朱瑩雪， 王琪， 馬獻(xiàn)發(fā)*， 焦玉生， 高金旭， 毛衛(wèi)佳，付佳， 孫雪崠， 元野

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院，哈爾濱 150030； 2.中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所，哈爾濱 150076； 3.黑龍江省煙草公司牡丹江煙葉公司，黑龍江 牡丹江 157011； 4.中國煙草總公司黑龍江省公司，哈爾濱 150001； 5.牡丹江煙葉公司勃利分公司，黑龍江 七臺河 154500）

氮素是烤煙生長過程中的必需營養(yǎng)元素之一，施氮量過多或過少都會對煙葉的品質(zhì)和產(chǎn)量產(chǎn)生不利影響，適宜的施氮水平和施肥時期是保證煙葉品質(zhì)及產(chǎn)量的關(guān)鍵。因此，如何快速簡便地進(jìn)行氮素營養(yǎng)診斷是指導(dǎo)烤煙田間管理的當(dāng)務(wù)之急?？緹煹貭I養(yǎng)診斷的方法主要包括常規(guī)化學(xué)分析法、葉綠素儀法和高光譜技術(shù)。常規(guī)化學(xué)分析法需在實驗室進(jìn)行，且其前處理和分析過程均較為繁瑣，時效性差。葉綠素可通過葉綠素儀對葉片SPAD 值的檢測間接反映煙葉全氮含量，雖然方便在田間使用且無需采集煙葉，但葉綠素儀價格昂貴，且農(nóng)戶無法得知確切的全氮含量。高光譜技術(shù)能反映植物的物理結(jié)構(gòu)和化學(xué)成分等內(nèi)在品質(zhì)[1]，無需采集煙葉就可估測煙葉全氮含量，但需要專業(yè)儀器，成本較高且操作繁瑣[2]。顏色特征值法是氮素營養(yǎng)診斷的新方法，該法利用紅色（red，R）、綠色（green，G）、藍(lán)色（blue，B）、亮度（lightness，L）特征值構(gòu)建葉片氮素含量診斷模型，并將模型應(yīng)用于智慧農(nóng)業(yè)，可實現(xiàn)快速簡便的氮素營養(yǎng)診斷。顏色特征值主要由構(gòu)成各種色彩的3 個原色R、G、B 組成,可通過數(shù)碼相機(jī)及智能手機(jī)等便攜電子設(shè)備記錄待測葉片顏色特征，并將顏色的深淺轉(zhuǎn)換為數(shù)字[3]，從而快速準(zhǔn)確地讀取圖像中包含的顏色信息[4]。植物葉片顏色由葉片細(xì)胞內(nèi)色素（葉綠素、胡蘿卜素等）的相對含量決定，因而，前人研究了烤煙葉片顏色特征與質(zhì)體色素的關(guān)系及其估算模型。徐光輝等[5]利用顏色特征值和葉綠素含量構(gòu)建煙葉成熟期葉綠素含量估算模型，模型的估算值與實測值呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)。靳雙珍等[6]發(fā)現(xiàn)，顏色特征值與烤煙質(zhì)體色素含量和多酚類物質(zhì)含量之間存在相關(guān)關(guān)系，如顏色特征值正面L 與烤煙β 胡蘿卜素含量呈負(fù)相關(guān)，與葉黃素含量呈正相關(guān)；背面黃度（yellow，Y）與烤煙蕓香苷含量呈負(fù)相關(guān)[7]，因此，在實際生產(chǎn)中可利用顏色特征值對烤煙質(zhì)體色素和多酚類物質(zhì)含量的高低進(jìn)行判斷。研究發(fā)現(xiàn)，將R、G、B顏色坐標(biāo)轉(zhuǎn)換成孟塞爾顏色系統(tǒng)后，可用于烤煙的自動分級[8]，以減少人為因素的誤差。Zhi 等[9]構(gòu)建彩色圖表系統(tǒng)（color chart system，CCS），通過配備電荷耦合器件圖像傳感器（charge coupled device，CCD）精確提取煙葉顏色，利用比例閾值法構(gòu)建HSV（hue，色調(diào)；saturation，飽和度；value，明度）顏色值與RGB 顏色值的轉(zhuǎn)換公式來提高煙葉顏色圖的準(zhǔn)確性，使評價者對不同地區(qū)煙葉的顏色鑒別能力提高了30%以上。利用顏色特征值分析植物葉片含氮量及葉綠素含量的研究已在大豆、番茄、苧麻等作物上廣泛應(yīng)用[10-12]。除此之外，通過RGB 圖像構(gòu)建模型還可用于測量葉片含水量[13]、估算微藻生物量[14]、預(yù)測作物產(chǎn)量[15]，由此表明，利用RGB 顏色系統(tǒng)構(gòu)建相關(guān)模型是切實可行的。以葉片顏色特征值R、G、B、L與氮素含量的關(guān)系模型檢測烤煙的氮素盈缺狀況可以為未來智慧農(nóng)業(yè)提供技術(shù)支持。目前，關(guān)于烤煙葉片顏色特征值主要集中在葉片葉綠素、品質(zhì)分級方面，而利用葉片顏色特征值對烤煙葉片進(jìn)行氮素診斷的深入研究尚未見報道。因此，本文通過研究煙葉顏色特征值、全氮含量及煙葉SPAD 值對氮肥響應(yīng)變化特征，明確與煙葉全氮含量顯著相關(guān)的顏色特征參數(shù)，建立RGB 顏色特征值與煙葉全氮含量之間的診斷模型，為烤煙生長期的氮素營養(yǎng)診斷及未來智慧農(nóng)業(yè)發(fā)展提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地點

