袁 麗,孫楊楊,張路捷,張 杰,孫海鳳,白 娟,姜 平

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動物細(xì)菌學(xué)重點實驗室,南京 210095)

豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)是影響世界養(yǎng)豬業(yè)的重要病原,臨床上可引起母豬繁殖障礙、仔豬高死亡率和各年齡階段豬的呼吸系統(tǒng)癥狀,給我國養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大經(jīng)濟損失[1-2]。PRRSV 可分為歐洲型(PRRSV-1)和美洲型(PRRSV-2),二者的基因相似性為50%～70%,通過對ORF5序列的系統(tǒng)發(fā)育分析,PRRSV-1分為4個亞型,PRRSV-2分為9個譜系[3-4]。我國主要流行PRRSV-2,包括高致病性PRRSV(亞系8.7)、經(jīng)典PRRSV(亞系5.1)、類NADC30毒株(亞系1.8)及QYYZ毒株(亞系3.5)等基因亞型毒株[5]。

PRRSV 基因組為單股正鏈 RNA,長度約為15 kb,包含至少 9 個開放閱讀框(ORFs)[6-7]。其中ORF3編碼的糖基化蛋白3(glycosylated protein 3,GP3)具有7個糖基化位點[8]。GP3蛋白由一個切割的信號肽、一個高度糖基化的結(jié)構(gòu)域、一個短疏水區(qū)和一個未糖基化的C末端結(jié)構(gòu)域組成。病毒顆粒中GP3與GP2、GP4蛋白形成異源三聚體,并與宿主細(xì)胞CD163相互作用,而CD163是 PRRSV進(jìn)入細(xì)胞的關(guān)鍵受體[9-10]。GP3蛋白也可表現(xiàn)為細(xì)胞分泌形式,分泌的GP3可能作為一種誘餌,分散抗體遠(yuǎn)離病毒顆粒[11]。病毒顆粒中GP3含量較少,但抗原性較高,參與誘導(dǎo)中和抗體產(chǎn)生[12]。目前,PRRSV GP3蛋白結(jié)構(gòu)和抗原特性尚不十分清楚。

本研究根據(jù)PRRSV FJ1402毒株序列擴增ORF3基因,通過原核表達(dá)系統(tǒng)成功制備出重組GP3蛋白,將其作為免疫原免疫BALB/c小鼠,制備了7株GP3單克隆抗體,鑒定出4個B細(xì)胞表位,為 PRRSV診斷和生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料

PRRSV FJ1402毒株、PRRSV N單抗、桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)PRRSV GP3蛋白(片段為28—203 aa,表達(dá)系統(tǒng)為pFastBacTMDual )、SP2/0細(xì)胞、大腸桿菌E.coliDH5α和Rosetta均由本實驗室保存。雌性BALB/c小鼠(6～8 周齡)購自揚州大學(xué)實驗動物中心。

2×Phanta Max Master Mix和Pres-tained Protein Marker,購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶和T4 DNA 連接酶,購自Thermo Fisher Scientific公司;山羊抗小鼠IgG(H+L)-HRP和HRP-SPA,購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;HisSep Ni-NTA Agarose Resin,購自上海翊圣生物科技有限公司;RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清,購自美國 Gibco 公司;FITC-羊抗鼠 IgG、小鼠單克隆抗體亞型鑒定試劑盒,購自Proteintech生物科技有限公司;TanonTM High-sig ECL Western blot底物試劑盒,購自天能科技有限公司;異丙基硫代-β-D-半乳糖(IPTG)、PEG1450、50×HAT和50×HT,購自美國Sigma公司;其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 重組質(zhì)粒構(gòu)建

