姚協(xié)豐 徐建 朱凌麗 婁麗娜 劉廣 張曼 侯茜 徐錦華 羊杏平

摘 要：西甜瓜枯萎病、蔓枯病是設(shè)施生產(chǎn)中的防治難點，培育及推廣優(yōu)質(zhì)復(fù)合抗病新品種是生產(chǎn)上控制病害最為經(jīng)濟、環(huán)保、有效的手段。開展復(fù)合抗性育種研究，品種資源的復(fù)合抗病性鑒定是首要工作。但是目前尚無兩種病害抗性鑒定技術(shù)標準發(fā)布，為了提高品種資源復(fù)合抗性鑒定的效率、準確性、規(guī)范性，對枯萎病、蔓枯病病原菌的來源與擴繁，苗期活體接種和離體葉片接種結(jié)合方法，聯(lián)合抗病鑒定評價指標等進行技術(shù)總結(jié)，以規(guī)范西甜瓜品種（系）苗期抗枯萎病、蔓枯病的快速聯(lián)合鑒定技術(shù)方案。本研究方案克服了“以往單一接種效率低、周期長、耗費多，避免了傳統(tǒng)活體先后接種方法病害發(fā)病交互影響，病情指數(shù)偏高，易產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果”等缺點，為大批量初步篩選西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病復(fù)合抗性品種資源提供可參考的技術(shù)方法。為推動西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育種和種業(yè)提升提供技術(shù)保障。

關(guān)鍵詞：西瓜；甜瓜；枯萎??；蔓枯??；聯(lián)合抗性鑒定

基金項目：江蘇省重點研發(fā)計劃項目[BE2021364]；江蘇省種業(yè)振興揭榜掛帥項目[JBGS（2021）075，JBGS（2021）069]；國家西甜瓜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系項目（CARS-26-08）。

作者簡介：

姚協(xié)豐（1982-），男，江蘇蘇州人，博士，副研究員，主要從事西瓜甜瓜抗病育種與技術(shù)推廣。? E-mail：yaoxiefeng@jaas.ac.cn

*通信作者：徐錦華，男，研究員，主要從事西瓜甜瓜育種。

E-mail：jinhuaxu@jaas.ac.cn。

西瓜、甜瓜是重要的園藝經(jīng)濟作物，在我國蔬果生產(chǎn)、消費中占據(jù)了十分重要地位，在調(diào)整農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)和促進農(nóng)民增收致富等方面發(fā)揮顯著作用[1-2]。隨著西甜瓜設(shè)施栽培面積的不斷擴大及種植年限不斷增長，西甜瓜病害發(fā)生情況日益嚴重[2]。尖孢鐮刀菌（Fusarium? oxysporum）侵染引起的枯萎病和亞隔孢殼屬（Stagonosporopsis）危害引起的蔓枯病是西甜瓜生產(chǎn)上兩種主要病害[3-7]。目前設(shè)施栽培常年連作伴隨病菌量加大、高溫高濕等農(nóng)業(yè)生態(tài)條件惡化，導(dǎo)致病害高發(fā)、重發(fā)，生產(chǎn)上植株死亡率可達 30%～40%，嚴重可達80%以上[4，8-9]，已成為制約西甜瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要因素。

生產(chǎn)上發(fā)生西甜瓜枯萎病、蔓枯病后，仍以化學(xué)藥劑防治為主，長期使用化學(xué)農(nóng)藥易產(chǎn)生抗藥性、農(nóng)藥殘留和環(huán)境污染，使得西甜瓜枯萎病、蔓枯病等防治越發(fā)成為生產(chǎn)上的難點[4，10]。培育及推廣優(yōu)質(zhì)復(fù)合抗病西甜瓜新品種是控制枯萎病、蔓枯病最為環(huán)保、經(jīng)濟、有效的辦法[5，11，12]。然而開展復(fù)合抗性育種研究，品種資源對枯萎病和蔓枯病的復(fù)合抗病性鑒定是首要工作?？共⌒澡b定是抗病育種的基礎(chǔ)，而符合生產(chǎn)實際的抗病性鑒定技術(shù)方法又是抗病性鑒定的關(guān)鍵，制定出準確、快捷的復(fù)合鑒定技術(shù)，可提高抗病育種的準確性，加速抗病育種進程[13]?？剐云贩N與抗性鑒定方法結(jié)合，促進西甜瓜抗性品種的推廣與應(yīng)用。