試驗地在中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所試驗場（44.382 7° N，129.472 8° E），海拔277.34 m，屬中溫帶濕潤季風(fēng)氣候區(qū)，土壤類型為黑土，土壤基礎(chǔ)肥力如表1所示。

表1 土壤基礎(chǔ)肥力Table 1 Soil basic fertility

1.2 試驗設(shè)計

烤煙品種為‘龍煙911’，采用苗棚育苗，于7葉齡移栽到大田。供試氮肥為硝酸銨（N，34%），磷肥為重過磷酸鈣（P2O5，46%），鉀肥為硫酸鉀（K2O，50%）。試驗共設(shè)置7 個施氮量處理，每處理3 次重復(fù)。其中部分氮肥于移栽前作為基肥施入，剩余氮肥于移栽后作為追肥施入，如表2 所示。各處理磷鉀肥施用量一致，其中重過磷酸鈣150 kg·hm?2，硫酸鉀270 kg·hm?2，均作為基肥于移栽前施入。株距0.5 m，行距1.1 m，壟長6.0 m，小區(qū)面積39.6 m2（6壟）。

表2 各處理施肥量Table 2 Rate of fertilization of different treatments

1.3 樣品的采集及測定

1.3.1樣品的采集 在烤煙團(tuán)棵期（移栽后35 d）及旺長期（移栽后55 d），每個小區(qū)隨機(jī)選取5 株烤煙，分別采集上部葉片（從根部開始第8~9 片葉）、中部葉片（從根部開始第5~7片葉）和下部葉片（從根部開始第3~4 片葉）。煙葉掃描圖像后，用于全氮含量的測定。

1.3.2烤煙葉片全氮含量的測定 將采集的煙葉置于烘箱中105 ℃殺青30 min，65 ℃烘干至恒重，粉碎、過0.25 mm篩后密封保存,采用H2SO4-H2O2消煮的奈氏比色法[16]測定煙葉全氮（total nitrogen，TN）含量。

1.3.3烤煙葉片SPAD 值的測定 在烤煙團(tuán)棵期及旺長期，隨機(jī)在每小區(qū)選取代表平均長勢的10 株烤煙，分別選取下部葉、中部葉及上部葉，利用便攜式葉綠素儀SPAD-502測定每片葉片頂部、中部、基部的SPAD值，取平均值。

1.3.4煙葉圖片的獲取與顏色特征值的提取 煙葉圖像利用掃描儀（Cano Scan 9000F）數(shù)字化成像，逐個掃描葉片正面顏色，圖像分辨率大小為2 550×3 504 像素，存儲格式為JPG 格式。采用Adobe Photoshop 7.0 圖形軟件進(jìn)行圖像分析并提取顏色特征值。通過工具面板的魔術(shù)棒工具選擇所需要的葉片部分，然后再選擇“窗口”中的直方圖程序讀取R、G、B 和L的圖像均值[17]。若煙葉幅面大于掃描儀最大幅面時，分幅掃描、存儲，取其相應(yīng)特征值的平均值。

1.3.5數(shù)據(jù)的選取 將測定的顏色特征值和煙葉全氮含量分為2 組，其中1 組樣本（n=42）用于分析建模；另1組樣本（n=21）用于檢驗。

1.4 建模方法

煙葉全氮含量與顏色特征值建模采用多元逐步回歸分析，方程如下。

式中,X1，X2，…XP代表顏色特征參數(shù)，ε為參數(shù)。若有n組樣本，則公式（1）會形成矩陣，如式（2）所示。n組樣本分別是（Xi1,Xi2, ...XiP,yi), (i=1, 2, ...,n)，形成矩陣如下。

