武大偉，寧 莉

天津醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，天津 300211

1 前言

外泌體是天然的細(xì)胞外納米囊泡，通過攜帶諸如蛋白質(zhì)、微小RNA、mRNA、DNA和其他分子的生物活性物質(zhì)參與細(xì)胞間通訊［1-2］，因其體積?。ㄖ睆?0～100 nm），外泌體是個(gè)性化治療中很有前途的遞送載體［3］。由于尚未開發(fā)出人工外泌體合成方法，因此，有效、安全地從自然資源中大量獲取外泌體是當(dāng)下迫切的任務(wù)。外泌體可從各種生物體液中分離得到，如血漿、尿液、唾液、乳汁、羊水、腹水、腦脊液等。其中，乳汁是唯一可以量產(chǎn)的含有外泌體的生物液體。人乳外泌體于2007年首次描述。迄今為止，已從人、牛、豬、小袋鼠、駱駝、大鼠、馬、熊貓、綿羊和山羊奶中分離出外泌體［4］。牛奶外泌體被認(rèn)為是開發(fā)新的治療方法以治療包括癌癥在內(nèi)的各種疾病的最有希望的候選者。牛奶外泌體在癌癥治療的應(yīng)用中有兩個(gè)方向，分別是抗腫瘤藥物和治療性核酸的遞送。在使用細(xì)胞毒性劑和細(xì)胞抑制劑的過程中發(fā)生的各種副作用是尚未解決的癌癥化療問題。使用細(xì)胞抑制藥物不僅會導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞死亡，還會導(dǎo)致骨髓，皮膚，毛發(fā)，胃腸道上皮細(xì)胞等［5］死亡。有針對性的化療藥物輸送是化學(xué)療法中發(fā)生毒性作用的潛在解決方案［6］。外泌體可用作藥物傳遞系統(tǒng)，將治療性核酸的藥物載于表面，或使用電穿孔、超聲處理或配體“裝載”這些成分后攜帶于表面［7］。另一種方法是將外泌體與脂質(zhì)體融合，并摻入必要的內(nèi)容物以形成“嵌合”外泌體［8］。因此，本文就牛奶外泌體分離方法、生物成分分析及在癌癥治療中的應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

2 牛奶外泌體的分離

可以使用各種物理、物理化學(xué)和免疫學(xué)方法從牛奶中分離外泌體。在國際細(xì)胞外囊泡學(xué)會的指南中描述了有關(guān)外泌體分離和鑒定的一般性問題［9-10］。由于從單個(gè)人或動(dòng)物身上獲得的乳汁量可能會從毫升到升不等。因此，從乳汁樣品中分離外泌體的一般方法通常就是離心。首先，在600～1 000×g 的低速下進(jìn)行幾次連續(xù)離心，脫脂并沉淀細(xì)胞；然后在10 000～16 000×g 離心沉淀乳蛋白，最后在100 000～200 000×g［11］進(jìn)行一次或數(shù)次超速離心以分離外泌體。

超速離心或凝膠過濾分離人乳、牛乳和馬乳中外泌體的可能性已被證實(shí)。凝膠過濾不適合直接從大量牛奶中分離外泌體，它可從超濾和/或超離心后獲得的共分離蛋白質(zhì)制劑中純化樣品。連續(xù)的離心和超速離心后用0.22 μm過濾器進(jìn)行超濾不足以獲得純化的外泌體。然而，通過對超離心法獲得的沉淀物進(jìn)行凝膠過濾可以得到不摻雜共分離蛋白混合物的外泌體制劑。

3 牛奶外泌體的生物活性化合物

牛奶外泌體生物化學(xué)成分（包括蛋白質(zhì)、脂類和核酸）明顯影響治療分子的傳遞。在這方面，需要對牛奶外泌體中這些分子的含量進(jìn)行詳細(xì)分析，也稱為“外泌體學(xué)”（類似于基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)和其他組學(xué)技術(shù)）［12］。

3.1 牛奶外泌體蛋白質(zhì)

牛奶外泌體包含幾種參與其形成的蛋白質(zhì)：睪丸素控制膜融合，Rab GTPase與細(xì)胞骨架蛋白相互作用［13］，Alix和Tsg101 參與內(nèi)吞作用［14］。此外，牛奶外泌體所含的蛋白質(zhì)決定了它們生物學(xué)功能，即微小RNA的運(yùn)輸和對靶細(xì)胞的黏附（四跨膜蛋白CD9，CD63，CD81）。牛奶外泌體還包含例如在Wnt信號通路中出現(xiàn)的涉及信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞骨架蛋白（肌動(dòng)蛋白、微管蛋白、cofilin、熱激蛋白和分子）。嗜乳脂蛋白、乳黏附素和黃嘌呤脫氫酶是牛奶外泌體的特異性標(biāo)記物。根據(jù)不相容分泌機(jī)制，α-，β-和κ-酪蛋白和核糖體蛋白不可能存在于外泌體制劑中［15］，因此這些蛋白質(zhì)不是內(nèi)在成分，可以被視為牛奶外泌體的“陰性標(biāo)記物”。

