胞的上清液，過(guò)濾后25 000 rpm 4℃離心2.5 h，棄上清，加入200 μL的DMEM培養(yǎng)基，于-80℃保存?zhèn)溆?。慢病毒滴度檢測(cè)由上海吉?jiǎng)P基因科技有限公司通過(guò)qPCR絕對(duì)定量法和熒光法檢測(cè)完成，病毒滴度為2.07×105TU/μL。

1.7 抗PDL1-CAR細(xì)胞的轉(zhuǎn)染與培養(yǎng)

采用非磁珠法，每次收集50～100 mL健康志愿者的外周血，并同時(shí)告知和簽署科研知情同意書。通過(guò)連續(xù)密度梯度離心法從外周血中分離單個(gè)核細(xì)胞，在包被有抗CD3mAb和抗CD28mAb的6孔板中培養(yǎng)，加入IL-2（20 U/mL）。第2天， 取2 × 105個(gè)/孔的淋巴細(xì)胞于24孔培養(yǎng)板中，每孔體積為200 μL，按MOI= 10、20、40分別加入抗PDL1-CAR病毒載體10μL、20μL、40μL于24孔培養(yǎng)板中，IL-2（30 IU /mL），Histrnas P 10μL，transA 20μL。第4天， 去上清更換新鮮1640培養(yǎng)基，加IL-2（200 U/mL）。第8天，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞熒光表達(dá)情況，流式檢測(cè)抗PDL1-CAR細(xì)胞的陽(yáng)性率。并用Flowjo軟件對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析。

1.8 細(xì)胞毒性試驗(yàn)

按MOI = 20的條件轉(zhuǎn)染和培養(yǎng)效應(yīng)細(xì)胞，每孔取5×104個(gè)表達(dá)mCherry熒光的PDL1-CA46于24孔板中，按1∶1、2∶1、5∶1和10∶1的效靶比加入相應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞（CART細(xì)胞和T細(xì)胞）進(jìn)行混合共培養(yǎng)，每組重復(fù)3次。培養(yǎng)16 h后，先通過(guò)JIMBIO FIL檢測(cè)細(xì)胞總數(shù)，再加入AnnexinV 5μL，流式檢測(cè)儀檢測(cè)0 h和16 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率（Annexin V陰性mCherry陽(yáng)性）。殺傷率% = （1-細(xì)胞總數(shù)×16 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率/細(xì)胞總數(shù)×0 h PDL1-CA46細(xì)胞百分率）100%。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件分析兩獨(dú)立樣本均數(shù)，采用 MannWhitney U檢驗(yàn)比較兩組間差異，P ＜ 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抗PDL1-CAR載體的構(gòu)建

GV401載體經(jīng)酶切后電泳顯示PCR產(chǎn)物分子量約為10kb（圖1B）?？筆DL1-CAR目的基因片段經(jīng)電泳后顯示條帶的分子量為1.5 kb（圖1C）。與線性表達(dá)載體進(jìn)行重組和轉(zhuǎn)化后，含有目的基因片段的轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小為1 kb（圖1D），構(gòu)建出的慢病毒載體經(jīng)上海生工基因測(cè)序比對(duì)，與MEDI4736序列一致。

2.2 抗PDL1-CAR載體的結(jié)構(gòu)

抗PDL1-CAR載體結(jié)構(gòu)的胞外段是信號(hào)肽和抗PD-L1 單鏈抗體可變區(qū)片段，單鏈抗體可變區(qū)片段可結(jié)合腫瘤細(xì)胞表達(dá)的PD-L1，該片段是源自于MEDI4736的重鏈可變區(qū)VH和輕鏈可變區(qū)VL序列，跨膜區(qū)序列是CD8鉸鏈，胞內(nèi)段由4-1BB和CD3ζ信號(hào)區(qū)組成，EGFP連接于信號(hào)區(qū)末端（圖2A、2B）。構(gòu)建的抗PDL1-CAR載體轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞72 h后，在熒光顯微鏡下可以觀察到表達(dá)綠色熒光的細(xì)胞（圖2C）。

圖2 抗PDL1-CAR的構(gòu)建與表達(dá)Figure 2.Construction and Expression of Anti-PDL1-CAR

2.3 抗PDL1-CAR細(xì)胞的表達(dá)

淋巴細(xì)胞在活化后按MOI = 10、 20、 40的條件加入抗PDL1-CAR病毒，培養(yǎng)第8天進(jìn)行流式檢測(cè)，各組CART細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%（圖3A、B）。通過(guò)熒光顯微鏡檢測(cè)，可觀察到表達(dá)出綠色熒光的CART細(xì)胞（圖3C）。

圖3 抗PDL1-CAR不同MOI下的轉(zhuǎn)染效率Figure 3.Efficiency of Anti-PDL1-CART Cells with Different MOI

2.4 抗PDL1-CAR細(xì)胞殺傷性檢測(cè)

將PDL1-CA46腫瘤細(xì)胞按不同的效靶比與效應(yīng)細(xì)胞共培養(yǎng)16 h，在1∶1效靶比時(shí)，CART細(xì)胞和T細(xì)胞兩者對(duì)PDL1-CA46細(xì)胞殺傷率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -0.218， P = 0.827）。在2∶1、5∶1和10∶1效靶比時(shí)，CART 細(xì)胞對(duì)PDL1-CA46細(xì)胞殺傷率顯著高于T細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -1.964， P ＜ 0.05），且效靶比越高殺傷活性越強(qiáng)（圖4A），殘留的PDL1-CA46細(xì)胞越少（圖4B）。

