黃 江,李 闖,崔月琦,袁雪瑩,趙志誠,劉 宇,2,周玉龍,2,朱戰(zhàn)波,2*,張澤財,2*

(1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 動物科技學(xué)院,大慶 163319;2.黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心,大慶 163319)

牛病毒性腹瀉-黏膜病(BVD-MD)是由牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)感染引起的牛的一種重要傳染病。BVDV感染可導(dǎo)致牛的急性感染,表現(xiàn)為發(fā)熱、腹瀉、黏膜潰瘍、繁殖障礙等,嚴(yán)重威脅養(yǎng)牛業(yè)健康發(fā)展。持續(xù)性感染和免疫抑制也是BVDV感染的兩個重要特點(diǎn),為該病的凈化增加了難度,同時增加了繼發(fā)感染的風(fēng)險,造成的間接經(jīng)濟(jì)損失也不容忽視[1-3]。目前,尚沒有治療該病的特效藥物,疫苗接種仍然是主要的防控手段,但由于毒株具有種類多、易變異、感染率高等特點(diǎn),導(dǎo)致該病防控效果較差。在注重疫苗研發(fā)的同時,深入探究與BVDV感染可能相關(guān)的因素,對該病的防控也許有重要價值。

腸道菌群是機(jī)體內(nèi)數(shù)量龐大的微生物群體,在宿主的消化、免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[4-5]。然而,當(dāng)動物受到飼料轉(zhuǎn)換、生產(chǎn)、抗生素長期使用、環(huán)境變化等應(yīng)激因素影響時,容易導(dǎo)致正常菌群組成發(fā)生變化,造成菌群紊亂[6-9]。大量研究表明,腸道菌群與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān),如炎癥性腸病和腸易激綜合征等腸道內(nèi)疾病[10-11],以及心血管疾病和神經(jīng)退行性疾病等腸道外疾病[12-13]。近年,越來越多的研究也報道,腸道菌群與多種感染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),且腸道菌群紊亂可降低機(jī)體免疫應(yīng)答能力,進(jìn)而增加病原的易感性[14]。依據(jù)臨床上多種因素容易導(dǎo)致腸道菌群發(fā)生紊亂,結(jié)合腸道菌群紊亂可降低機(jī)體對病原的清除能力,推測腸道內(nèi)定居的微生物也許是導(dǎo)致BVDV高感染率的一個關(guān)鍵因素。因此,本研究擬通過建立抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂小鼠模型,探究腸道菌群紊亂對BVDV易感性的影響,為揭示臨床BVDV高感染率以及為該病的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒株和實(shí)驗(yàn)動物

CP型BVDV(NADL株)由黑龍江省牛病防控工程技術(shù)研究中心保存,SPF級BALB/c雌性小鼠36只(6～8周齡),購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司。

1.2 主要試劑

硫酸新霉素、氨芐青霉素、甲硝唑均購自上?；鄯f科技有限公司;鹽酸萬古霉素購自浙江醫(yī)藥股份有限公司;兩性霉素B購自浙江海正藥業(yè)股份有限公司;山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記的二抗購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;BCA蛋白濃度測定試劑盒、RIPA蛋白裂解液、超敏ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒購自碧云天生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR熒光定量qRT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。TRIzol購自Invitrogen公司。

1.3 動物分組與處理

菌群紊亂小鼠模型構(gòu)建:依據(jù)前期研究報道[15],具體方法如下:將6只BALB/c小鼠隨機(jī)分為2組,分別為抗生素處理組(Abx group)和健康對照組(Control group),每組3只。Abx組小鼠依據(jù)體重,按照100 mg·kg-1氨芐西林、50 mg·kg-1鹽酸萬古霉素、100 mg·kg-1甲硝唑、100 mg·kg-1硫酸新霉素、1 mg·kg-1兩性霉素B的劑量,每日2次,連續(xù)灌胃13 d后,收集小鼠糞便樣本,進(jìn)行菌群結(jié)構(gòu)分析。對照組小鼠灌胃等體積生理鹽水。

