馮世軍　馬敬　李華蕊　劉遠　艾東方　楚瑞琦

［摘要］目的探討龍血素B（LB）對白細胞介素-17（IL-17A）誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖和細胞因子分泌的影響及其機制。方法采用噻唑藍檢測細胞增殖；酶聯(lián)免疫吸附檢測IL-6和IL-23表達，實時熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測趨化因子（CXCL1、CXCL12、CXCL20）mRNA表達量，蛋白免疫印跡方法檢測Janus激酶-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子及轉(zhuǎn)錄激活子（JAK-STAT）通路相關(guān)蛋白Janus激酶1（JAK1）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（p-STAT3）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子3（STAT3）的表達。結(jié)果與對照組相比，IL-17A組的吸光度值（A值）及IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表達明顯增加（F=34.76～135.70，P<0.001），JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表達上調(diào)（F=53.91～105.70，P<0.001）。IL-17A可以劑量依賴性地降低HaCaT細胞的A值，IL-6、IL-23，CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA含量及JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白量（F=22.55～88.41，P<0.001）。與IL-17A+LB-H組相比，IL-17A+LB-H+AG490組的A值、IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA明顯降低（t=4.73～8.40，P<0.001）。結(jié)論LB能抑制IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖及相關(guān)細胞因子分泌，其作用機制可能與抑制JAK-STAT通路有關(guān)。

［關(guān)鍵詞］龍血素B；HaCaT細胞；白細胞介素17；細胞增殖；細胞因子類；JAK-STAT通路；銀屑病

［中圖分類號］R284;R73-3［文獻標志碼］A［文章編號］2096-5532（2023）03-0416-04

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.077［開放科學(xué)（資源服務(wù)）標識碼（OSID）］

［網(wǎng)絡(luò)出版］https：//kns.cnki.net/kcms2/detail/37.1517.r.20230725.0937.004.html;2023-07-2710：58：27

EFFECT OF LOUREIRIN B ON THE PROLIFERATION AND CYTOKINE SECRETION OF HACAT CELLS INDUCED BY IL-17A? FENG Shijun， MA Jing， LI Huarui， LIU Yuan， AI Dongfang， CHU Ruiqi （Department of Dermatology， The Central Hospital of Cangzhou， Cangzhou 061001， China）

［ABSTRACT］ObjectiveTo investigate the effect of loureirin B （LB） on the proliferation and cytokine secretion of HaCaT cells induced by interleukin-17A （IL-17A）. MethodsMTT assay was used to determine cell proliferation; enzyme-linked immunosorbent assay was used to measure the expression of interleukin-6 （IL-6） and interleukin-23 （IL-23）; quantitative real-time polymerase chain reaction was used to measure the mRNA expression of chemokines （CXCL1， CXCL12， CXCL20）; Western blotting was used to measure the protein expression of Janus kinase 1 （JAK1）， phosphorylated signal transducer and activator of transcription 3 （p-STAT3）， and signal transducer and activator of transcription 3 （STAT3）. ResultsCompared with the control group， the IL-17A group showed significant increases in absorbance， the levels of IL-6 and IL-23， and the mRNA expression of CXCL1， CXCL12， and CXCL20 （F=34.76-135.70，P<0.001）， as well as significant upregulation of the protein expression of JAK1， p-STAT3， and STAT3 （F=53.91-105.70，P<0.001）. LB reduced the absorbance， IL-6 and IL-23 levels， CXCL1， CXCL12， and CXCL20 mRNAs， and JAK1， p-STAT3， and STAT3 proteins of HaCaT cells in a dose-dependent manner （F=22.55-88.41，P<0.001）. Compared with the IL-17A+LB-H group， the IL-17A+LB-H+AG490 group showed significant reductions in absorbance， IL-6 and IL-23 levels， and CXCL1， CXCL12， and CXCL20 mRNAs （t=4.73-8.40，P<0.001）. ConclusionLB can inhibit the proliferation and cytokine secretion of HaCaT cells induced by IL-17A， possibly by suppressing the JAK-STAT pathway.

［KEY WORDS］loureirin B; HaCaT cel; interleukin-17; cell proliferation; cytokines; JAK-STAT pathway; psoriasis

