王云勝， 陳銀翠， 程在， 張錦， 張傳博

（貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴陽 550025）

絲狀真菌次生代謝產(chǎn)物具有極強的活性成分，是天然藥物分子的重要來源之一[1-3]，主要包括聚酮化合物（polyketide，PK）、肽類化合物（non ribosomal peptide，NRP）、PKS-NRPS 雜合類、萜類、生物堿類等[4?5]。近年來，隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，越來越多的絲狀真菌基因組被公布，研究者在眾多絲狀真菌基因組中發(fā)現(xiàn)了大量的次生代謝產(chǎn)物表達基因簇，這些基因常常在染色體上呈線性化排列。然而，絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物合成基因簇在常規(guī)實驗室培養(yǎng)條件下表達量極低或處于沉默狀態(tài)[6?7]，因而，發(fā)現(xiàn)新型結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物相對較少，仍有大量真菌次級代謝產(chǎn)物有待發(fā)現(xiàn)。

veA作為核心基因，參與絲狀真菌中次級代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控[8]，研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)巢曲霉中柄曲霉素和青霉素合成基因的表達均受到veA的控制[9]。研究中常采用過表達或敲除veA來調(diào)控次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的表達，進而激發(fā)真菌產(chǎn)生次生代謝產(chǎn)物的潛力，在Aspergillus oryzae中過表達veA，導(dǎo)致抗菌素類次級代謝產(chǎn)物Penicillin產(chǎn)量的顯著提高[10]；橘青霉中過表達veA導(dǎo)致降脂類物質(zhì)美伐他汀的產(chǎn)量提高了3倍[11]。

冠突散囊菌是茯磚茶中的優(yōu)勢益生菌，其豐富的胞外酶和次級代謝產(chǎn)物對茯磚茶獨特風(fēng)味和保健功效的形成有著巨大貢獻，具有極大的研究價值[12-14]。Ge 等[15]對冠突散囊菌的基因組測序分析表明，冠突散囊菌和其他絲狀真菌類似，基因組中有眾多的次生代謝產(chǎn)物合成基因簇，表明冠突散囊菌具有合成次生代謝產(chǎn)物的巨大潛力。然而，關(guān)于冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物合成與調(diào)控的研究較少，嚴重阻礙了深入挖掘和利用冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物的進程[16]。

在冠突散囊菌中，veA被認為對氧化脅迫、性別發(fā)育等生物學(xué)過程有著重要的調(diào)控作用[17]，然而，關(guān)于veA對冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物調(diào)控的報道較少?；诖耍狙芯渴褂脽o縫克隆及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法成功構(gòu)建了冠突散囊菌veA過表達突變株，并通過高效液相色譜技術(shù)（high performance liquid chromatography，HPLC）和轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)初步研究了veA對冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控作用，為深入挖掘和應(yīng)用冠突散囊菌新穎結(jié)構(gòu)的次級代謝產(chǎn)物提供新的見解和方法。

1 材料與方法

1.1 菌株

冠突散囊菌（Eurotium cristatum）GZ06 分離于貴州出產(chǎn)的黑茶，保存于貴州師范大學(xué)微生物資源與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用研究實驗室。大腸桿菌感受態(tài)細胞Stbl3、農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞 AGL1 均購自武漢源葉生物技術(shù)有限公司。過表達載體pCAMBIA1303-TrpC-Hygro-gpdA-GFP 購自豐暉生物科技有限公司。

1.2 試劑

Eastep?Super總RNA 提取試劑盒購自上海普洛麥格生物有限公司；FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix、高保真DNA聚合酶購自天根生化拜爾有限公司；dNTPs 購自Taraka；無縫克隆試劑盒購自諾唯贊生物有限公司；膠回收試劑盒和質(zhì)粒提取試劑盒購自O(shè)MEGA 公司；實時熒光定量PCR 試劑盒購自康潤生物有限公司；限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、BstEⅡ、潮霉素B 溶液、氨芐卡那霉素、DEPC 水、乙酰丁香酮、二甲亞砜、頭孢噻肟鈉、2-（N-嗎啉代）乙烷磺酸一水等試劑、PCR 引物均由上海生工生物有限公司提供。