BVDV感染小鼠模型構(gòu)建:將菌群紊亂小鼠和健康小鼠平均各分為2組,分別為Control組、BVDV組、Abx-BVDV組和Abx組,每組5只。依據(jù)課題組前期建立的方法[16],BVDV感染組小鼠腹腔注射105TCID50的CP型BVDV,Control組和Abx組小鼠接種等體積的DMEM,于感染第7天,采集小鼠血液和十二指腸用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測。

糞菌移植(FMT)試驗(yàn):試驗(yàn)分為Abx-BVDV組和Abx-BVDV-FMT組,每組5只?？股靥幚?3 d后,依據(jù)前期研究報道的方法對Abx-BVDV-FMT組小鼠進(jìn)行FMT試驗(yàn)[17-18],Abx-BVDV組小鼠給予等體積的生理鹽水,FMT共處理9 d。即:于移植第3天,腹腔注射BVDV,在BVDV感染期間每天移植1次。BVDV感染7 d后,采集小鼠血液和十二指腸用于各項(xiàng)指標(biāo)檢測。所有試驗(yàn)均獲得黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物倫理委員會批準(zhǔn)。

1.4 16 S rRNA 測序

取菌群紊亂小鼠模型構(gòu)建試驗(yàn)中Control組和Abx組小鼠的糞便樣本,采用SDS法提取菌群DNA,并檢測其濃度和純度。對V3-V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增,通過Hi Seq2500 PE250進(jìn)行測序分析。利用Uparse軟件將同源性高于97%的序列聚類為同一OTUs,并依據(jù)OTU對樣本進(jìn)行物種分類注釋。組間差異選用R 軟件分析,α多樣性和β多樣性指數(shù)反應(yīng)。兩組間比較采用T-test和wilcox檢驗(yàn)。

1.5 熒光定量PCR檢測小鼠血液和十二指腸中BVDV載量

無菌取BVDV感染小鼠模型構(gòu)建試驗(yàn)和FMT試驗(yàn)中各組小鼠血液和十二指腸(n=5),采用TRIzol法提取總RNA,并反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)。BVDV引物序列為,上游:5′-GAGTACAGGGTAGTCGTCAG-3′,下游:5′-CTCTGCAGCACCCTATCAGG-3′,引物由生工生物(上海)工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系:SYBR?Premix Ex TaqTM Ⅱ 10 μL,水7 μL,上、下游引物各1 μL,目的模板1 μL,共20 μL體系。反應(yīng)條件:95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,共45個循環(huán),根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出病毒載量。

1.6 Western blot檢測小鼠十二指腸中BVDV E0蛋白表達(dá)

無菌取BVDV感染小鼠模型構(gòu)建試驗(yàn)和FMT試驗(yàn)中各組小鼠十二指腸(n=5),加入組織裂解液,提取蛋白。每孔上樣40 μg,50V恒壓電泳25 min、80V恒壓電泳20 min,然后120V恒壓電泳45 min。切下目的凝膠轉(zhuǎn)至PVDF膜,5%脫脂奶粉封閉1.5 h后,分別加入鼠源BVDV E0(1∶100)一抗和兔源a-tubulin(1∶3 000)一抗,4 ℃孵育過夜。鼠源和兔源二抗(1∶8000),室溫孵育2 h,使用ECL顯色劑進(jìn)行顯色,于凝膠成像儀中進(jìn)行曝光成像,得到灰度值,計算相對表達(dá)量。

1.7 十二指腸病理組織學(xué)檢查

無菌取BVDV感染小鼠模型構(gòu)建試驗(yàn)和FMT試驗(yàn)中各組小鼠十二指腸(n=5),部分組織于10%甲醛中固定,7 d后取出組織,并經(jīng)沖洗、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片、展片、蘇木素-伊紅染色、封片等步驟,完成組織切片的制備。

1.8 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 25.0統(tǒng)計學(xué)軟件處理。計量資料用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示”,兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P>0.05差異不顯著,P<0.05和P<0.01認(rèn)為具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 抗生素處理對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)和豐度的影響