銀屑病是臨床常見的一種慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，全球發(fā)病率為0.09%～5.10%[1]。銀屑病組織病理學(xué)主要表現(xiàn)為角質(zhì)層細胞增殖、炎性細胞浸潤等[2]。白細胞介素-17（IL-17A）是輔助性T-17細胞分泌的因子之一，已被證實參與銀屑病等多種皮膚病的免疫發(fā)病機制[3]。HaCaT細胞具有與正常角質(zhì)形成細胞相似的生物學(xué)特性，常被用作體外研究皮膚病的細胞模型[4]。龍血竭是中國傳統(tǒng)的名貴中藥，是百合科龍血樹屬植物劍葉龍血樹的含脂木材經(jīng)過乙醇提取分離制得的樹脂，具有活血化瘀、止血、定痛、斂瘡生肌等功效。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，龍血竭具有抗炎、抗菌、抗腫瘤等藥理活性[5]。龍血素B（LB）是龍血竭二氫查耳酮類化合物，能夠抑制HaCaT細胞的增殖、遷移和侵襲[6]，但是其對IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖的影響未見相關(guān)研究。近年的研究結(jié)果顯示，JAK-STAT3通路可以作為治療銀屑病的重要靶點之一[7]，清熱利濕飲通過抑制JAK-STAT3通路的表達降低HaCaT細胞炎性因子的分泌[8]。因此，本研究首次采用IL-17A刺激HaCaT細胞，探討LB是否可通過調(diào)控JAK-STAT通路影響IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖和細胞因子分泌。

1材料與方法

1.1實驗材料

HaCaT細胞購于中國科學(xué)院上海細胞庫；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；IL-17A購于Peprotech公司；LB購于中國食品藥品檢定研究院（批號：201909）；JAK/STAT信號通路抑制劑AG490購于Sigma公司；MTT試劑盒購于上海東仁化學(xué)科技公司；ELISA試劑盒購于賽默飛世爾公司；引物購于上海吉瑪公司；Trizol試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Ultra SYBR Mixture試劑盒購于北京康為世紀生物；JAK1抗體、p-STAT3抗體、STAT3抗體和GAPDH抗體購于美國CST公司。

1.2實驗方法

1.2.1細胞培養(yǎng)將HaCaT細胞常規(guī)復(fù)蘇后在含有體積分數(shù)0.10胎牛血清以及10 g/L青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液內(nèi)進行培養(yǎng)，并放置在37 ℃、體積分數(shù)0.05 CO2培養(yǎng)箱內(nèi)，2～3 d內(nèi)換1次培養(yǎng)液，細胞融合至85%進行傳代培養(yǎng)。

1.2.2實驗分組及處理選擇處于對數(shù)生長期的HaCaT細胞接種至96孔細胞板內(nèi)，常規(guī)條件下未進行處理的HaCaT細胞，記為對照組（Con組，A組）；采用濃度為200 μg/L IL-17A誘導(dǎo)HaCaT細胞，記為IL-17A組（B組）；采用LB濃度為5、25、50 mg/L和IL-17A濃度為200 μg/L進行處理的HaCaT細胞，分別記為IL-17A+LB-L組（C組）、IL-17A+LB-M組（D組）和IL-17A+LB-H組（E組）；選擇LB（濃度50 mg/L）、IL-17A（200 μg/L）和JAK/STAT信號通路抑制劑AG490（20 mol/L）處理的HaCaT細胞，記為IL-17A+LB-H+AG490組（F組）。細胞培養(yǎng)48 h后進行后續(xù)實驗。

1.2.3MTT檢測細胞增殖對1.2.2各組HaCaT細胞調(diào)整細胞密度并接種在96孔板內(nèi)，在培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)48 h，按照MTT試劑盒說明書檢測細胞增殖活性，然后在酶標儀490 nm處檢測細胞的吸光度值（A值）。

1.2.4ELISA檢測IL-6、IL-23的表達取1.2.2各組HaCaT細胞，3 000 r/min離心10 min后分別收集細胞上清液，按照ELISA法檢測IL-6、IL-23的表達。

1.2.5qRT-PCR檢測CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表達量取1.2.2各組HaCaT細胞按照Trizol法提取各組細胞的總RNA，根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，以β-actin作為內(nèi)參照。按照Ultra SYBR Mixture試劑盒進行PCR擴增，反應(yīng)條件為：95 ℃、10 min，95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，共45個循環(huán)。采用2-ΔΔCt公式計算CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表達量。PCR所用引物及其序列見表1。

1.2.6Western blot檢測JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達取1.2.2各組的HaCaT細胞，加入蛋白裂解液后提取細胞的總蛋白。煮沸變性取30 μg蛋白樣品，經(jīng)過SDS-PAGE凝膠電泳處理，轉(zhuǎn)膜，封閉培養(yǎng)，分別加入JAK1（1∶1 000）、p-STAT3（1∶1 000）、STAT3（1∶1 000）抗體，4 ℃過夜培養(yǎng)。加入帶有標記的二抗，37 ℃培養(yǎng)2 h。在膜上滴加ECL，顯色曝光，定影。采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件分析處理實驗數(shù)據(jù)。計量資料采用±s形式表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2結(jié)果