1.3 試驗儀器

主要試驗儀器包括電熱恒溫培養(yǎng)箱（DH600 H，天津市泰斯特儀器有限公司）、PCR 擴增儀（ETC 811，東勝創(chuàng)新生物科技有限公司）、酶標儀（EPOCH2，BioTEK）；電泳儀（DYCP-31DN，北京六一生物科技有限公司）和實時熒光定量PCR 儀（QuantStudio3，ABI）。

1.4 試驗方法

1.4.1冠突散囊菌分生孢子液的制備 參照Wang 等[18]試驗方法，將冠突散囊菌接種在高滲的MYA 培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)10 d 后，用無菌水沖洗分生孢子，使用血球計數(shù)板將冠突散囊菌孢子液濃度稀釋為1×106cell·mL?1備用。

1.4.2veA的擴增及過表達載體的構(gòu)建 將3 mL冠突散囊菌孢子液接種于150 mL PDB 液體培養(yǎng)基，30 ℃、180 r·min?1震蕩培養(yǎng)3 d，過濾收集菌絲，參照植物總RNA 提取試劑盒說明書提取總RNA。 獲得總RNA 后，使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix 試劑盒反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，參照無縫克隆試劑盒說明書和已經(jīng)公布的冠突散囊菌veA的序列信息[17]，使用BstEⅡ和BglⅡ限制性核酸內(nèi)切酶對載體線性化，并設(shè)計veAF/veAR引物（表1），以cDNA 為模板進行擴增，片段經(jīng)回收純化后，構(gòu)建gpdA-veA-Trpc 過表達元件并轉(zhuǎn)入大腸桿菌Stbl3，載體序列經(jīng)測序驗證。

表1 本研究使用的引物Table 1 Primers used in this study

1.4.3轉(zhuǎn)化 參照劉逸梅[19]的方法將過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1。農(nóng)桿菌侵染冠突散囊菌實驗參照朱思遠等[20]的方法。

1.4.4陽性轉(zhuǎn)化子鑒定 將野生型冠突散囊菌（WT）和過表達veA突變株（OE::veA1）接種到PDA平板上（含75 μg·mL?1潮霉素），28 ℃培養(yǎng)，觀察能否正常生長。同時提取野生型冠突散囊菌和過表達突變株的總RNA，反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA 后使用RT-qPCR 驗證veA相對表達量。參照SYBR Green PCR MasterMix 試劑盒說明書，以QveAF/QveAR 為實時熒光定量PCR 引物（表1），以GAPDH（甘油醛-3-磷酸脫氫酶）為內(nèi)參基因[21?22]。在冰上配置體系：cDNA 模板1 μL；QveAF 引物0.5μL，QveAR 引物0.5 μL；2×RealStar Green Fast Mixture 10 μL；用RNase-Free H2O 補足20 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性2 min；95 ℃變性15 s，60 ℃延伸30 s，40 個循環(huán)。使用2-??Ct法[15]計算基因的相對轉(zhuǎn)錄水平，試驗設(shè)置3個重復(fù)。

1.4.5發(fā)酵產(chǎn)物的提取與檢測 參照杜靜[23]的試驗方法，將等量野生型冠突散囊菌和過表達突變株的分生孢子液接種于大米培養(yǎng)基，28 ℃黑暗培養(yǎng)10 d。發(fā)酵結(jié)束后準確稱取10 g 發(fā)酵產(chǎn)物，使用醇提法進行提取并制備成浸膏。加入10 mL 50%的甲醇溶液充分溶解并過0.22 μm 尼龍濾膜制備成HPLC待測樣品。檢測條件參照王琪琪[24]試驗方法略有改動。色譜條件：Agilent-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱；檢測波長254 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；流速0.5 mL·min?1。流動相：純水∶乙腈= 3∶7（體積比）。