根據(jù)PRRSV FJ1402(GenBank No.KX169 191.1) ORF3基因序列,采用TMHMM Serverv.2.0 網(wǎng)站軟件分析GP3蛋白跨膜區(qū)為16～38位氨基酸(aa),刪除1～38 aa后的目的片段命名為 tGP3 (39～254 aa)。引物為 28a-tGP3-F:5′-CGGGATCCGTTAGGGGCAACTTCTCTTT-3′,28a-tGP3-R:5′-CCCTCGAGTTGCCGCGCGACATTGAGGA-3′,用于擴增 tGP3 片段,大小為 648 bp。PCR 反應(yīng)條件:95 ℃ 3 min;95 ℃ 30 s,60 ℃ 15 s,72 ℃ 60 s,循環(huán)35 次;72 ℃ 5 min。將目的片段和 pET-28a 載體通過BamHⅠ和XholⅠ雙酶切后進(jìn)行連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α菌,經(jīng)菌液PCR 和酶切鑒定正確后送通用生物公司測序,結(jié)果顯示正確,重組質(zhì)粒pET-28a-tGP3于-20 ℃ 保存?zhèn)溆谩?/p>

為了解析GP3蛋白抗原表位,根據(jù) PRRSV FJ1402 ORF3基因序列設(shè)計一系列截短體引物并在引物的5′端引入EcoRⅠ酶切位點,3′端引入HindⅢ酶切位點,引物序列如表所示(表1),送南京金斯瑞公司合成。以重組質(zhì)粒 pET-28a-tGP3為模板,采用PCR方法分別擴增出9個GP3蛋白基因截短體,將截短體和pET-32a載體雙酶切后進(jìn)行連接,構(gòu)建9 個GP3蛋白截短體重組質(zhì)粒。

表1 GP3蛋白截短體 PCR 引物序列

1.3 重組蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化

將重組質(zhì)粒pET-28a-tGP3轉(zhuǎn)化Rosetta感受態(tài)細(xì)胞,挑取單菌落,37 ℃培養(yǎng),測定菌液 OD600 nm為0.6～0.8時加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG,繼續(xù)培養(yǎng)6 h。收集菌體超聲破碎,分離上清和沉淀,SDS-PAGE 鑒定蛋白表達(dá)形式,采用鎳柱親和層析法純化目的蛋白,純化GP3蛋白用超濾管進(jìn)行濃縮后測定蛋白濃度,Western blot 試驗鑒定GP3蛋白與PRRSV 陽性豬血清的反應(yīng)性。

1.4 PRRSV GP3 蛋白單克隆抗體的制備

1.4.1 小鼠免疫 按照文獻(xiàn)報道[13],將重組GP3蛋白與等體積ISA206佐劑混合,充分乳化后皮下注射小鼠,60 μg·只-1,ELISA抗體效價≥1∶10 000時,通過腹腔注射50 μg重組GP3蛋白進(jìn)行沖擊免疫。3 d后采集脾,進(jìn)行細(xì)胞融合。

1.4.2 單克隆抗體制備 按照文獻(xiàn)報道[13-14],取沖擊免疫小鼠脾細(xì)胞和SP2/0細(xì)胞按照7∶1比例混合,加入 PEG1450進(jìn)行融合。將融合細(xì)胞鋪于含有2% HAT選擇培養(yǎng)基的96孔細(xì)胞板中,培養(yǎng)6 d左右全換液,間隔24～36 h 取雜交瘤細(xì)胞上清,用間接 ELISA 進(jìn)行檢測。篩選到的陽性雜交瘤細(xì)胞需要進(jìn)行2～3次亞克隆,直至單克隆陽性率為100%。將穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞擴大培養(yǎng)至T25細(xì)胞瓶,凍存后于液氮中保存。

1.4.3 間接 ELISA 篩選陽性雜交瘤細(xì)胞 用重組GP3蛋白作為包被抗原,雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗,同時設(shè)立陽性對照(免疫小鼠血清 1∶100 稀釋)和陰性對照(SP2/0 細(xì)胞上清);羊抗鼠IgG(H+L)-HRP孵育二抗;TMB顯色后加入終止液,酶標(biāo)儀檢測OD450 nm時的讀數(shù),P/N≥2.1判定為陽性。