3.2 牛奶外泌體核酸

外泌體RNA在腸內(nèi)低pH值和存在RNA酶的情況下是穩(wěn)定的。牛奶mRNA 主要集中在外泌體中，而microRNA（miRNA）集中在外泌體和上清液中。通過高通量測序（NGS）和微陣列技術(shù)分析牛奶外泌體的miRNA 含量。微陣列全球表達(dá)譜分析顯示，牛奶超速離心后，外泌體組分中有79 種不同miRNA，上清液中有91 種不同miRNA，有39 種miRNA 在兩種組分中均有出現(xiàn)。進(jìn)一步研究［16］表明，這些miRNA 在外泌體部分的表達(dá)水平明顯高于上清液。牛奶和牛奶外泌體不同的miRNA通常具有多個(gè)靶標(biāo)，并且在胎兒發(fā)育、細(xì)胞增殖、妊娠、免疫系統(tǒng)發(fā)育、炎癥、糖代謝、胰島素抵抗等許多過程中顯示出重要的作用［17］。

3.3 牛奶外泌體脂類

外泌體是由脂質(zhì)雙分子層圍成的囊泡。在這方面，無論是對親水分子（與表面蛋白結(jié)合）還是疏水分子（作為脂質(zhì)雙層的一部分），都可以在外泌體內(nèi)部和外部傳遞具有藥理意義的化合物。眾所周知，外泌體膜含有膽固醇、磷脂酰膽堿、磷脂酰肌醇、鞘磷脂和神經(jīng)酰胺；大多數(shù)磷脂酰膽堿和鞘脂已被證實(shí)位于外泌體膜的外層［18］。外泌體制劑在離心和超速離心分離過程中被脂滴、脂蛋白和其他顆粒污染的問題限制了固有的外泌體脂質(zhì)的研究。研究［19］表明，從細(xì)胞培養(yǎng)物中分離出的外泌體包含花生四烯酸、前列腺素、脂肪酸代謝酶和白三烯。因此，需要進(jìn)一步研究高純度外泌體制劑中的脂質(zhì)。脂質(zhì)體已廣泛用作靶向遞送載體已有40多年的歷史。脂質(zhì)體膜可以通過單克隆抗體、核酸適配體、蛋白質(zhì)和小分子進(jìn)行修飾以改善靶向性。改變天然外泌體膜的一種有前途的方法是將其與具有人工功能化脂質(zhì)的脂質(zhì)體融合。與脂質(zhì)體相比，聚合物納米粒子可能具有更高的穩(wěn)定性，但是在長期給藥的情況下，它們的生物相容性和安全性仍未解決［20］。牛奶外泌體的天然脂質(zhì)成分比人工脂質(zhì)體更具相容性且毒性更低［21］。為了提高由牛奶外泌體給藥的效率，需要對外泌體的脂質(zhì)組成（脂膜上的蛋白質(zhì)）進(jìn)行更深入的研究。修飾外泌體表面以靶向輸送和延長體內(nèi)半衰期是生物藥理學(xué)和生物醫(yī)學(xué)的一項(xiàng)重要任務(wù)［22］。

4 牛奶外泌體在癌癥治療中的藥物遞送

2016年，牛奶外泌體針對惡性腫瘤的靶向作用首次被證實(shí)。在治療體內(nèi)肺部腫瘤的細(xì)胞培養(yǎng)和異種移植中，載有藥物的外泌體顯示出比游離藥物更高的功效。牛奶外泌體表現(xiàn)出種間耐受性，無任何不良免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)。因此，證實(shí)了牛奶外泌體的多功能性，與攜帶負(fù)荷和達(dá)到靶向腫瘤的能力有關(guān)［23］。在用于輸送化療藥物紫杉醇的牛奶外泌體的研究中，證實(shí)了負(fù)載的外泌體的大小略有增加。同時(shí)，含有該藥物的外泌體在模擬胃腸道條件下也很穩(wěn)定，從而突出了它們適合口服藥物的遞送［24］。