1.4.5轉(zhuǎn)錄組測序 將3 mL 等量的野生型冠突散囊菌（WT）和過表達突變株的分生孢子液接種于PDB（150 mL）培養(yǎng)基，28 ℃震蕩培養(yǎng)3 d。過濾收集菌絲后，用液氮快速將菌絲體研磨成粉末，使用TRIzol?Reagent kit（Invitrogen)提取總RNA，用NanoDrop 2000 分光光度計檢測提取RNA 的質(zhì)量和含量。利用Oligo (dT)引物和mRNA 的poly A 進行互補A-T 配對，分離總mRNA 后，使用Illumina TruseqTMRNA sample prep Kit 方法構(gòu)建文庫并完成測序工作。數(shù)據(jù)下機后，對原始序列（raw reads）的進行質(zhì)控，然后得到質(zhì)控數(shù)據(jù)（clean reads）。 將得到的clean reads 與冠突曲霉（GCA001717485.1）基因組進行比對組裝。采用表達定量軟件RSEM 定量分析基因和轉(zhuǎn)錄本的表達水平，使用DESeq2 軟件篩選差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs），篩選標準：差異倍數(shù)（fold change，F(xiàn)C） > 1.5 且P值<0.05。獲得DEGs 后，基于GO 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進行注釋，并基于KEGG 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進行通路富集分析。為進一步分析過表達veA對冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物基因簇的影響，使用antiSMASH 在線軟件對轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中預(yù)測為編碼次級代謝產(chǎn)物的基因進行注釋和分析。相關(guān)測序原始數(shù)據(jù)已提交至美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information，NCBI）的SRA 數(shù)據(jù)庫，登錄號為PRJNA809521。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2021 對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，采用t檢驗對組間差異進行顯著性分析。采用GraphPad Prism 8.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 veA過表達突變株的構(gòu)建

以冠突散囊菌cDNA 為模板擴增veA的開放式閱讀框，使用無縫克隆技術(shù)構(gòu)建veA過表達載體。將測序正確的veA過表達載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)AGL1，經(jīng)潮霉素抗性PDA 平板和veA的相對表達量檢測（圖1）表明，過表達突變株（OE::veA1）在潮霉素抗性PDA 平板上能正常生長，且veA的相對表達量極顯著高于野生型，由此表明，過表達突變株構(gòu)建成功。

圖1 veA過表達突變株的鑒定Fig. 1 Screening of veA overexpression mutant

2.2 高效液相色譜分析代謝成分差異

野生型冠突散囊菌（WT）和過表達突變株（OE::veA1）的高效液相色譜圖譜具有較大差異（圖2）。相較于WT，OE::veA1 中物質(zhì)吸收峰1 的相對峰面積提高了4.09 倍。且物質(zhì)吸收峰2、3 和4 在野生型冠突散囊菌中未檢測到。由此說明，過表達veA基因可能激活了冠突散囊菌中某些次級代謝產(chǎn)物合成基因簇，產(chǎn)生了新的次級代謝化合物。

圖2 野生型冠突散囊菌和OE：：veA1發(fā)酵產(chǎn)物的HPLC圖譜Fig. 2 HPLC chromatograms of fermentative products of wildtype E. cristatus and OE：：veA1 mutant

2.3 轉(zhuǎn)錄組測序質(zhì)量評估

對野生型（CK）和過表達veA突變株（OE::veA1）進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲得原始數(shù)據(jù)（raw reads） 337 234 764 條；質(zhì)控后，獲得clean reads 共334 959 602 條；各樣本錯配率均低于0.05%（表2），說明測序結(jié)果良好。此外，序列質(zhì)控參數(shù)Q20和Q30均達95%以上，說明測序質(zhì)量較高，可用于后續(xù)分析。

表2 轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)統(tǒng)計Table 2 Transcriptome sequencing data statistics

2.4 差異表達基因分析

2.4.1差異表達基因統(tǒng)計 以TPM 為表達量指標，使用DESeq2 軟件篩選DEGs。在WT 和OE::veA1 組中共篩選出737 個DEGs，其中，282 個顯著上調(diào)表達；455個顯著下調(diào)表達（圖3）。