1.4.4 腹水制備 按照文獻(xiàn)報道[15],取8周齡雌性 BALB/c小鼠,腹腔注射500 μL無菌液體石蠟。7 d后,腹腔注射3×106～4×106個雜交瘤細(xì)胞。7 d后觀察,小鼠腹部脹大并觸之有波動感時用頭皮針收集腹水,安樂死。收集的腹水4 000g離心10 min,取上清,分裝后,于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

（1）該水源地歷年變化分析得出氨氮、總磷等水質(zhì)指標(biāo)有逐年好轉(zhuǎn)的趨勢，但是COD存在一定的水質(zhì)惡化風(fēng)險。

1.5 單克隆抗體生物學(xué)特性鑒定

1.5.1 單克隆抗體細(xì)胞株的穩(wěn)定性試驗 將陽性雜交瘤細(xì)胞株連續(xù)傳代,取 5、10、15代細(xì)胞上清,間接ELISA檢測抗體效價和抗體分泌穩(wěn)定性。

1.5.2 單克隆抗體亞型鑒定 按照單克隆抗體亞型鑒定說明,將單抗細(xì)胞上清按照1∶200 稀釋,將待測樣品加入板條中,每孔50 μL;加入1×山羊抗小鼠 IgA+IgM+IgG-HRP,每孔50 μL,混勻;室溫孵育1 h;棄去孔內(nèi)液體,PBST 洗板3次;加入顯色液,室溫避光顯色10～20 min,加入終止液,各孔的OD450 nm值最高的孔即為相應(yīng)的單抗亞型。

1.5.3 單克隆抗體的特異性反應(yīng)鑒定 以純化的PRRSV FJ1402、桿狀病毒系統(tǒng)和原核系統(tǒng)表達(dá)的重組GP3蛋白為抗原,同時設(shè)置相應(yīng)陰性對照,進(jìn)行SDS-PAGE 和Western blot。將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上,雜交瘤細(xì)胞上清作為一抗,羊抗鼠IgG(H+L)-HRP孵育二抗,加入顯色液后判定單抗特異反應(yīng)性。

1.5.4 間接免疫熒光試驗反應(yīng)性鑒定 PRRSV接種Marc 145細(xì)胞,37 ℃培養(yǎng)48 h,加入4%多聚甲醛于37 ℃固定15 min,加入0.1%Triton X-100于室溫作用25 min,PBS洗滌后加入單抗37 ℃作用1 h,洗滌后加入FITC-羊抗鼠 IgG,37 ℃作用1 h,洗滌后于熒光倒置顯微鏡下觀察。

1.6 單克隆抗體表位鑒定

1.6.1 Western blot 將GP3蛋白基因截短體重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至表達(dá)菌種Rosetta,IPTG 誘導(dǎo)表達(dá),SDS-PAGE 后將蛋白轉(zhuǎn)印至NC膜上,以單抗腹水為一抗,采用Western blot鑒定單抗識別的抗原表位。

1.6.2 抗原表位合成多肽間接ELISA 根據(jù)上述鑒定的抗原表位,合成多肽,以50 μg·mL-1劑量包被酶標(biāo)板,加入GP3蛋白單克隆抗體,以豬抗PRRSV血清抗體(G2#)和PBS分別作為陽性和陰性對照,37 ℃作用1 h后,加入HRP-SPA,37 ℃作用1 h。TMB顯色后加入終止液,酶標(biāo)儀檢測OD450 nm,P/N≥2.1判定為陽性。

1.7 GP3 單抗抗原表位氨基酸位點對比分析

選取17株不同譜系的PRRSV-2中國流行毒株及參考毒株序列(BB0907、SY0608、HUN4、JXA1、WUH4、GD1404、CH-1a、IngelvacATP、QYYZ、GM2、VR2332、BJ-4、S1、MN184C、NADC31、NADC30、FJ1402),利用Jalview軟件對比分析4種抗原表位序列在各毒株中的保守性。