目前國內(nèi)生產(chǎn)上尚無發(fā)布實施的關(guān)于西瓜甜瓜枯萎病、蔓枯病單獨或者兩種病害聯(lián)合抗性鑒定技術(shù)標準可參考，只有一些國內(nèi)外抗性鑒定方法的文獻報道，但是目前國內(nèi)外對西甜瓜枯萎病、蔓枯病的抗性鑒定方法多采用分株單一接種法，比如枯萎病苗期浸根接種、灌根接種、葉子刺傷接種[12，14-17]，以及通過苗期蔓枯病孢子懸浮液的噴霧接種、離體接種等[13，18]。分株單一接種法效率低、耗費種子等試驗材料多，且不同批次試驗不穩(wěn)定。也有少量報道枯萎病、蔓枯病復(fù)合接種，即都以活體先后接種枯萎病和蔓枯病菌[12，19]，然而目前的復(fù)合接種方法同時活體接種兩種病原菌，往往會造成病害發(fā)病交互影響，病情指數(shù)偏高，容易產(chǎn)生誤導(dǎo)性結(jié)果，而且由于枯萎病菌對感病植株是致命的，接種后基本全部死亡，無法同時進行其它多抗性苗期鑒定試驗，對感枯萎病材料如需鑒定蔓枯病等其它抗病性，后期仍需要進行不同批次的單獨接種試驗，導(dǎo)致傳統(tǒng)枯萎病和蔓枯病的雙重抗性鑒定不在同株同時鑒定的，影響結(jié)果一致性，拉長鑒定周期。因此為更加簡便、高效鑒定西瓜甜瓜品種（系）對枯萎病、蔓枯病抗性，針對當前單一接種為主的技術(shù)不足，亟需制定適合大量快速抗源篩選，能夠避免不同病害發(fā)病交互影響病情觀察和統(tǒng)計結(jié)果，且鑒定結(jié)果更快速準確的抗病性聯(lián)合鑒定技術(shù)規(guī)程。

本文建立了西甜瓜品種（系）枯萎病苗期活體和蔓枯病離體葉片聯(lián)合抗性接種鑒定技術(shù)方法，實現(xiàn)了同一植株同時鑒定枯萎病和蔓枯病兩種病害的抗性，縮短鑒定周期，避免病害交叉影響、提高鑒定穩(wěn)定性、節(jié)約試驗材料等，適合大量快速抗源篩選。以期為廣大西甜瓜科研育種及品種試驗推廣等單位和個人，提供可參考的快速聯(lián)合抗性鑒定技術(shù)規(guī)范。以推動西甜瓜抗枯萎病、蔓枯病育種，保障西瓜甜瓜種業(yè)提升。

1 試驗材料

1.1 鑒定品種（系）、對照品種選擇及育苗管理

1.1.1 鑒定品種（系）和對照品種：聯(lián)合抗性鑒定中除了所參鑒的西瓜、甜瓜品種（系），還可選一個感病對照和一個抗病對照。西瓜枯萎病抗病對照可采用高抗品種‘卡紅，感病對照可選用感病品種‘蘇蜜1號；甜瓜枯萎病抗病對照可選用‘長香玉，感病對照可選‘蘇甜二號。西瓜蔓枯病抗病對照可采用材料‘PI189225，感病對照可選用感病品種‘蘇蜜1號；甜瓜蔓枯病抗病對照可選用抗病材料‘PI200819，感病對照可選‘蘇甜4號。

1.1.2 育苗管理：鑒定品種（系）和對照品種在播種前將供試種子用10%次氯酸鈉溶液浸泡5min，流動清水沖洗去除表面殘留消毒液，種子放在鋪有吸水紙培養(yǎng)皿中，置30℃～32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)催芽。待種子露白后，播于50孔穴盤（泥炭∶蛭石∶珍珠巖=3∶1∶1混合基質(zhì)填裝）內(nèi)，每份材料種植25株，3次重復(fù)。育苗溫度保持在白天26±2℃，夜間16±2℃，待出苗長至3～5片真葉時的植株作為備用。 活體接種枯萎病菌后的西瓜甜瓜植株，定植于裝有滅菌育苗基質(zhì)的直徑為10cm的營養(yǎng)缽中，置于26±2℃的溫室培養(yǎng)管理，待后續(xù)病情觀察。