圖3 野生型與過表達突變株的差異表達基因Fig. 3 Differentially expressed genes between WT and OE：：veA1

2.4.2DEGs 的GO 注釋 進一步使用GO 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進行注釋，結(jié)果（圖4）表明，GO 功能注釋主要包括生物過程、細胞組分和分子功能3大類。其中，在生物過程大類中，DEGs 主要涉及細胞過程（24.29%）、代謝過程（22.25%）、定位（9.91%）和生物調(diào)控（8.41%）；在細胞組分大類中，DEGs 主要涉及膜部分（30.39%）、細胞部分（20.08%）和細胞器（10.31%）；在分子功能大類中，主要涉及催化活性（44.23%）和結(jié)合（39.76%）。

圖4 DEGs的GO注釋分類Fig. 4 GO annotation classification of DEGs

2.4.3差異基因KEGG 富集分析 使用KEGG 數(shù)據(jù)庫對DEGs 進行通路富集分析（圖5），結(jié)果表明，氮代謝、MAPK 信號途徑、多種氨基酸代謝及乙醛酸和二羧酸代謝等通路均有富集。其中，萜類化合物合成骨架通路中有4 個基因（SI65_09721、SI65_05138、SI65_07629 和SI65_08119）被富集且均顯著上調(diào)表達，分別被注釋為聚戊烯基合成酶、異戊二烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶、聚戊烯基合成酶和法尼基焦磷酸合成酶。由此表明，過表達veA可能激活了冠突散囊菌萜類化合物的合成通路。

圖5 DEGs的KEGG富集氣泡圖Fig. 5 KEGG enrichment bubble diagram of DEGs

圖6 冠突散囊菌中次級代謝產(chǎn)物合成基因簇差異表達基因統(tǒng)計Fig. 6 Statistics of differentially expressed genes of secondary metabolite synthesis gene cluster in E. cristatus

2.5 基于antiSMASH 注釋相關(guān)次級代謝產(chǎn)物合成基因的表達

基于antiSMASH軟件對相關(guān)次級代謝產(chǎn)物合成基因進行預(yù)測分析，結(jié)果表明，共注釋到37個基因簇545個次級代謝產(chǎn)物相關(guān)合成基因，其中，顯著上調(diào)表達的基因15個，顯著下調(diào)表達的基因43個，占全部基因的10.64%。在基因簇32中，有9個差異表達基因，占該基因簇的50%，經(jīng)預(yù)測該基因簇編碼的次級代謝產(chǎn)物類型為Ⅰ型PKS類。進一步對該基因簇進行功能和表達量注釋，結(jié)果（表3）表明，顯著上調(diào)表達的基因多與次級代謝產(chǎn)物修飾相關(guān)，包括氧化還原酶類（SI65_05762 和SI65_05772）、甲基轉(zhuǎn)移酶（SI65_05767）、內(nèi)酰胺酶（SI65_05769）、乙?；D(zhuǎn)移酶（SI65_05773）和細胞色素P450單加氧酶（SI65_05771）。

表3 次級代謝產(chǎn)物基因簇32中基因差異表達及功能注釋Table 3 Gene expression and functional annotation in secondary metabolite gene cluster 32

3 討論

目前，基于分子水平對冠突散囊菌的研究主要側(cè)重于性別發(fā)育調(diào)控機制[17?18,21?22,25]，Tan 等[17]研究表明，veA對冠突散囊菌性別發(fā)育及氧化脅迫起調(diào)控作用。然而，veA作為全局性調(diào)控因子，對于絲狀真菌次級代謝產(chǎn)物合成基因簇的調(diào)控也有著重要作用，本研究借助農(nóng)桿菌AGL1 轉(zhuǎn)化系統(tǒng)成功構(gòu)建了veA過表達突變株，表明根癌農(nóng)桿菌AGL1 同樣適用于侵染轉(zhuǎn)化冠突散囊菌，拓寬了冠突散囊菌分子轉(zhuǎn)化的實驗手段和材料。