圖4 抗PDL1-CART細(xì)胞的體外殺傷檢測(cè)Figure 4.Cytotoxicity of Anti-PDL1-CART Cells in Vitro

3 討 論

CART細(xì)胞利用胞外的嵌合受體與靶細(xì)胞結(jié)合，可以不受主要組織相容性復(fù)合體限制，直接激活T細(xì)胞，從而對(duì)靶細(xì)胞產(chǎn)生免疫應(yīng)答［9-10］。盡管CART細(xì)胞治療在臨床上已取得了一定的突破，但是CART細(xì)胞的構(gòu)建及其轉(zhuǎn)染培養(yǎng)仍然是影響CART細(xì)胞免疫治療的關(guān)鍵因素之一［11-13］。

本次研究構(gòu)建了一種新的抗PDL1-CAR慢病毒載體，其主要結(jié)構(gòu)由抗PDL1 scFv（胞外段）和胞內(nèi)的信號(hào)區(qū)（4-1BB和CD3ζ）組成，信號(hào)區(qū)末端協(xié)同表達(dá)一個(gè)EGFP，以便于在流式細(xì)胞儀和熒光顯微鏡下監(jiān)測(cè)抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉(zhuǎn)染情況［14-15］。

在慢病毒轉(zhuǎn)錄過(guò)程中，常常會(huì)由于構(gòu)建的載體不同，實(shí)驗(yàn)條件的差異，每一次構(gòu)建的慢病毒載體滴度不同和細(xì)胞株的差異等因素，導(dǎo)致每一次轉(zhuǎn)染后CART細(xì)胞的表達(dá)率也不相同，從而對(duì)接下來(lái)的CART功能研究產(chǎn)生許多不利的影響［16］。本課題組通過(guò)qPCR技術(shù)檢測(cè)抗PDL1-CAR慢病毒載體滴度，利用3種不同的MOI進(jìn)行抗PDL1-CAR慢病毒載體的轉(zhuǎn)染，通過(guò)流式和熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后抗PDL1-CAR細(xì)胞的表達(dá)率分別為28.80%±0.46%、54.77%±0.32%、71.37%±0.42%，每組MOI樣本都重復(fù)3次，重復(fù)誤差很小，從圖3結(jié)果可以看出MOI = 20或者40的轉(zhuǎn)染效率大于30%，在越高的效靶比下，CART細(xì)胞對(duì)PDL1-CA46細(xì)胞殺傷性越高，完全滿足后續(xù)CART細(xì)胞的功能研究，而且不用擔(dān)心重復(fù)轉(zhuǎn)染造成轉(zhuǎn)染效率結(jié)果的差異性。

CART細(xì)胞只有體外擴(kuò)增培養(yǎng)出足夠數(shù)量的效應(yīng)細(xì)胞，才有利于CART細(xì)胞功能研究和體內(nèi)回輸治療，目前最常用的CART細(xì)胞體外培養(yǎng)方式是磁珠刺激培養(yǎng)，Davila等［17］在研究中采用CD3/CD28磁珠刺激培養(yǎng)CD19-CART細(xì)胞，轉(zhuǎn)染效率達(dá)38.4%。通過(guò)加入CD3/CD28磁珠反復(fù)刺激培養(yǎng)可以將細(xì)胞體外培養(yǎng)超過(guò)60天，且擴(kuò)增數(shù)量達(dá)到109～1011［18］。采用磁珠方法效果雖好，但磁珠和相應(yīng)設(shè)備昂貴，成本高，操作復(fù)雜。非磁珠法CART細(xì)胞體外擴(kuò)增培養(yǎng)往往是通過(guò)培養(yǎng)瓶中包被抗CD3和CD28抗體來(lái)刺激細(xì)胞，并加入細(xì)胞因子進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，Gargett 等［19］研究發(fā)現(xiàn)，CD3/Retronectin/IL-2激活擴(kuò)增的GD1-iCART細(xì)胞低于CD3/CD28/IL-7/IL-15和CD3/CD28/IL-2，培養(yǎng)10～14天后細(xì)胞數(shù)量可擴(kuò)增至106～107。本次研究采用非磁珠法對(duì)CART細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并對(duì)此進(jìn)行優(yōu)化，培養(yǎng)出的抗PDL1-CAR細(xì)胞數(shù)量完全滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要，并且對(duì)表達(dá)PD-L1的血液腫瘤細(xì)胞CA46具有很強(qiáng)的殺傷性［20］。轉(zhuǎn)染效率高，且成本相對(duì)磁珠法低，操作簡(jiǎn)單，但體外細(xì)胞培養(yǎng)觀察中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞活性持續(xù)時(shí)間不長(zhǎng)，無(wú)法超過(guò)21天。

總之，本研究進(jìn)一步探索了CART細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能，為CART細(xì)胞的構(gòu)建提供良好參考，同時(shí)優(yōu)化CART細(xì)胞的轉(zhuǎn)染條件和培養(yǎng)方法，增加CART細(xì)胞的表達(dá)率和殺傷活性，為CART細(xì)胞的功能研究提供了基礎(chǔ)。

作者聲明：本文全部作者對(duì)于研究和撰寫的論文出現(xiàn)的不端行為承擔(dān)相應(yīng)責(zé)任；并承諾論文中涉及的原始圖片、數(shù)據(jù)資料等已按照有關(guān)規(guī)定保存，可接受核查。

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