1.8 GP3 單抗與不同毒株反應(yīng)性

選取針對不同抗原表位的單克隆抗體,采用IFA和Western blot測定其與高致病性PRRSV毒株BB0907和經(jīng)典PRRSV毒株S1的特異反應(yīng)性。

2 結(jié) 果

2.1 GP3 蛋白基因表達(dá)與重組蛋白的制備

A.重組蛋白表達(dá);B.包涵體純化;C.Western blot鑒定。M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.誘導(dǎo)表達(dá)全菌;2.誘導(dǎo)表達(dá)上清;3.誘導(dǎo)表達(dá)沉淀;4.未誘導(dǎo)表達(dá)全菌;5.空載體誘導(dǎo)全菌;6.純化的重組 GP3 蛋白

2.2 單克隆抗體制備及效價測定

小鼠三免后10 d,間接ELISA測定抗體效價均≥1∶10 000。取效價最高的小鼠沖擊免疫,3 d后取脾進(jìn)行細(xì)胞融合,通過間接 ELISA 篩選陽性雜交瘤細(xì)胞并進(jìn)行亞克隆,最終獲得7株分泌 PRRSV GP3 蛋白抗體的雜交瘤細(xì)胞,分別命名為2E12、4H9、5B2、6B3、6G7、9F3 和 9H5。雜交瘤細(xì)胞連續(xù)傳代至15代,每隔5代取細(xì)胞上清檢測抗體效價,結(jié)果顯示效價基本穩(wěn)定。用7株雜交瘤細(xì)胞分別制備小鼠腹水并測定其效價,結(jié)果如表2所示,7株腹水單抗(mAbs)ELISA效價為1∶(64 000～2 048 000)。

表2 雜交瘤細(xì)胞上清和小鼠腹水抗體效價的測定

2.3 單克隆抗體亞型鑒定

2E12、5B2單抗的重鏈屬于IgG2a亞類,4H9、6B3、6G7、9F3 和 9H5單抗的重鏈屬于 IgG2b 亞類,7株單抗的輕鏈類型均為 Kappa 型(表3)。

表3 單克隆抗體亞型鑒定(OD450 nm)

2.4 單克隆抗體Western blot特異性鑒定

7 株mAbs均能和PRRSV FJ1402、桿狀病毒系統(tǒng)和原核系統(tǒng)表達(dá)的重組GP3蛋白發(fā)生特異性反應(yīng),不與 Marc 145 細(xì)胞、sf9 細(xì)胞和 pET-28a空載體發(fā)生反應(yīng)(圖2)。

A.2E12;B.4H9;C.5B2;D.6B3;E.6G7;F.9F3;G.9H5;M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.純化的PRRSV;2.Marc-145細(xì)胞對照;3.桿狀系統(tǒng)表達(dá) GP3 蛋白;4.sf9細(xì)胞對照;5.重組GP3蛋白;6.空載誘導(dǎo)全菌蛋白

2.5 單克隆抗體IFA特異性鑒定

圖3結(jié)果顯示,7 株mAbs均能和PRRSV FJ1402株感染的Marc 145細(xì)胞發(fā)生特異性的熒光,其中5B2和9H5熒光較強;6B3和9F3熒光較弱。

A.2E12;B.4H9;C.5B2;D.6B3;E.6G7;F.9F3;G.9H5;H.PRRSV N單抗;I.SP2/0上清

2.6 單克隆抗體的表位鑒定

本試驗構(gòu)建了一系列GP3蛋白截短體(圖4A),Western blot結(jié)果顯示(圖4B),9個GP3蛋白基因截短體重組質(zhì)粒原核表達(dá)蛋白均與His鼠單抗反應(yīng),說明重組質(zhì)粒表達(dá)正確。7株單抗中,4H9、5B2、6G7、9H5識別55PLCPTRQAAAEILE68;9F3識別69PGKSFWCRI77;6B3識別78GHDRCSESDH87;2E12識別88DELGFMVPPGLSS100。