1.2 病原菌來源及擴繁

1.2.1 病原菌來源：尖孢鐮刀菌西瓜?；停‵usarium oxysporum（Schl.）f.sp.niveum（E.F.Smith）Snyder? &? Hansen）為害的西瓜枯萎病以生理小種1為優(yōu)勢小種，為此宜選用1號生理小種Race1。甜瓜枯萎病菌株用尖孢鐮刀菌甜瓜?；停‵usarium oxysporum（Schl.）f.sp.melonis（Leachet? currence）Snyder? et? Hansen）。蔓枯病菌株（Stagonosporopsis? citrulli.DBJSSY2[7]）采用從病田收集、分離，并經(jīng)致病性鑒定后所得的致病性強且穩(wěn)定的株系。

所有選用的病原菌系江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所分離、鑒定和保存的菌株。

1.2.2 病原菌孢子繁殖：枯萎病菌孢子懸浮液準備：參考耿麗華等[15]的方法，取西瓜枯萎病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖 20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g，水1000mL），26±2℃培養(yǎng)5天，再將培養(yǎng)好的枯萎病菌絲塊接種于馬鈴薯培養(yǎng)液（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，水1000mL），26±2℃，150r/min培養(yǎng)5～7天，4層紗布過濾后，加無菌蒸餾水稀釋，用血小球計數(shù)板計數(shù)，配制成濃度為5×105孢子/mL的孢子懸浮液備用。蔓枯病菌孢子懸浮液準備：參考Li等[7]方法誘導(dǎo)蔓枯病菌產(chǎn)生分生孢子。取蔓枯病病菌接種于馬鈴薯固體培養(yǎng)基（葡萄糖20g，馬鈴薯200g，瓊脂15g，水1000mL），26±2℃培養(yǎng)5～7天。選取新鮮無傷口的黃瓜經(jīng)流動水沖洗干凈后，75%酒精擦拭表面，晾干后，在黃瓜表面輕微削去小塊表皮，培養(yǎng)好的菌株用直徑0.7cm的滅菌打孔器打取菌絲塊，菌絲塊倒置于黃瓜傷口上，培養(yǎng)箱中26±2℃培養(yǎng)，5～7天后分生孢子產(chǎn)生，用刀片刮取，研磨，4層紗布過濾后，加無菌蒸餾水稀釋，用血小球計數(shù)板計數(shù)，配制成5×105孢子/mL的孢子懸浮液備用。

1.3 離體葉片準備

取直徑9cm的培養(yǎng)皿，底部鋪設(shè)用苯并咪唑植物保鮮水溶液（11.8mg/L）浸濕的濾紙，然后從之前準備的未接種枯萎病的健康植株上每株取1～2片真葉，放置于濾紙上，以備蔓枯病菌接種用。

2 枯萎病苗期活體蔓枯病離體葉片聯(lián)合接種方法

枯萎病苗期活體接種：將前期在穴盤中長至3～5片真葉的待用植株小心取出，根部用清水輕柔洗凈，吸水紙吸去多余滴水，然后在提前備好的枯萎病菌孢子懸浮液中浸5min，取出移栽于裝有滅菌基質(zhì)，直徑為10cm的營養(yǎng)缽中，置于26±2℃溫室培養(yǎng)，接種3天后開始統(tǒng)計病情。

蔓枯病離體葉片接種：將蔓枯菌孢子懸浮液（添加1% Tween? 80）均勻噴到準備好的同批次同植株離體葉片上，每個葉片約噴霧500μL，然后把培養(yǎng)皿置于光照培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)條件為：溫度26±2℃，光照周期16h光照/8h黑暗，相對濕度約90%，1天后觀察病情并統(tǒng)計數(shù)據(jù)。

3 病害調(diào)查與結(jié)果評價

3.1 枯萎病調(diào)查分級評價

接種枯萎病菌孢子液后3d開始記錄生長及病情，植株按接種后癥狀與病情分為6個級別標準[20]：0級：無病癥；1級：午間子葉萎蔫或部分子葉與真葉輕微萎蔫，夜間尚能恢復(fù)；2級：1個真葉萎蔫或子葉較重萎蔫；3級：子葉及60%以上真葉萎蔫，影響生長；4級：整株出現(xiàn)萎蔫，60%以上葉枯死，但是心葉仍存活；5級：整株嚴重萎蔫并枯死；其中，2級以下為抗病植株，3級以上為感病植株；根據(jù)公式（Ri（發(fā)病率）=100%×ni（發(fā)病植株數(shù)）/nt（總調(diào)查植株數(shù)）計算進行抗性評價。