2.1LB對HaCaT細胞增殖、細胞因子分泌和趨化因子的影響

與A組相比，B組48、72 h細胞增殖的A值顯著增加（F=34.76～33.09，P<0.01），IL-6、IL-23顯著增加（F=135.70、105.10，P<0.001），CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表達量顯著增加（F=68.60～82.39，P<0.001）。與B組相比，C組、D組、E組的48、72 h細胞增殖的A值顯著降低（F=22.55～27.03，P<0.001），IL-6、IL-23顯著降低（F= 88.41、51.55，P<0.001），CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA的表達量顯著降低（F=34.00～45.53，P<0.001）。見表2。

2.2LB對細胞中JAK-STAT通路蛋白表達影響

與A組相比，B組的JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達顯著增加（F=53.91～105.70，P<0.001）；與B組相比，C組、D組、E組的JAK1、p-STAT3、STAT3蛋白表達顯著降低（F=26.42～47.36，P<0.001）。見圖1和表3。

2.3阻斷JAK-STAT通路后LB對HaCaT細胞增殖、細胞因子分泌和趨化因子表達的影響

與IL-17A+LB-H組相比，IL-17A+LB-H+AG490組的48 h及72 h細胞增殖的A值、IL-6、IL-23和CXCL1、CXCL12、CXCL20 mRNA表達量顯著降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（t=5.40～8.40，P<0.001）。見表4。

3討論

銀屑病是基于遺傳背景下的與免疫相關(guān)的慢性炎癥性疾病，與細胞免疫有關(guān)[9]?，F(xiàn)已經(jīng)證實，IL-17A在銀屑病中表達異常升高，參與HaCaT細胞的增殖和炎癥因子的分泌，在銀屑病的發(fā)生發(fā)展中起重要作用[10]。IL-6和IL-23是多種免疫細胞的致炎因子，可參與細胞的免疫和炎癥反應(yīng)等多種病理生理過程[11]。趨化因子是一類由組織細胞和炎性細胞產(chǎn)生的小分子分泌蛋白，主要有4種亞型，其中CXCL1、CXCL12和CXCL20在巨噬細胞、中性粒細胞和角質(zhì)形成細胞等多種細胞中表達，并參與細胞的炎癥反應(yīng)和血管生成等過程[12]。有研究報道，趨化因子參與銀屑病的發(fā)生和發(fā)展，通過藥物干預(yù)細胞的炎癥反應(yīng)，對銀屑病的治療具有重要意義[13]。本研究采用IL-17A處理HaCaT細胞后的結(jié)果顯示，細胞增殖明顯升高，IL-6和IL-23因子分泌增多，CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表達上調(diào)，提示IL-17A促進了HaCaT細胞的增殖和細胞因子的分泌。龍血竭的化學(xué)成分較為復(fù)雜，有萜類、甾體和酮類等，其中LB是酮類的主要活性成分，具有抗炎、抗菌和降低血糖等藥理作用[14]。本研究采用不同濃度LB處理HaCaT細胞的體外實驗表明，細胞增殖明顯降低，IL-6、IL-23因子分泌減少，CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表達下調(diào)，表明LB能夠抑制IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖和細胞因子的分泌。

有研究顯示，IL-6、IL-12和IL-17A等因子可啟動JAK-STAT通路中的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，活化下游JAK1、STAT3等，進而影響STAT3的磷酸化[15]。陳飚等[16]的研究結(jié)果則顯示，STAT1、STAT3等mRNA和蛋白表達在銀屑病病人皮損區(qū)角質(zhì)形成細胞中上調(diào)，提示其與銀屑病的發(fā)病機制有關(guān)。解欣然等[17]研究結(jié)果顯示，丹皮酚通過調(diào)控STAT3通路減緩IL-17A誘導(dǎo)的HaCaT細胞增殖和細胞因子的分泌。本文研究結(jié)果表明，IL-17A能誘導(dǎo)HaCaT細胞JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表達上調(diào)，經(jīng)過不同濃度LB處理后，JAK1、p-STAT3和STAT3蛋白表達下調(diào)，說明LB可抑制IL-17A對JAK-STAT通路的激活作用。JAK-STAT信號通路抑制劑AG490可以選擇性地降低STAT3的磷酸化[18]，也可以抑制瘢痕疙瘩成纖維細胞的異常行為[19]。進一步實驗研究顯示，AG490能夠降低細胞增殖，抑制IL-6、IL-23因子分泌，下調(diào)CXCL1、CXCL12和CXCL20 mRNA表達，表明LB可通過抑制JAK-STAT通路減緩銀屑病的發(fā)展。

綜上所述，LB可通過抑制JAK-STAT通路減緩IL-17A誘導(dǎo)HaCaT細胞增殖和細胞因子的分泌，這為LB治療銀屑病的可能作用機制提供了理論基礎(chǔ)。然而，LB是否可通過其他通路調(diào)節(jié)JAK-STAT通路進而參與HaCaT細胞表型的調(diào)控，仍有待進一步探討。

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（本文編輯牛兆山）