A.GP3 蛋白截短體;B.單抗識別區(qū)域

抗原表位合成多肽ELISA鑒定結(jié)果見表4,除9F3外,6株單克隆抗體識別的抗原表位多肽與Western blot結(jié)果一致,同時豬抗PRRSV血清抗體(G2#)和55-68 aa、78-87 aa和88-100 aa多肽反應(yīng)為陽性。

表4 單克隆抗體表位ELISA鑒定

2.7 GP3蛋白抗原表位氨基酸位點對比分析

采用Jalview軟件對比分析PRRSV-2四個主要流行譜系(Lineage)毒株GP3蛋白氨基酸序列,結(jié)果見圖5,55PLCPTRQAAAEILE68和78GHDRCSESDH87保守性較差;而69PGKSFWCRI77在Lineage 5內(nèi)具有較好的保守性;88DELGFMVPPGLSS100在Lineage 3和Lineage 5之間具有較好的保守性。

2.8 GP3蛋白與不同基因亞型PRRSV的反應(yīng)性鑒定

采用針對4個不同抗原表位的單抗4H9、9F3、6B3和2E12,IFA和Western blot結(jié)果如圖6和7所示,2E12與FJ1402、BB0907、S1毒株反應(yīng)。4H9、9F3和6B3與FJ1402毒株反應(yīng),但不和BB0907、S1毒株反應(yīng)。

圖6 GP3蛋白單克隆抗體與不同亞型PRRSV的IFA反應(yīng)特性鑒定 (200×)

A.4H9;B.9F3;C.6B3;D.2E12。M.蛋白質(zhì)相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn);1.FJ1402;2.BB0907;3.S1;4.Marc-145細(xì)胞對照

3 討 論

PRRSV存在基因變異和免疫抑制,商品化疫苗免疫保護效力有限[16-18]。研究PRRSV蛋白抗原特性對安全高效疫苗研究具有重要意義。PRRSV-1和PRRSV-2 GP3蛋白氨基酸序列相似性為 54%～60%,PRRSV-2不同基因譜系毒株 GP3蛋白基因保守性較差,可變區(qū)域主要位于蛋白N端[19]。本研究采用原核表達(dá)系統(tǒng)制備獲得GP3重組蛋白,研制出7 株 GP3蛋白單抗,其中2E12單抗與 FJ1402、BB0907和S1毒株存在IFA和Western blot反應(yīng)特性,4H9、9F3和6B3只與FJ1402毒株反應(yīng),而不與BB0907和S1毒株反應(yīng),5B2和 6G7與FJ1402毒株感染細(xì)胞IFA熒光效果最佳,為PRRSV不同譜系毒株鑒別和GP3蛋白功能研究提供了有用工具。

PRRSV病毒粒子GP3蛋白含量低于 GP5、M 和N 蛋白,但具有較好免疫原性[20]。PRRSV GP3、M和N 蛋白免疫原性水平最高,且 GP3 蛋白與中和抗體產(chǎn)生有關(guān)[21]。GP3蛋白有7個糖基化位點,預(yù)測蛋白大小27～29 ku,明顯小于SDS-PAGE電泳顯示的蛋白大小(41～50 ku)[8]。本研究Western blot 結(jié)果顯示,7 株單抗與PRRSV感染細(xì)胞之間除了在40 ku左右有明顯反應(yīng)條帶外,在其它位置存在數(shù)條反應(yīng)條帶,這可能與GP3 蛋白糖基化有關(guān)。此外,由于桿狀病毒系統(tǒng)表達(dá)的GP3蛋白為第28―203 aa截短體,Western blot結(jié)果顯示該重組蛋白反應(yīng)條帶分子量明顯小于原核系統(tǒng)表達(dá)的重組GP3及PRRSV抗原。