結(jié)果分四個抗性等級（詳見表1），在感病對照發(fā)病率達80%以上，判定為鑒定有效，對植株發(fā)病數(shù)進行計數(shù)分析。

3.2? 蔓枯病調(diào)查分級評價

參考張永兵等[18]優(yōu)化蔓枯病的調(diào)查分級，依據(jù)離體葉片上病斑的大小進行分級，各病情分級標準如下：0級：葉片沒有病斑；1級：葉片病斑面積≤25%；2級：25%<葉片病斑面積≤50%；3級：50%<葉片病斑面積≤75%；4級：75%<葉片病斑面積≤100%。蔓枯病接種3d后離體葉片開始出現(xiàn)病斑癥狀，在感病對照病情指數(shù)達60.0以上時，判定為鑒定有效。調(diào)查結(jié)果按公式（2）計算病情指數(shù)（DI）。根據(jù)計算結(jié)果分為6個抗性等級（詳見表2）。

DI—病情指數(shù)；dc—相應(yīng)病級；nc—各病級病葉數(shù)；nt—總?cè)~片數(shù)。amax—最高病情分級值。

3.3? 西瓜品種枯萎病和蔓枯病苗期聯(lián)合抗性鑒定結(jié)果評價

由表3結(jié)果，根據(jù)枯萎病抗性評定標準，蘇蜜1號發(fā)病率為81.25%，鑒定為枯萎病感病品種，卡紅發(fā)病率為18.75%，鑒定為枯萎病高抗品種；利用西瓜苗離體葉片鑒定西瓜品種蔓枯抗性，蘇蜜1號病情指數(shù)為81.48，根據(jù)蔓枯病抗性評定標準為蔓枯病高感病品種，W7病情指數(shù)為39.81，為蔓枯病中抗品種。

鑒定結(jié)果表明，蘇蜜1號為枯萎病感病、蔓枯病高感病品種；卡紅為枯萎病高抗品種、蔓枯病感病品種，W7為蔓枯病中抗品種，與預(yù)期對照相應(yīng)抗病性符合。

4 注意事項

（1）枯萎病接種試驗主要需注意控制溫度條件，粗放的環(huán)境條件下，建議避開夏季高溫和冬季低溫，環(huán)境溫度宜控制在25℃～30℃，氣溫過高或過低都不利于枯萎病發(fā)病。（2）注意用于蔓枯病病菌產(chǎn)生分生孢子的黃瓜材料需要選擇新鮮的黃瓜果實。（3）用馬鈴薯液體培養(yǎng)液制備培養(yǎng)枯萎病菌孢子過程中，建議在培養(yǎng)液中加入鏈霉素等抗生素，防止細菌污染。（4）注意接種后每天都要定期觀察發(fā)病情況。

5 討論與結(jié)論

本鑒定技術(shù)方案對西甜瓜枯萎病、蔓枯病的病原菌種類、來源、擴繁、孢子液制備，同批同株苗期活體與離體葉片聯(lián)合抗病接種鑒定方法及評價指標進行系統(tǒng)性描述總結(jié)。該聯(lián)合鑒定技術(shù)方案將為抗枯萎病、抗蔓枯病的復(fù)合抗性種質(zhì)資源的篩選和品種選育提供技術(shù)輔助，該技術(shù)方案克服了之前的分株不同時的單一接種鑒定蔓枯病和枯萎病的抗病性，或者活體先后接種等方法的各自缺點[12，19]。比如以往活體先后接種后，枯萎病菌對感病植株是致命的，兩種病害接種相互影響病情，對感枯萎病材料如需繼續(xù)鑒定蔓枯病等其它抗病性，需要再次進行不同批次的單一接種試驗等缺點[13-14]，而本方案明確了蔓枯病采用離體葉片孢子懸浮液噴霧的接種方式，同時還優(yōu)化了蔓枯病的病情評價分級，而且實現(xiàn)在同批次同植株上同時鑒定兩種病害的抗性，提高效率，大大縮短了接種后所需等待時間。

本方案提供一種在同一植株同時鑒定西甜瓜枯萎病和蔓枯病抗性的可靠方法，避免了不同病害交叉侵染影響病情結(jié)果和不同批次試驗不穩(wěn)定問題。適合大量快速抗源篩選，縮短了周期，提高了鑒定效率，避免了錯選率，也節(jié)約了鑒定材料，更有利于在實際工作中推廣應(yīng)用。

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