所有樣品測序共獲得480 083對Reads,雙端Reads質(zhì)控、拼接后共產(chǎn)生478 700條Clean Reads,平均產(chǎn)生79 783條Clean Reads。對α多樣性指數(shù)分析發(fā)現(xiàn),與對照組相比,抗生素處理顯著減少了ACE、Chao1、Simpson和Shannon指數(shù)水平(圖1A～D)。在Control組和Abx組間共存在218個共有的OTUs。與α多樣性指數(shù)變化相同的是,Control組中存在205個特異的OTUs,而Abx組中僅有7個(圖1E)。β多樣性(PCoA和UPGMA法聚類)分析結(jié)果表明,Control組和Abx組樣本中微生物組成存在差異(圖2A、B)。進(jìn)一步對物種門水平分析發(fā)現(xiàn),厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是相對豐度最高的三個門水平物種(圖2C)。與Control組相比,抗生素處理顯著降低了厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度,然而顯著增加了變形菌門相對豐度(圖2C～E)。

A.ACE指數(shù);B.Chao 1指數(shù);C.Simpsion 指數(shù);D.Shannon 指數(shù);E.Venn 圖。**.P<0.01,下同

A.PCoA 分析;B.UPGMA聚類樹與柱狀圖結(jié)合;C.門水平上微生物相對豐度;D.厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度;E.變形菌門相對豐度

2.2 腸道菌群紊亂對BVDV復(fù)制的影響

如圖3A、3B所示,與BVDV組相比,腸道菌群紊亂明顯增加了小鼠血液和十二指腸中BVDV RNA水平。Western blot檢測也發(fā)現(xiàn),腸道菌群紊亂小鼠十二指腸中BVDV E0蛋白表達(dá)顯著高于BVDV感染的健康小鼠(圖3C、3D)。

A.血液中BVDV RNA水平;B.十二指腸中BVDV RNA水平;C.十二指腸中BVDV E0蛋白水平;D.BVDV E0蛋白灰度分析

2.3 腸道菌群紊亂對小鼠十二指腸病理變化的影響

對BVDV感染7 d的小鼠十二指腸進(jìn)行病理組織學(xué)檢測發(fā)現(xiàn),與Control組相比,BVDV感染導(dǎo)致十二指腸整體結(jié)構(gòu)輕度異常,上皮細(xì)胞脫落壞死、少量炎癥細(xì)胞浸潤。然而,與BVDV感染的健康小鼠相比,BVDV感染的腸道菌群紊亂組小鼠的十二指腸病理學(xué)變化更為顯著(圖4)。

2.4 糞菌移植(FMT)對BVDV感染小鼠的保護(hù)作用

如圖5所示,與Abx-BVDV組相比,在FMT移植給菌群紊亂小鼠后,血液和十二指腸中BVDV RNA水平均被顯著抑制(圖5A、5B)。與Abx-BVDV組相比,FMT處理也顯著降低了BVDV E0蛋白的表達(dá)(圖5C、5D)。病理組織學(xué)分析發(fā)現(xiàn),BVDV感染菌群紊亂小鼠誘導(dǎo)的十二指腸整體結(jié)構(gòu)異常、上皮細(xì)胞脫落壞死以及炎性細(xì)胞浸潤,在FMT處理后明顯改善(圖5E)。

A.血液中BVDV RNA水平;B.十二指腸中BVDV RNA水平;C.十二指腸中BVDV E0蛋白水平;D.BVDV E0蛋白灰度分析;E.十二指腸病理變化 (HE染色 200×)