病毒蛋白抗原表位解析對明確蛋白結(jié)構(gòu)和抗原特性有重要作用。Wang等[22]基于肽芯片技術(shù)鑒定出PRRSV GP3蛋白抗原活性區(qū)域之一位于其N端51-106 aa。張陽等[23]通過GP3 蛋白重疊多肽合成,篩選出兩個B細(xì)胞表位55PLCPTRQAAAEILEPGKS72和82CSENDHDELGFMVPPGLS99。Liang等[24]將GP3蛋白免疫顯性肽段55PLCPTRQAAAEILEPGKS72與BSA 偶聯(lián)制備免疫原,制備出GP3蛋白單抗1E5,證明其可與PRRSV高致病毒株反應(yīng),而與經(jīng)典毒株和類NADC30毒株不能反應(yīng)。Chen等[25]通過36株P(guān)RRSV-2分離株序列比對,發(fā)現(xiàn)GP3抗原表位87HDELGFMV94保守性良好,而59TRQAAAEILE68表位區(qū)域在其它低毒力毒株之間至少存在1個氨基酸差異。此外,也有報道GP3蛋白不同抗原表位存在部分重疊,如抗原表位59TRQAAAEILE68與兩個表位61QAARQRLEPGRN72和67YEPGRSLW74重疊[25]。Wang等[26]利用單克隆抗體鑒定出GP3蛋白的B細(xì)胞線性表位69PGKSFWCR76,但該表位不能被陽性血清識別,提示該表位不能在豬體內(nèi)誘導(dǎo)抗體。本研究通過GP3蛋白基因截短體構(gòu)建表達(dá),采用研制的單克隆抗體,鑒定出4個B細(xì)胞線性表位,分別為55PLCPTRQAAAEILE68、69PGKSFWCRI77、78GHDRCSESDH87和88DELGFMVPPGLSS100,與文獻(xiàn)報道類似,但4個表位存在連續(xù)性,這可能與蛋白基因截短體構(gòu)策略有關(guān),這些抗原表位可能還需要更加精準(zhǔn)定位。本研究抗原表位合成肽ELISA結(jié)果顯示,5B2、6G7、6B3和2E12的檢測結(jié)果均接近于臨界值,9F3的檢測結(jié)果為陰性,這可能與單抗結(jié)合能力和稀釋度、合成肽抗原性和包被濃度及抗原表位免疫原性弱等因素有關(guān)。本研究采用針對4個不同抗原表位的單抗4H9、9F3、6B3和2E12,采用IFA和Western blot檢測其與PRRSV 3個譜系毒株反應(yīng)特性,結(jié)果均顯示,2E12與FJ1402、BB0907和S1三個譜系毒株均可發(fā)生特異反應(yīng),4H9、9F3和6B3只與FJ1402毒株反應(yīng),而不與BB0907和S1毒株反應(yīng),與這三個譜系毒株88-100 aa、55-68 aa、69-77 aa和78-87 aa抗原表位氨基酸比對分析結(jié)果一致,但值得注意的是,9F3單抗識別的69-77 aa抗原表位在FJ1402和BB0907毒株之間沒有差異,但是9F3單抗IFA和Western blot不能檢出PRRSV BB0907和S1毒株感染細(xì)胞,提示PRRSV BB0907和S1毒株感染細(xì)胞GP3蛋白存在方式與PRRSV FJ1402的存在差異,需要進(jìn)一步研究證實。

4 結(jié) 論

本研究研制出7株P(guān)RRSV FJ1402毒株GP3單克隆抗體,鑒定出GP3蛋白4個抗原表位,分別位于55PLCPTRQAAAEILE68、69PGKSFWCRI77、78GHDRCSESDH87和88DELGFMVPPGLSS100。2E12單抗可識別FJ1402、BB0907和S1三個譜系毒株,但4H9、9F3和6B3單抗只與FJ1402毒株反應(yīng),可用于PRRSV 檢測和GP3蛋白功能研究。