根據(jù)式（2）得出多元線性逐步回歸方程。

式中，β代表斜率。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2007 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行方差分析，利用Duncans 法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同施氮量對烤煙葉片全氮含量的影響

由圖1 可知，團(tuán)棵期各部位葉片的全氮含量均高于旺長期，且團(tuán)棵期和旺長期葉片全氮含量均表現(xiàn)出上部葉片>中部葉片>下部葉片。其中，在團(tuán)棵期，僅上部和中部葉片的全氮含量在處理間存在顯著差異；在旺長期，各部位葉片在不同處理間均存在顯著差異。由此表明，不同施氮量處理對旺長期的葉片全氮含量影響較大。

圖1 不同處理下各部位葉片在團(tuán)棵期和旺長期的全氮含量Fig. 1 Total nitrogen content of leaf under different treatments in rosette and fast growing periods

2.2 不同施氮量對烤煙葉片顏色特征值的影響

由圖2 可知，顏色特征值B 的上下邊緣相距較近，數(shù)據(jù)最大值與最小值間的差值較小，說明數(shù)據(jù)較為集中，離散程度小，對不同施氮量變化不敏感；而顏色特征值R、G、L 的上下邊緣相距較遠(yuǎn)，數(shù)據(jù)最大值與最小值間的差值較大，離散程度較大，且顏色特征值的中位數(shù)均靠近上部，說明顏色特征值R、G、L 對氮素含量的變化較為敏感，其中顏色特征值G的數(shù)值最大。

圖2 顏色特征值箱形圖Fig. 2 Box-plot of color characteristic value

2.3 煙葉全氮含量、SPAD 值及顏色特征值之間的關(guān)系

2.3.1煙葉全氮含量與SPAD 值關(guān)系 SPAD 值可以反映葉片的葉綠素含量。分析烤煙葉片全氮含量與葉片SPAD 值之間的關(guān)系（圖3）表明，烤煙葉片SPAD 值隨葉片全氮含量的增加而增加，二者呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)。由此說明，葉片SPAD 值的大小可以間接反映葉片的全氮含量，即烤煙葉片葉綠素含量越高，其葉片全氮含量也越多。

圖3 葉片全氮含量與葉片SPAD值的關(guān)系Fig. 3 Correlation between the total nitrogen content and SPAD value of tobacco leaves

2.3.2煙葉SPAD 值與顏色特征值關(guān)系 由圖4可知，葉片SPAD 值與顏色特征值之間存在顯著或極顯著的負(fù)相關(guān)關(guān)系，其中與顏色特征值R、G、L 均呈極顯著負(fù)相關(guān)(P<0.01)，與顏色特征值B 呈顯著負(fù)相關(guān)(P<0.05)。相關(guān)系數(shù)（r）表現(xiàn)為rR>rL>rG>rB，說明顏色特征值R與葉片SPAD值之間的相關(guān)性最高。

圖4 煙葉SPAD值與顏色特征值相關(guān)性Fig. 4 Correlation between SPAD value and color characteristic value of tobacco leaves

2.3.3煙葉全氮含量與顏色特征值關(guān)系 對烤煙葉片全氮（total nitrogen,TN）含量和顏色特征值進(jìn)行相關(guān)分析，結(jié)果（表3）表明，煙葉全氮含量與顏色特征值L、R、G 及L/(R+G)、B/R、B/G、L/B、R+B、B+G、R+B+G+L均呈極顯著相關(guān)，與顏色特征值R/(G+B)、R+B/(R+B+G)呈顯著相關(guān)，與顏色特征值B和G/R相關(guān)不顯著。

表3 煙葉全氮含量與顏色特征值相關(guān)性Table 3 Correlation between total nitrogen content and color characteristic value of tobacco leaves

2.4 煙葉氮素診斷模型的建立與檢驗

2.4.1模型的建立 由于煙葉全氮含量與顏色特征值之間存在較好的相關(guān)關(guān)系，因此利用SPSS 22.0軟件對旺長期煙葉的全氮含量與顏色特征值進(jìn)行多元逐步回歸分析。以顏色特征值為自變量，以葉片全氮含量作為因變量Y，將數(shù)據(jù)帶入1.4中的建模理論，得出以下方程。