3 討 論

腸道菌群是動物體內(nèi)數(shù)量龐大、種類繁多的微生物群體,與機(jī)體的健康息息相關(guān)。本研究以抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂小鼠模型為研究對象,探究了腸道菌群紊亂對BVDV感染的影響。對腸道菌群紊亂的重要指標(biāo)進(jìn)行檢測發(fā)現(xiàn),在抗生素處理13 d后,小鼠腸道內(nèi)微生物的ACE、Chao1、Simpson和Shannon等α多樣性指數(shù)均明顯下降,表明抗生素處理減少了腸道微生物的多樣性。OTU是為了便于分析,人為劃分的分類單元,1個OTU通常代表1個微生物物種。本研究中,抗生素處理也減少了OTU的數(shù)量,進(jìn)一步表明抗生素具有降低微生物多樣性的能力。微生物組成是評估腸道菌群紊亂的另一個重要指標(biāo)。前期研究表明,抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂小鼠中厚壁菌門和擬桿菌門相對豐度明顯降低,然而變形菌門相對豐度卻顯著增加[19-20]。本研究首先通過微生物β-多樣性分析發(fā)現(xiàn),抗生素處理組和對照組小鼠腸道微生物可明顯區(qū)分開,表明兩組間存在顯著的微生物群落差異。隨后,在門水平上進(jìn)一步分析了微生物組成的不同,發(fā)現(xiàn)厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門是相對豐度最高的3種。與前期研究結(jié)果相一致的是,抗生素處理組中厚壁菌門和擬桿菌門的相對豐度明顯降低,變形菌門相對豐度顯著增加。以上結(jié)果表明,抗生素誘導(dǎo)的腸道菌群紊亂小鼠模型被成功建立。

生產(chǎn)實(shí)踐中,由于疾病治療中抗生素的長期使用、飼料的轉(zhuǎn)換、生產(chǎn)以及各類應(yīng)激因素均易導(dǎo)致動物正常腸道微生物組成發(fā)生改變,造成菌群紊亂。近年,越來越多的研究也表明腸道菌群與感染性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。如,Abt等[21]研究發(fā)現(xiàn),紊亂的腸道菌群可通過抑制機(jī)體先天性免疫反應(yīng)和獲得性免疫反應(yīng),降低機(jī)體對流感病毒的清除能力。另外,有研究也證實(shí)腸道菌群紊亂可加重肺炎球菌和鉤端螺旋體的感染[18,22]。重要的是,Thackrag等[23]發(fā)現(xiàn),紊亂的腸道菌群可誘導(dǎo)CD8+T數(shù)量減少,同時增加與BVDV同科的西尼羅河病毒、登革熱病毒和寨卡病毒對小鼠的易感性。本團(tuán)隊前期研究已經(jīng)證實(shí),BVDV感染小鼠的外周血淋巴細(xì)胞中CD8+T數(shù)量顯著減少,通過干預(yù)CD8+T增殖和活化具有抗BVDV效果[24-25]。另外,參與BVDV致病過程中的多種分子機(jī)制,也受腸道菌群的調(diào)節(jié),如先天性免疫、自噬等[26-27]?；谏鲜隼碚?筆者推測紊亂的腸道菌群也許將影響B(tài)VDV的感染。與該理論假設(shè)相一致的是,本研究發(fā)現(xiàn)在BVDV感染的腸道菌群紊亂小鼠的血液和十二指腸中BVDV載量要明顯高于BVDV感染的健康小鼠,十二指腸病理學(xué)變化也進(jìn)一步證實(shí)了腸道菌群紊亂能夠增加BVDV的易感性。已有研究證實(shí),采用干預(yù)腸道菌群的方微生態(tài)制劑等干預(yù)腸道菌群的策略是否具有抗BVDV效果,本研究進(jìn)行了糞菌移植(FMT)試驗(yàn)。FMT試驗(yàn)是研究腸道微生物與疾病相關(guān)性的常用方法,同時也在疾病治療中呈現(xiàn)較好效果[28-30]。本研究通過給菌群紊亂小鼠回補(bǔ)健康供體小鼠腸道微生物后,發(fā)現(xiàn)通過微生物恢復(fù)的方法可以對BVDV感染的小鼠起到較好的保護(hù)效果。這些結(jié)果進(jìn)一步表明,腸道菌群也許是影響B(tài)VDV感染的重要因素之一。

4 結(jié) 論

本研究成功構(gòu)建了腸道菌群紊亂小鼠模型,證實(shí)了小鼠腸道菌群紊亂具有增加BVDV易感性的作用,初步揭示了以腸道菌群為靶點(diǎn)的微生態(tài)制劑和抗BVDV藥物的研發(fā)也許具有一定的可行性。然而,小鼠和本體動物間腸道菌群結(jié)構(gòu)存在一定的差異,腸道菌群對BVDV感染本體動物的影響及其分子機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。