南蛇藤素是一種植物來源的三萜類化合物，具有抗炎、抗增殖和抗腫瘤的活性［25-26］。然而，這種藥物的使用由于其低的生物利用度和毒性而受到高度限制。在非小細(xì)胞肺癌的異種移植模型中，載有南蛇藤素的牛奶外泌體與游離南蛇藤素相比具有較高的抗腫瘤活性。同時(shí)，通過牛奶外泌體遞送的南蛇藤素沒有表現(xiàn)出明顯的全身毒性［27］。在順鉑耐藥卵巢癌細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)中［28］，將基于漿果花青素的制劑裝載到牛奶外泌體中，顯著提高了藥物的抗增殖活性，這強(qiáng)調(diào)了外泌體封裝在各種抗腫瘤藥物使用中的前景。

在Clinicaltrials.gov上注冊的當(dāng)前試驗(yàn)中，還沒有一項(xiàng)將牛奶外泌體用作藥物遞送系統(tǒng)的研究。然而，研究［23］表明使用牛奶外泌體來遞送抗腫瘤藥物有助于提高治療的有效性并降低治療的毒性，這為將牛奶外泌體用于口服治療劑的應(yīng)用開辟了極好的前景。

5 牛奶外泌體核酸的生物活性及核酸向癌細(xì)胞的傳遞

牛乳中主要的miRNA miR-21 靶向p57Kip2，這是一種抑制前列腺癌細(xì)胞中周期蛋白依賴性激酶的因子。乳腺癌患者血清和腫瘤組織中miR-21水平升高。P57kip2基因敲低增強(qiáng)了磷酸肌醇3-激酶的腫瘤相關(guān)突變變異體誘導(dǎo)的增殖表型。在形態(tài)發(fā)生過程中，它從細(xì)胞停滯中釋放出乳腺上皮腺泡，表明乳腺miR-21 對腫瘤生長過程具有潛在的作用。

外泌體刺激健康的腸上皮細(xì)胞增殖，但不刺激腫瘤培養(yǎng)物。牛奶外泌體對健康細(xì)胞的孵育導(dǎo)致磷酸酶和緊張素同源物（PTEN）表達(dá)水平的降低，這是miR-148a 的主要靶標(biāo)，牛奶外泌體中也發(fā)現(xiàn)了miR-148a 的成分。在miR-148a 基因敲除細(xì)胞中，牛奶外泌體抑制DNMT1 的增殖和表達(dá)。

外泌體在細(xì)胞之間轉(zhuǎn)移mRNA 和miRNA 并隨后介導(dǎo)受體細(xì)胞中靶基因表達(dá)變化的能力也凸顯了它們傳遞外源性小干擾RNA（siRNA）的潛力。siRNA 是潛在的一種新療法。隨著對內(nèi)源性RNA干擾的了解不斷增加，將siRNA用作許多疾?。òú煌愋偷陌┌Y）基于核酸藥物的可能性正在增加。對siRNA 進(jìn)行化學(xué)修飾以供其傳遞是不成功的，在某些情況下，導(dǎo)致其生物活性的喪失并發(fā)生毒性效應(yīng)。聚合物納米顆粒、脂質(zhì)和脂質(zhì)體、多肽和合成納米載體被認(rèn)為是將siRNA遞送到細(xì)胞的替代選擇;目前最先進(jìn)的給藥系統(tǒng)是基于脂質(zhì)體的。然而，這些方法從未解決非特異性靶向和免疫應(yīng)答的問題。牛奶外泌體可以將內(nèi)源性RNA負(fù)載到受體細(xì)胞，并保持穩(wěn)定，抵抗降解。在肺癌細(xì)胞系和小鼠異種移植中，用siRNA 負(fù)載的外泌體干擾KRAS基因突變等位基因的劑量依賴性抗增殖活性被證實(shí)。

6 結(jié)語

與脂質(zhì)體和其他人造納米顆粒相比，牛奶外泌體用于藥物遞送的主要優(yōu)勢是更高的生物相容性，即較低的免疫原性和細(xì)胞毒性，這是由于外泌體的化學(xué)成分與細(xì)胞膜相似。牛奶外泌體攜帶的生物活性分子即使在消化道的惡劣條件下也保持穩(wěn)定，這使得使用牛奶外泌體運(yùn)送口服藥物成為可能。牛奶外泌體組成中各種miRNA的多樣性描述及其對受體細(xì)胞遺傳信息的影響，為外泌體在疾?。ㄓ绕涫悄[瘤性疾病）的基因治療中打開了廣闊的潛力。在藥物和生物活性分子的傳遞中起著至關(guān)重要作用的牛奶外泌體的脂質(zhì)成分，還沒有得到足夠的研究，因此，繼續(xù)進(jìn)一步研究牛奶外泌體的生物化學(xué)組成具有重要意義。