經(jīng)分析該模型未達(dá)到顯著水平（P>0.05），因此剔除不顯著項，得到以下模型。

分析發(fā)現(xiàn)該模型達(dá)到顯著水平（P<0.05），說明剔除不顯著項后的模型預(yù)測效果更好。

2.4.2模型的檢驗 首先將旺長期測得的顏色特征值數(shù)據(jù)代入公式（5），計算葉片全氮含量；然后將模型計算出的預(yù)測值與旺長期葉片全氮含量的實測值進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果（圖5）表明，模型計算出的煙葉全氮含量預(yù)測值與煙葉全氮含量實測值呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，說明模型的預(yù)測效果較好。

圖5 煙葉全氮含量預(yù)測值與實測值的相關(guān)分析Fig. 5 Correlation analysis between simulated and actual values of total nitrogen content in tobacco leaves

3 討論

本研究表明，不同施氮量處理下烤煙葉片的全氮含量在旺長期差異更為顯著，這可能是由于團(tuán)棵期煙株需氮量較少，因此各處理間葉片氮素含量變化差異較??；而旺長期是烤煙吸收氮素的高峰期[18]，低氮量處理氮肥供應(yīng)不足，葉片全氮含量開始有所降低，導(dǎo)致各處理間差異顯著。團(tuán)棵期和旺長期各部位葉片的全氮含量均呈現(xiàn)出下部葉片<中部葉片<上部葉片的趨勢，這可能是因為上部葉多為剛長出的新葉，其生長速度較快，且生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)主要依靠老葉的輸送[19?20]，因此烤煙下部葉對氮素含量的變化更為敏感。

葉片顏色特征值RGB 對葉片氮素含量的響應(yīng)表現(xiàn)不同，其中顏色特征值G、R 對氮素含量變化較顏色特征值B更為敏感。這一規(guī)律不受葉片圖像采集與顏色特征值提取方法影響，這在不同烤煙品種間[21]及其他作物[12]也具有相同趨勢。因此，烤煙葉片顏色特征值RGB 預(yù)測葉片全氮含量具有廣適性。

葉片顏色特征值RGB 對葉片氮素含量響應(yīng)變化主要由葉片細(xì)胞內(nèi)色素決定。Li 等[22]發(fā)現(xiàn)，紅光波段的反射率與作物氮指數(shù)密切相關(guān)，且可見光區(qū)域作物的光譜反射率主要由光合色素（主要是葉綠素a 和b）的光吸收特性決定。Evans[23]發(fā)現(xiàn)，葉片氮含量與光合作用間存在一定的因果關(guān)系，即氮素含量和葉綠素含量間存在很強(qiáng)的線性關(guān)系，說明葉片含氮量可通過影響葉片葉綠素含量間接影響顏色特征值。Sun 等[24]探討了西蘭花葉綠素降解機(jī)理，發(fā)現(xiàn)隨著西蘭花葉綠素的降解，R 值和B 值均出現(xiàn)明顯變化。植物葉色變化是由葉片內(nèi)的葉綠素、類胡蘿卜素和花青素3 種色素含量變化決定的[25]，當(dāng)葉綠素含量高于其他2 種色素時，葉片呈現(xiàn)綠色。研究發(fā)現(xiàn)，葉綠素在光合作用中主要吸收紅光和藍(lán)光，反射綠光，其中R/(R+G+B)可作為估算玉米葉綠素含量最主要的顏色特征參數(shù)[26]；水稻葉片的顏色特征值與SPAD值呈指數(shù)關(guān)系[27]。因此，葉片的葉綠素、SPAD 值與顏色特征值間存在一定的相關(guān)性。

對比高光譜成像技術(shù)復(fù)雜的算法和昂貴的機(jī)器、葉綠素儀只能逐點測量且需要多次重復(fù)測量保證準(zhǔn)確性的弊端[28]，應(yīng)用顏色特征值技術(shù)構(gòu)建出的烤煙氮素含量診斷模型，可以快速檢測烤煙葉片全氮含量以及葉綠素含量[29-31]。但由于烤煙葉片診斷時期、葉位及采集圖像設(shè)備的差異，基于葉片顏色特征參數(shù)構(gòu)建的氮素診斷模型會略有不同。本研究基于掃描成像技術(shù)，在一定程度上保證了一致的光照、成像距離，且不受采集光照、時間和天氣等因素影響，構(gòu)建了煙葉全氮含量與顏色特征值的模型Y=1.465G+84.377(B/G)-1.004(B+G)?36.959，經(jīng)檢驗，模型預(yù)測值與實測值呈極顯著相關(guān)（P<0.01），故此模型可以應(yīng)用于烤煙葉片的氮素診斷。由于不同烤煙種植區(qū)品種和水熱條件可能存在差異，為了準(zhǔn)確預(yù)測田間烤煙葉片的氮素水平，建議在田間應(yīng)用顏色特征值氮素診斷模型時做進(jìn)一步研究。