本研究從過表達veA基因突變株的發(fā)酵產(chǎn)物中檢測到3 種新的化合物，且發(fā)現(xiàn)多種代謝物含量與野生型存在顯著差異，表明過表達veA基因可能導(dǎo)致冠突散囊菌產(chǎn)生了某些新的次級代謝產(chǎn)物，進一步說明，veA作為全局性調(diào)節(jié)因子，可能也參與了冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物合成的調(diào)控，與前人研究結(jié)果一致[9?11]。轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果也表明，過表達veA基因突變株的基因表達譜與野生型有較大差異，共篩選到737 個DEGs。DEGs 注釋多與催化活性、膜相關(guān)和代謝調(diào)控等過程相關(guān)。在Beauveria bassiana中敲除veA導(dǎo)致膜相關(guān)、催化活性、氧化還原酶活性和膜運輸?shù)瘸煞值母患痆26]，與本研究結(jié)果一致，說明veA在不同菌株中的調(diào)控作用具有一定的保守性和相似性。

DEGs 的通路富集結(jié)果表明氮代謝、MAPK 信號途徑、多種氨基酸代謝及乙醛酸和二羧酸代謝等通路均有富集。在冠突散囊菌veA敲除菌株的蛋白組學(xué)研究中，10.4%的差異表達蛋白富集于氨基酸代謝通路[27]，與本研究結(jié)果一致，進一步說明veA基因可能對冠突散囊菌氨基酸代謝等通路起著重要調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，veA過表達突變株中，涉及萜類化合物骨架代謝通路的2 個編碼聚戊烯基合成酶基因及異戊二烯基二磷酸δ-異構(gòu)酶基因和法尼基焦磷酸合成酶基因的表達均顯著上調(diào)，說明過表達veA可能激活了冠突散囊菌中萜類化合物合成基因簇的表達，萜類化合物是一類重要的代謝產(chǎn)物，具有抗菌、抗腫瘤和抗氧化等生物學(xué)活性，極具研究價值[28?29]。

基于antiSMASH 對轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行注釋，結(jié)果表明，過表達veA導(dǎo)致了冠突散囊菌基因組中約10.64%的次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達發(fā)生顯著變化，說明過表達veA可能激活了冠突散囊菌次生代謝產(chǎn)物的合成。Cary 等[30]對黃曲霉的研究表明，56個次級代謝產(chǎn)物基因簇中有28個基因簇的表達與veA相關(guān)。張夢薇[31]研究了過表達veA對黑曲霉轉(zhuǎn)錄水平的影響，發(fā)現(xiàn)黑曲霉中次生代謝產(chǎn)物基因簇中32 個核心基因的表達均受到了影響，與本研究結(jié)果一致。本研究發(fā)現(xiàn)，次級代謝產(chǎn)物基因簇32 中多個與次級代謝產(chǎn)物合成相關(guān)基因的表達顯著上調(diào)，包括1 個核心骨架基因細胞色素P450單加氧酶基因，該酶被認為參與了多種代謝產(chǎn)物的合成和結(jié)構(gòu)修飾，如萜類化合物、甾醇以及生物堿類化合物等[28]。蒽酮類次生代謝產(chǎn)物含量的顯著提高同樣被認為與Cytochrome P450 的表達有關(guān)[32]。由此推斷，過表達veA可能激活了以Cytochrome P450 為代表的次級代謝產(chǎn)物合成過程中關(guān)鍵酶基因的表達。

綜上所述，本研究為冠突散囊菌次級代謝產(chǎn)物的進一步開發(fā)和利用提供了新的見解和理論依據(jù)，后期可運用多種分離純化手段和核磁共振等技術(shù)對過表達veA突變株的代謝圖譜和差異化合物進行分離檢測，以期發(fā)現(xiàn)具有新穎結(jié)構(gòu)和功能的次級代謝產(chǎn)物。